Способ получения аттенуированных штаммов вируса гриппа а - кандидатов в живые гриппозные вакцины

Изобретение относится к медицинской промышленности и касается получения аттенуированных штаммов вируса гриппа А - кандидатов в живые гриппозные вакцины. Профилактическая вакцинация является наиболее эффективным средством предотвращения гриппозной инфекции. Наряду с инактивированными гриппозными вакцинами заметное распространение в последнее время получили живые гриппозные холодоадаптированные (ХА) вакцины, которые в отличие от инактивированных гриппозных вакцин, индуцируют не только нейтрализующие сывороточные IgG и IgA антитела, но также являются хорошими стимуляторами клеточного иммунного ответа. Эти вакцины применяются интраназально, обладают длительным сроком защитного действия.

Имеющийся к настоящему времени опыт применения ХА живой гриппозной вакцины в России и США показал, что этот препарат обладает наибольшей эффективностью при массовой вакцинации против гриппа, особенно детей. Следует отметить, что в отличие от инактивированных гриппозных вакцин живая вакцина способна защитить от инфекции антигенными вариантами вируса гриппа.

В настоящее время практика получения производственных реассортантов для живой гриппозной вакцины в нашей стране ограничивается устаревшей методикой реассортации родительских вариантов в куриных эмбрионах с последующей селекцией полученных реассортантов и их отбором после геномного анализа. Введение в практику получения гриппозных живых вакцин генно-инженерных подходов позволяет значительно оптимизировать отдельные этапы этого процесса. Имеется ряд патентов (US 8093033 В2, US 20090175907 A1, US 7465456, US 20020164770, WO 2003091401 A2, WO 2005062820 A2, WO 2005115448 A2, US 7744901, US 7504109), где мультиплазмидная система в культуре ткани используется для получения реассортантов - кандидатов в живые гриппозные вакцины, имеющих гены, кодирующие внутренние белки от ХА штамма А/Энн Арбор/6/60/ или ХА штамма В/Энн Арбор/1/60 и гены, кодирующие поверхностные гликопротеины от антигенно-актуальных эпидемических штаммов вируса гриппа типов А и В. В последнее время большой интерес среди исследователей вызывает генно-инженерный подход к решению данной проблемы, предполагающий прямое включение заранее известных и изученных ts-мутаций, взятых из генома штамма-донора аттенуации в геном вирулентного штамма вируса гриппа (Subbarao et al., 1993; Subbarao et al., 1995; Parkin et al., 1997; Hickman et al., 2008; Song et al., 2007; Pena et al., 2011, Solorzano and Perez, 2010; Zhou et al., 2012).

Данные литературы за последний период свидетельствуют о том, что использование технологии сайт-специфических мутаций могут значительно продвинуть разработку живых гриппозных вакцин как в медицине, так и в ветеринарии. Вместе с тем прогресс в этой области обозначил наличие серьезных нерешенных проблем. Как видно из литературы, основным источником сайт-специфических ts-мутаций во всех странах является ХА штамм А/Энн Арбор/6/60, полученный доктором Маассабом X. более полувека назад (Maassab, 1967). Три мутации из PB1-гена данного штамма (К391Е, E581G, А661Т), одна мутация из РВ2-гена (N265G) и одна из NP-гена (D34G) составляют «джентльментский набор» для модификации генома вирулентных штаммов вируса гриппа человека, животных и птиц. Однако использование этого набора мутаций не позволяет полностью аттенуировать не только пандемический штамм, но также и некоторые вирулентные сезонные варианты вируса гриппа человека. Для полной аттенуации пандемического штамма требуется 7-8 мутаций, если использовать мутации из генома штамма А/Энн Арбор/6/60 (Zhou et al., 2012). Вместе с тем в России в течение многих лет в качестве донора аттенуации для живых гриппозных вакцин используется ХА штамм А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) (Александрова, Климов, 1994). Генетические детерминанты, ответственные за аттенуацию этого штамма, сосредоточены в PB1-гене (K265N, V591I) и РВ2-гене (V478L). В другом недавно полученном отечественном ХА штамме А/Краснодар/101/35/59 (H2N2) (Гендон и др., 2013) генетические детерминанты, ответственные за аттенуацию этого штамма, локализованы в PB1-гене (I147 Т) и NS-гене.

Недостатками вышеуказанных способов является отсутствие комплексного подхода к разработке аттенуированных штаммов вируса гриппа А - кандидатов в живые гриппозные вакцины.

Для устранения вышеуказанных недостатков мы предлагаем способ получения аттенуированных штаммов вируса гриппа А - кандидатов в живые гриппозные вакцины, заключающийся в том, что включают аттенуирующие замены в консервативный участок СООН-домена РА-гена вирулентного штамма одновременно с включением сайт-специфических мутаций из РВ1- и РВ2-генов. В частном случае в качестве вирулентных штаммов используют штаммы: А/Ленинград/134/17/57 (H2N2), А/Краснодар/101/35/59 (H2N2) и А/Энн Арбор/6/60 (H2N2).

В этой связи для более эффективного использования вышеупомянутого генно-инженерного подхода планируется использовать новые альтернативные источники аттенуирующих мутаций. Во-первых, предлагается использовать включение сайт-специфических замен в консервативные участки вирусспецифических белков, в частности, белков полимеразного комплекса. В качестве примера можно привести замену F658A, включение которой в концевую часть СООН-домена РА-гена вирулентного штамма A/WSN/33 приводит к аттенуации этого штамма. Во-вторых, наряду с ts-мутациями из штамма А/Энн Арбор/6/60 можно использовать ts-мутации из генома отечественных ХА штаммов А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) и А/Краснодар/101/35/59. Значительный эффект может быть получен при использовании комбинации аттенуирующих мутаций из новых альтернативных источников.

Техническим результатом заявленного изобретения является включение сайт-специфических мутаций, не нарушающее антигенную структуру белков вирулентного штамма. Данная стратегия обеспечивает лучшую иммунную защиту, чем получение реассортантов на базе стандартного ХА донора аттенуации. Это объясняется тем, что иммунные эпитопы 8-ми или 9-ти белков, кодируемых 6-ю "внутренними" генами различаются у ХА реассортантов и антигенно-актуальных эпидемических штаммов. Прямое включение комбинаций сайт-специфических мутаций в геном вирулентного штамма позволяет изменять фенотипические характеристики этого штамма и видоизменять его в аттенуированный вариант.

Примеры осуществления способа

Пример 1

Изменение ts- и att-фенотипа вирулентного штамма A/WSN/33 путем включения специфической аттенуирующей мутации в функционально важный сайт в консервативной последовательности СООН-домена РА-гена данного штамма

Сравнительное изучение нуклеотидной последовательности РА-генов ХА штамма А/Краснодар/101/35/59 (H2N2) и исходного дикого штамма А/Краснодар/101/59 (H2N2) выявило мутацию в СООН-домене РА-гена ХА штамма: F707L. Данная мутация располагается в гидрофобном ядре СООН-домена и, вероятно, дестабилизирует его. Исходя из предположения, что между двумя аминокислотными остатками F707 и F658 существует π-π (Т-стэкинг) взаимодействие, была сконструирована сайт-специфическая замена F658A, с помощью двуступенчатой ПЦР, и эта замена была включена в консервативную последовательность СООН-домена РА-гена вирулентного штамма.

Пример поясняется таблицей 1, где столбец, отмеченный *, отражает активность репродукции вирусов гриппа при оптимальной и неразрешающей температуре инкубации, которую оценивали по результатам титрования в куриных эмбрионах, инкубированных при 34°С и 39°С и выражались в RCT (reproductive capacity at different temperatures). RCT₃₉=(lg ЭИД₅₀/0,2 мл при 34°С - lg ЭИД₅₀/0,2 мл при 39°С). Вирусы считались температурочувствительными (ts-фенотип), если RCT₃₉ был более 5.0 lg ЭИД₅₀/0,2 мл.

В таблице 1 столбец, отмеченный ** отражает определение репродукции вируса в легких мышей, для этого животных заражали интраназально в инфекционном титре 10^6.0 ЭИД₅₀/0,2 мл (по 50 мкл на мышь). Через 72 часа после заражения у мышей извлекали легкие. Инфекционный титр определяли на куриных эмбрионах и выражали в ЭИД₅₀/0,2 мл.

Как видно из таблицы 1, включение замены F658A в данную консервативную область генома штамма A/WSN/33 привела к заметному изменению ts-фенотипа штамма, который резко повысил свою температурочувствительность. Также произведенная замена снизила способность вируса размножаться в легких мышей. Можно сделать вывод, что включение замены F658A в геном вирулентного штамма A/WSN/33 способствовало его аттенуации.

Пример 2

Изучение ts-фенотипа вариантов штамма A/WSN/33 вируса гриппа, имеющих сайт-специфические мутации в генах, кодирующих белки полимеразного комплекса

Ts-маркер является важнейшим маркером аттенуации для штаммов-кандидатов в живые гриппозные вакцины. Как видно из предыдущего примера, включение аттенуирующей замены F658A в концевую часть СООН-домена РА-гена вирулентного штамма A/WSN/33 вызывает заметное, однако ограниченное изменение ts-фенотипа у данного штамма. С целью дальнейшей аттенуации вирулентного штамма производится последовательное включение в геном вирулентного штамма отдельных ts-мутаций из РВ1- и РВ2-генов ХА штаммов А/Ленинград, 134/17/57 (H2N2), А/Краснодар/101/35/59 (H2N2) и А/Энн Арбор/6/60 (H2N2). Как видно из таблицы 2, комбинированное включение дополнительных ts-мутаций из РВ1- и РВ2-генов ХА-штаммов приводит в некоторых случаях к формированию выраженного ts-фенотипа у штамма-реципиента. Так, дальнейшее последовательное включение в геном штамма A/WSN/33, содержавшего замену F658A, дополнительной замены V290L из РВ2-гена ХА-штамма А/Краснодар/101/35/59 и замен K391E, E581G и E457D из PB1-гена ХА-штамма А/Энн Арбор/6/60 приводило к появлению варианта, полностью потерявшего способность размножаться в куриных эмбрионах и при неразрешающей температуре (39°С). Пример поясняется таблицей 2, где А/АА обозначает А/Энн Арбор/6/60; А/Кр35 - А/Краснодар/101/35/59, А/Лен17 - А/Ленинград/134/17/57.

Аналогичным образом, включение аттенуирующей замены F658A в концевую часть СООН-домена РА-гена вирулентного штамма A/WSN/33 в комбинации с включением ts-мутации I147T из PB1-гена ХА штамма А/Краснодар/101/35/59 также приводит к появлению варианта с выраженным ts-фенотипом.

Пример 3

Изучение весовых характеристик мышей, инфицированных интраназально вариантами штамма A/WSN/33 вируса гриппа А, содержащие сайт-специфические мутации в генах, кодирующих белки полимеразного комплекса.

Как видно из рис. 1, мыши, инфицированные вирулентным штаммом A/WSN/33, отличались быстрой и значительной потерей веса. На 8-9 сутки после инфицирования потеря веса мышей достигала 35%. При этом часть животных погибала. У мышей, инфицированных интраназально вариантами штамма A/WSN/33, содержащими сайт-специфические мутации в генах, кодирующих белки полимеразного комплекса, наблюдались значительно меньшая потеря веса (10-15%) и полное отсутствие летальных случаев.

Пример 4

Изучение att-фенотипа вариантов штамма A/WSN/33, содержащих сайт-специфические мутации в генах, кодирующих белки полимеразного комплекса.

Белые беспородные мыши весом 10-12 гр. (самки) интраназально инфицировались вариантами штамма A/WSN/33, содержащими в геноме различные комбинации ts-мутаций в генах, кодирующих белки полимеразного комплекса. Доза заражения (0,05 мл) содержала вирус в концентрации 10^6.0ЭИД₅₀/0,2 мл. Через 72 часа после инфекции у мышей извлекали легкие. Из легких готовили 10% суспензию, которую титровали в 9-дневных куриных эмбрионах. Инфекционный титр определяли на куриных эмбрионах и выражали в ЭИД50/1 гр легких. Результаты представлены в Таблице 3.

Из таблицы 3 видно, что варианты штамма A/WSN/33, характеризовались различной степенью размножения в легких мышей. Так, включение в геном вирулентного штамма A/WSN/33 ts-мутации I147T из PB1-гена ХА штамма А/Краснодар/101/35/59 и замены F658A в концевой части СООН-домена РА-гена вирулентного штамма полностью подавляло размножение этого штамма в легких мышей. Аналогичный результат наблюдался при включении в геном вирулентного штамма A/WSN/33 ряда ts-мутаций из РВ1-гена ХА штамма А/Энн Арбор/6/60 (К391Е, E581G, E457D), ts-мутации V290L из РВ2-гена ХА штамма А/Краснодар/101/35/59 и замены F658A в РА-гене штамма-реципиента. С другой стороны, включение в геном вирулентного штамма A/WSN/33 ts-мутации V591I из PB1-гена ХА штамма А/Ленинград/134/17/57, ts-мутации V290L из РВ2-гена ХА штамма А/Краснодар/101/35/59 и замены F658A в СООН-домене РА-гена вирулентного штамма приводило только к снижению репликации данного варианта в легких мышей по сравнению с репликацией исходного вирулентного штамма A/WSN/33. Полученные данные свидетельствуют о том, что с помощью включения специально подобранных ts-мутаций различного происхождения в геном вирулентного штамма возможно получение глубоко аттенуированного варианта вируса гриппа.

Пример 5

Изучение иммуногенности вариантов штамма A/WSN/33, содержащих сайт-специфические мутации в генах, кодирующих белки полимеразного комплекса

Беспородных мышей весом 10-12 гр. (самки) под легким эфирным наркозом иммунизировали интраназально двукратно вариантами штамма A/WSN/33, содержащими различные комбинации ts-мутаций в генах, кодирующих белки полимеразного комплекса. Вводимая доза вируса содержала 10^5.5 ЭИД₅₀/0,05 мл. Вторую дозу вируса вводили на 21 день после первой иммунизации и через 10 дней после второй иммунизации у мышей брали кровь. Исследование гуморального ответа было проведено с целью оценить потенциал этих вариантов в качестве живых гриппозных вакцин. Как видно из таблицы 4, умеренный титр гуморальных антител (1:160-1:320) был обнаружен у мышей, иммунизированных вариантом штамма A/WSN/33, содержащим в геноме мутации из PB1-гена ХА штамма А/Энн Арбор/6/60 (К391Е, E581G, E457D) и замену F658A в концевой части СООН-домена РА-гена вирулентного штамма. Аналогичный титр гуморальных антител наблюдался у мышей, иммунизированных вариантом штамма A/WSN/33, содержащего в геноме ts-мутацию V591I из РВ1-гена ХА штамма А/Ленинград/134/17/57 и замену F658A в концевой части СООН-домена РА-гена вирулентного штамма. Следует отметить, что заметный уровень гуморального ответа, индуцированный вышеупомянутыми вариантами, мог быть обусловлен их недостаточной степенью аттенуации, которая позволила им размножаться не только в верхнем респираторном тракте, но также и в легких мышей. Вариант штамма A/WSN/33, содержащий в геноме ts-мутацию I147T из РВ1-гена ХА штамма А/Краснодар/101/35/59 и замену F658A в СООН-домене РА-гена вирулентного штамма, индуцировал невысокий уровень гуморального иммунного ответа (1:80).

Пример 6

Изучение защитной эффективности вариантов штамма A/WSN/33, содержащих сайт-специфические мутации в генах, кодирующих белки полимеразного комплекса

Беспородные мыши весом 10-12 гр (самки) под легким эфирным наркозом были двукратно интраназально иммунизированы вариантами штамма A/WSN/33, содержащими комбинации ts-мутаций в генах, кодирующих белки полимеразного комплекса. Вводимая доза вируса содержала 10^5,5 ЭИД₅₀/0,05 мл. Вторую иммунизацию проводили через 21 день после первой иммунизации. Через 10 дней после второй иммунизации мышей инфицировали интраназально вирулентным штаммом A/WSN/33 в дозе 10^2,5 ЭИД₅₀/0,05 мл. Через 72 часа после инфицирования у мышей извлекали легкие. Из легких готовили 10% суспензию, которую титровали в 9-дневных эмбрионах. Как видно из таблицы 5, все варианты штамма A/WSN/33, использованные для иммунизации (содержащие замену F658A в СООН-домене РА-гена и ts-мутации из PB1-гена различных ХА штаммов вируса гриппа) полностью блокировали размножение вирулентного штамма вирулентного штамма в легких мышей. Важно отметить, что вариант штамма A/WSN/33, содержащий в геноме ts-мутацию I147T из PB1-гена ХА-штамма А/Краснодар/101/35/59 и замену F658A в РА-гене, индуцирующий невысокий гуморальный иммунный ответ (1:80), тем не менее обеспечивал полную защитную эффективность при иммунизации, что можно объяснить значительной активизацией в данном случае клеточного иммунитета.

Пример 7

Изучение генетической стабильности вариантов штамма A/WSN/33, содержащих сайт-специфические мутации в генах, кодирующих белки полимеразного комплекса

Живые вирусные вакцины должны обладать значительным запасом генетической стабильности. В этой связи у двух вариантов штамма A/WSN/33, показавших удовлетворительные фенотипические характеристики, была исследована сохранность ts-мутаций в РА- и РВ1-генах и ts-фенотип после 5-ти последовательных пассажей в культуре клеток MDCK при 37°С. Вариант штамма A/WSN/33, содержащий в геноме мутации из PB1-гена ХА штамма А/Энн Арбор/6/60 (K391E, E581G, E457D) и замену F658A в РА-гене, а также другой вариант, содержащий в геноме мутацию из PB1-гена ХА штамма А/Краснодар/101/35/59 I147T и замену F658A в РА-гене были пропассированы в культуре клеток MDCK и после 5-ти пассажей проанализированы на наличие аттенуирующих мутаций в PB1-гене и РА-гене. Секвенирование данных генов обнаружило сохранность аттенуирующих мутаций у исследованных вариантов (не показано). На следующей стадии работы у пропассированных вариантов был исследован ts-фенотип, который не претерпел никаких изменений. Наличие неизмененного ts-фенотипа косвенно свидетельствует в пользу отсутствия возникших супрессорных мутаций в геноме пропассированных вариантов, что позволяет сделать вывод об их генетической стабильности.

Общий вывод

Модификация генома вирулентного штамма вируса гриппа путем включения специфических аттенуирующих мутаций в функционально важные сайты в консервативных последовательностях генов вирулентного штамма в сочетании с включением в геном вирулентного штамма ts-мутаций из ХА штаммов вируса гриппа позволяет получать аттенуированные штаммы вируса гриппа А - кандидаты в живые гриппозные вакцины.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Алексадрова Г.И., Климов А.И. Живая вакцина против гриппа. «Наука» Санкт-Петербург. 1994. 234 с.

Гендон Ю.З., Маркушин С.Г., Цфасман Т.М. и др. Новые холодоадаптированные штаммы-доноры аттенуации для живых вакцин против гриппа. Вопр. вирусол. 2013. Т. 58. С. 11-17.

Hickman D., Hossain J., Song H. et al. An avian live attenuated master backbone for potential use in epidemic and pandemic influenza vaccines. J Gen Virol. 2008. V. 89. P. 2682-2690.

Maassab H. Adaptation and growth characteristics of influenza virus at 25 degrees C. Nature. 1967. V. 213. P. 612-614.

Parkin N., Chiu P., Coelingh K. Genetically engineering live attenuated influenza A virus vaccine candidates. J Virol. 1997. V. 71(4). P. 2772-2778.

Pena L., Vincent A., Ye J. et al. Modifications in the polymerase genes of a swine-like triple-reassortant influenza virus to generate live attenuated vaccines against 2009 pandemic H1N1 viruses. J Virol. 2011. V. 85(1). P. 456-469.

Solorzano A., Li Yo., Perez D.R. Alternative live-attenuated influenza vaccines based on modification in the polymerase genes protect against epidemic and pandemic flu. J Virol. 2010. V. 84(9). P. 4587-4596.

Song H., Nieto G., Perez D. A new generation of modified live-attenuated avian influenza viruses using a two-strategy combination as potential vaccine candidates. J Virol. 2007. V. 81 (17). P. 9238-9248.

Subbarao E.K., Kawaoka Y, Murphy B.R. Rescue of an influenza A virus wild-type 7227PB2 gene and a mutant derivative bearing a site-specific temperature-sensitive and attenuating mutation. J Virol. 1993. V. 67(12). P. 7223-7227.

Subbarao K., Park E., Lawson C. et al. Sequential addition temperature-sensitive missense mutations into the PB2 gene of influenza A transfectant viruses can effect an increase in temperature sensitivity and attenuation and permits the rational design of a genetically engineered live influenza A virus vaccine. J Virol. 1995. V. 69(10). P. 5969-5977. Zhou В., Li Yo., Speer S. et al. Engineering temperature sensitive live attenuated influenza vaccines from emerging viruses. Vaccine. 2012. V. 30(24). P. 3691-3702.

US 6951754. DNA transfection system for the generation of infectious influenza virus

US 7465456. Multi plasmid system for the production of influenza virus

US 20020164770. DNA transfection system for the generation of infectious influenza virus.

WO 2003091401 A2. Multi plasmid system for the production of influenza virus.

WO 2005062820 A2. Multi plasmid system for the production of influenza virus.

WO 2005115448 A2. Multi plasmid system for the production of influenza virus.

US 7744901 B2. Influenza hemagglutinin and neuraminidase variants.

US 7504109. Influenza hemagglutinin and neuraminidase variants.