Результат интеллектуальной деятельности: СУЛЬФАТЫ 2-АРИЛ-4-ДИАЛКИЛАМИНОЭТИЛ-3-ФЕНИЛПИРРОЛО[1,2-a]-БЕНЗИМИДАЗОЛОВ, ОБЛАДАЮЩИЕ АНТИОКСИДАНТНЫМИ И АНТИРАДИКАЛЬНЫМИ СВОЙСТВАМИ

Изобретение относится к новым химическим соединениям ряда пирроло-[1,2-а]бензимидазола, а именно к сульфатам 2-арил-4-диалкиламиноэтил-3-фенилпирроло[1,2-а]бензимидазолов общей формулы I:

где NR₂ принимает значения морфолино или диэтиламино, а Ar - 4-метоксифенил или 4-хлорфенил, которые обладают антиоксидантными и антирадикальными свойствами и могут найти применение в медицине.

Свободнорадикальное окисление играет важную роль как в нормальной жизнедеятельности клеток, так и в развитии патологических процессов. Лечение антиоксидантными средствами широко используется при патологии сердечно-сосудистой системы (А.П.Голиков, С.А.Бойцов и др. Свободнорадикальное окисление и сердечно-сосудистая патология: коррекция антиоксидантами. Лечащий врач: Журнал для практикующего врача, 2003, №4, с.70-74; О.Н.Ковалева, А.Н.Беловол, М.В.Заика. Роль оксидативного стресса в кардиоваскулярной патологии. Журнал АМН України, 2005, т.11, №4, с.660-670), неврологических заболеваниях (Ю.А.Зозуля, В.А.Барабой, Д.А.Сутковой. Свободнорадикальное окисление и антиоксидантная защита при патологии головного мозга. М.: Знание-М, 2000, 344 с.; А.Н.Дзюба, Ю.Н.Сорокин. Про- и антиоксидантные механизмы при рассеянном склерозе. Украиїнський медичний часопис., 2004, №5 (43), с.30-35), сахарном диабете (М.И.Балаболкин, Е.М.Клебанова, В.М.Креминская. Лечение сахарного диабета и его осложнений. М.: Медицина, 2005, 512 с.; Т.П.Бардымова, Л.И.Колесникова, М.И.Долгих. Перекисное окисление липидов, антиоксидантная система у больных сахарным диабетом и факторы внешней среды. Бюллетень ВСНЦ СО РАМН, 2006, №1 (47), с.116-119), панкреатите (В.Г.Артюхов, Ю.Н.Чернов и др. Влияние кваматела на свойства нейтрофилов, показатели пероксидного окисления липидов и антиоксидантной защиты в крови больных язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки и панкреатитом. Экспериментальная и клиническая фармакология, 2003, т.66, №6, с.59-63), облучении (Ю.Н.Шанин, В.Ю.Шанин, Е.В.Зиновьев. Антиоксидантная терапия в клинической практике (теоретическое обоснование и стратегия проведения). СПб.: ЭЛБИ-СПб, 2003, 128 с.) и т.д.

Антиоксиданты по своему происхождению разделяются на две основные группы: природные и синтетические (Н.В.Верещагин, М.М.Танашян и др. Антиоксиданты в ангионеврологии. АтмосферА. Нервные болезни, 2004, №3, с.8-12). Наиболее часто применяемыми природными антиоксидантами являются α-токоферол (витамин E) и аскорбиновая кислота (витамин C) (А.И.Федин, Оксидантный стресс и применение антиоксидантов в неврологии. АтмосферА. Нервные болезни, 2002, №1, с.15-18). α-Токоферол в организме выполняет несколько функций, дающих в совокупности антиоксидантный эффект (В.В.Ляхович, В.А.Вавилин и др. Активированные кислородные метаболиты в монооксидазных реакциях. Бюллетень СО РАМН, 2005, №4 (118), с.7-12). Однако действие жирорастворимого витамина несколько отсрочено по времени, что обусловлено необходимостью его встраивания в структуру клеточной мембраны (Н.В.Верещагин и др., 2004). Кроме того, применяемый в клинической практике α-токоферол допустимо вводить только внутрь или внутримышечно (но не внутривенно). Данные обстоятельства существенно ограничивают возможности применения препарата в практике интенсивной терапии.

Водорастворимый антиоксидант аскорбиновая кислота снижает уровень супероксиданион-радикала, синглетного кислорода, гидроксильного, перекисного и некоторых органических радикалов, гипогалоидов, а также восстанавливает окисленные формы витамина Е и глутатиона, возвращая им антиоксидантные свойства (Ю.Н.Шанин и др., 2003). Однако в ряде случаев (применение высоких доз, недостаток α-токоферола и глутатиона) препарат способен индуцировать генерацию активных форм кислорода (АФК) и способствует протеканию свободнорадикальных реакций (М.И.Балаболкин и др., 2005).

В настоящее время в клинической практике широко применяются синтетические антиоксидантные препараты (А.И.Федин, 2002). Один из них - дибунол (ионол, 2,6-ди-трет-бутил-4-метилфенол) - жирорастворимый препарат, относящийся к классу экранированных фенолов. По своим антиоксидантным свойствам дибунол сходен с α-токоферолом, хотя антирадикальная активность препарата ниже, чем у витамина E [Шанин Ю.Н. и др., 2003]. Дибунол сначала был предложен для местного применения при лечении рака и папилломатоза мочевого пузыря. В настоящее время его применяют также при циститах, ожогах, отморожениях, длительно незаживающих трофических и лучевых язвах, вяло гранулирующих ранах.

Широкое применение в настоящее время нашел и синтетический водорастворимый антиоксидант мексидол (2-этил-6-метил-3-оксипиридина сукцинат). Он является ингибитором свободнорадикальных процессов, повышает активность антиоксидантных ферментов, улучшает энергетический обмен в клетке и защищает структуру мембраны (В.А.Крайнева, Особенности и механизм нейропротекторного действия препарата мексидол при геморрагическом инсульте в эксперименте. Бюл. эксперим. биологии и медицины, 2006, Приложение 1, с.40-44). Благодаря своему механизму действия, мексидол является эффективным средством противоишемической защиты мозга (Воронина Т.А. Отечественный препарат нового поколения Мексидол (основные эффекты, механизм действия, применение), М., 2005, 20 с). Однако, в результате экспериментальные исследований установлено, что антиоксидантная активность препарата все же является невысокой (Косолапов, В.А. Антиоксидантные средства: стратегия отбора, перспективы применения: Дисс… д-ра мед. наук, Волгоград, 2005. - 303 с).

Таким образом, можно предположить, что антигипоксическое и противоишемическое действия мексидола обусловлены не столько его антиоксидантными свойствами, сколько входящим в его состав сукцинатом, который в условиях гипоксии и ишемии, поступая во внутриклеточное пространство, способен окисляться дыхательной цепью.

Следует отметить, что, несмотря на наличие широкого спектра препаратов для подавления реакций свободнорадикального окисления, арсенал применяемых в современной медицине антиоксидантных средств довольно ограничен. Кроме того, описаны проблемы, связанные с их использованием, в частности, невозможность назначения при оказании неотложной помощи (витамин E), узкий спектр показаний (дибунол), недостаточно высокая антиоксидантная активность (мексидол) и т.д.

В связи с этим поиск новых соединений, обладающих антиоксидантными свойствами, на основе которых могут быть созданы лекарственные препараты для лечения заболеваний, сопровождающихся избыточной активацией процессов пероксидации, является весьма актуальным.

В ряду производных трициклических бензимидазольных систем с мостиковым атомом азота наибольшей π-избыточностью, а следовательно, и способностью ингибировать свободнорадикальные процессы обладают производные пирроло[1,2-а]бензимидазола (В.А.Анисимова, Н.И.Авдюнина, А.Ф.Пожарский и др., Химия гетероцикл. соединений, 1980, №4, с.528-537; А.Ф.Пожарский. Теоретические основы химии гетероцикло. М., Химия, 1985, с.528-537).

Учитывая вышесказанное, была проведена работа по выявлению антиоксидантных и антирадикальных свойств у новых соединений, относящихся к производным пирроло[1,2-а]бензимидазола.

Наиболее близкими по структуре к заявляемым соединениям являются дигидрохлориды 2-(4-метоксифенил)-4-морфолиноэтил-3-фенил-(IIа) и 4-(2-диэтиламиноэтил)-2-(4-хлорфенил)-3-фенилпирроло[1,2-а]бензимидазолов (IIб), проявляющие антиоксидантную активность (В.А.Анисимова, А.А.Спасов и др. Синтез и фармакологическая активность солей 4-(2-диалкиламиноэтил)пирроло[1,2-а]бензимидазолов. Хим.-фарм. журнал, 1996, т.30. №1, с.22-25). Однако их активность все же недостаточно высока.

Задачей изобретения является выявление антиоксидантных и антирадикальных свойств у новых производных пирроло[1,2-а]бензимидазола.

Техническим результатом изобретения являются новые соединения в ряду пирроло[1,2-а]бензимидазолов, которые обладают высокой антиоксидантной активностью, превышающей активность препаратов, применяемых в медицинской практике (ионол, мексидол) и известных соединений вышеуказанного ряда IIа,б, а также проявляют антирадикальные свойства.

Технический результат достигается сульфатами 2-арил-4-диалкиламино-этил-3-фенилпирроло[1,2-а]бензимидазолов общей формулы I.

Синтез соединений I заключается в циклизации в щелочной среде бромидов 2-бензил-3-ароилметил-1-(2-диалкиламиноэтил)бензимидазолия, полученных в результате действия 4-замещенных фенацилбромидов на 2-бензил-1-диалкиламиноэтилбензимидазола в среде ацетона или ацетонитрила, и последующем переводе полученных трициклических оснований в сульфаты с помощью ацетонового раствора серной кислоты:

где NR₂ и Ar принимают вышеуказанные значения.

Ниже приведены примеры методик синтеза и исследований биологической активности предлагаемых соединений.

Пример 1. Сульфат 2-(4-метоксифенил-4-(2-морфолиноэтил)-3-фенил-пирроло[1,2-а]бензимидазола (Iа). Раствор 3,21 г (10 ммоль) 2-бензил-1-(2-морфолиноэтил)бензимидазола (В.А.Анисимова и др. Хим.-фарм. журнал, 1996, т.30, №1, с.22-26) и 2,3 г (10 ммоль) 4-метоксифенацилбромида (В.А.Анисимова и др. Хим.-фарм. журнал, 2005, Т.39, №9, С.26-32) в 30 мл ацетона или ацетонитрила кипятят 5-10 мин и оставляют на сутки при комнатной температуре. Выпавший белоснежный осадок бромида 2-бензил-3-(4-метоксифенацил)-1-(2-морфолиноэтил)бензимидазолия отфильтровывают, промывают горячим ацетоном. Выход 4,6 г (88,6%), т.пл. 209-210°C (разл., из EtOH). Найдено, %: C 63,2; H 5,9; Br 14,2; N 7,8. C₂₈H₃₂BrN₃O₃. Вычислено, %: C 63,3; H 5,9; Br 14,5; N 7,6. ИК спектр (вазелин, масло), ν, см^-1: 1695 (C=O).

Кипятят в среде инертного газа 2,2 г (4 ммоль) полученного бромида и 0,7 г (8,5 ммоль) NaHCO₃ в 50 мл воды до полного протекания реакции (контроль - ТСХ). После охлаждения без доступа воздуха выделившееся в результате реакции светло-желтое масло застывает. Его отделяют и перекристаллизовывают из изооктана, получая основание - 2-(4-метоксифенил)-4-(2-морфолиноэтил)-3-фенилпирроло[1,2-а]бензимидазол в виде слегка бежеватых сильно электризующихся кристаллов с т.пл. 63-64°C. Выход 1,73 г (96%). Найдено, %: C 77,0; H 6,6; N 9,6. C₂₉H₂₉N₃O₂. Вычислено, %: C 77,1; H 6,5; N 9,5. ИК спектр (вазелин, масло), ν, см^-1: 1600, 1605, 1620 (C=C, C=N).

Сульфат Iа. Раствор 4 ммоль полученного трициклического основания в 50 мл ацетона подкисляют раствором конц. H₂SO₄ в ацетоне до pH 1-2. Выпавший осадок соли отфильтровывают, тщательно промывают на фильтре ацетоном (3×10 мл), перекристаллизовывают из ~80%-ного водного этилового спирта и сушат в вакуум-эксикаторе. Слегка зеленоватые кристаллы с т.пл. 213-215°C (разл., при внесении капилляра в нагретый до 195°C прибор для определения т.пл.). Выход 2,0 г (91%). Найдено, %: C 63,3; H 5,7; N 7,8; S 5,7. C₂₉H₂₉N₃O₂·H₂SO₄. Вычислено, %: C 63,4; H 5,7; N 7,6; S 5,8.

Пример 2. Сульфат 4-(2-диэтиламиноэтил)-3-фенил-2-(4-хлорфенил)-пирроло[1,2-а]бензимидазола (Iб). Смесь 3,1 г (10 ммоль) 2-бензил-1-(2-диэтиламиноэтил)бензимидазола (В.А.Анисимова и др. Хим.-фарм. журнал, 1996, т.30, №1, с.22-26) и 2,34 г (10 ммоль) 4-хлорацетофенона в 20 мл ацетона кипятят 2 ч. Выпавший обильный осадок бромида 2-бензил-1-(2-диэтиламиноэтил)-3-(4-хлорфенацил)бензимидазолия отфильтровывают после охлаждения, промывают ацетоном. Выход 4,75 г (87,8%), т.пл. 167-168°C (разл., из ЕtOН с эфиром). Найдено, %: C 62,0; H 5,9; N 8,0.

C₂₈H₃₁BrClN₃O. Вычислено, %: C 62,2; H 5,8; N 7,8. ИК спектр (вазелин, масло), ν, см^-1: 1700 (C=O).

Смесь 2,72 г (5 ммоль) полученного бромида, 0,84 г (10 ммоль) гидрокарбоната натрия и 50 мл воды кипятят в инертной атмосфере до полного протекания реакции (контроль - ТСХ, 1-1,5 ч), при этом осадок соли постепенно переходит в светло-желтое масло. По окончании реакции колбу закрывают, чтобы исключить доступ воздуха в нее и оставляют смесь охлаждаться. На следующий день затвердевшее масло отделяют и, тщательно растерев, сушат в эксикаторе над P₂O₅. После перекристаллизации из бензола получают 4-(2-диэтиламиноэтил)-3-фенил-2-(4-хлорфенил)пирроло[1,2-а]бензимидазол в виде белоснежных или слегка зеленоватых кристаллов с т.пл. 82-84°C. Выход 2,05 г (93%). Найдено, %: C 76,0; H 6,2; Cl 8,2; N 9,8. C₂₈H₂₈ClN₃. Вычислено, %: C 76,1; H 6,4; Cl 8,0; N 9,5. ИК спектр (вазелин. масло), ν, см^-1: 1595, 1605, 1618 (C=C, C=N).

Сульфат Iб. Получен аналогично описанному в примере 1 сульфату Iа с выходом 89,5%. Т.пл. 231-233°C (разд., при внесении капилляра в нагретый до 210°С прибор для определения т.пл.). Найдено, %: C 62,4; H 5,7; Cl 6,5; N 7,9; S 5,8. C₂₈H₂₈ClN₃·H₂SO₄. Вычислено, %: C 62,3; H 5,6; Cl 6,6; N 7,8; S 6,6.

Пример 3. Исследование антиоксидантной активности соединений Iа,б. Антиоксидантную активность веществ изучали в экспериментах in vitro на модели аскорбат-зависимого перекисного окисления липидов (ПОЛ) гомогенатов печени (В.З.Ланкин и др. Изучение аскорбат-зависимого перекисного окисления липидов тканей при помощи теста с 2-тиобарбитуровой кислотой. Труды московского общества испытателей природы. М., 1975, т.52, с.73-78). Соединения исследовали в диапазоне концентраций 0,1-100 мкмоль/л. Величину ингибирующей концентрации ИК₅₀ рассчитывали методом регрессионных уравнений в программе Statistica 6.0 (StatSoft, США).

В качестве субстрата использовали 4% гомогенат печени крыс. Реакцию инициировали 50 ммоль/л аскорбиновой кислоты. О скорости ПОЛ судили по накоплению малонового диальдегида (вторичного продукта ПОЛ) в реакции с ТБК. Оптическую плотность окрашенного продукта измеряли при длине волны 532 нм на спектрофотометре PD-303 UV (APEL, Япония) в кювете с длиной оптического пути 1 см.

Активность соединений выражали в процентах и рассчитывали по формуле:

% ингибирования=100-(E_on/E_контр×100),

где E_on - оптическая плотность пробы с веществом,

Е_контр - оптическая плотность пробы, не содержащей вещества.

Препаратами сравнения служили антиоксиданты дибунол (Merck, Германия) и мексидол (НИИ фармакологии РАМН, Россия), а также гидрохлориды IIа,б. Все вещества, кроме дибунола применяли в виде водных растворов; для дибунола готовили спиртовой раствор.

В результате исследования было установлено, что сульфаты Iа,б в концентрации 1 мкмоль/л ингибируют реакцию аскорбат-зависимого ПОЛ на 94,4 и 93,8% соответственно. Соединение IIб обладает менее выраженными антиоксидантными свойствами (60,4%), в то время как дигидрохлорид IIб оказался низкоактивным (9,6%). Дибунол и мексидол в той же концентрации проявили активность на уровне 38,2 и 1,5%, соответственно.

По величине ИК₅₀ исследуемые соединения и вещества сравнения можно расположить в следующей последовательности по убыванию активности: Iа (0,32 мкмоль/л)=Iб (0,32 мкмоль/л)>IIб (1,20 мкмоль/л)>Дибунол (3,16 мкмоль/л)>Мексидол (480 мкмоль/л).

Пример 4. Изучение антирадикальных свойств соединений Iа,б.

Антирадикальные свойства исследовали на модели (G.Glavind Antioxidants in animal tissue // Acta Chemica Scand. - 1963. - Vol.17, №6. - P.1635-1640) взаимодействия со стабильным свободным радикалом 2,2-дифенил-1-пикрилгидразилом (ДФПГ•). Использовали спиртовой раствор ДФПГ• в концентрации 1×10^-5 моль/л при добавлении к нему изучаемых антиоксидантных веществ. Антирадикальную активность соединений регистрировали по падению оптической плотности с помощью спектрофотометра PD-303 UV (APEL, Япония) при длине волны 517 нм в кварцевых кюветах с длиной оптического пути 1 см.

Активность веществ выражали в процентах и рассчитывали по формуле:

% ингибирования=100-(ΔD₁/ΔD₂×100),

где ΔD₁ - изменение оптической плотности при добавлении вещества в исследуемой концентрации,

ΔD₂ - изменение оптической плотности при добавлении пирогаллола в избытке.

Измерения проводили через 5 минут после начала реакции. В ходе изучения антирадикальных свойств соединений было выявлено, что в концентрации 1 мкмоль/л сульфаты Iа и Iб не проявляют активности в отношении стабильного свободного радикала ДФПГ•, в то время как дибунол (3,3%) и мексидол (4,3%) являются низкоактивными. Однако повышение концентрации исследуемых соединений до 100 мкмоль/л сопровождается полным обесцвечиванием раствора ДФПГ•. Среди веществ сравнения в тех же условиях наиболее эффективным оказался дибунол (% ингибирования реакции составил 83,9).

По величине ИК₅₀ изучаемые соединения и препараты сравнения можно расположить в следующей последовательности по убыванию активности: Iб (7,28 мкмоль/л)>Iа (9,83 мкмоль/л)>Дибунол (15,56 мкмоль/л)>Мексидол (20,94 мкмоль/л).

Пример 5. Определение острой токсичности и условного терапевтического индекса исследуемых соединений.

Острую токсичность соединений определяли на 70 белых неинбредных мышах-самцах массой 18-26 г, содержащихся в условиях вивария (температура 22-24°C, относительная влажность воздуха 40-50%) с естественным световым режимом на стандартной диете (ГОСТ Р 50258-92). На момент проведения исследований животные были здоровыми, без изменений поведения, аппетита, режима сна и бодрствования.

При изучении острой токсичности вещества вводили однократно внутрибрюшинно. За животными наблюдали в течение двух недель от момента введения. Для расчета величины токсикологического показателя LD₅₀ использовали метод Личфилда-Вилкоксона в соответствии с требованиями и инструкциями Федеральной службы по надзору в сфере здравоохранения и социального развития (Методические указания по изучению общетоксического действия фармакологических веществ. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ, под общ. ред. Р.У.Хабриева, 2-е изд., М., Медицина, 2005, 832 с.).

Условный терапевтический индекс рассчитывали как отношение показателя LD₅₀ к величине ИК₅₀.

При изучении острой токсичности характерными признаками отравления соединениями Iа, б были ограничение подвижности, частое поверхностное дыхание, снижение болевой и тактильной чувствительности. Непосредственной гибели животных предшествовали явления глубокой седации, угнетение дыхания, боковое положение с редкими клоническими судорогами.

Исходя из полученных величин LD₅₀, исследуемые сульфаты Iа, б и вещества сравнения можно расположить в следующей последовательности по убыванию токсичности: Iб (261,9 мг/кг)>IIб (350 мг/кг)>IIа (438 мг/кг)>Мексидол (475 мг/кг)>Дибунол (490 мг/кг)>Iа (792 мг/кг).

Таким образом, соединение Iа по показателю острой токсичности LD₅₀ превосходит соединение Iб и все вещества сравнения.

В соответствии с классификацией токсичности соединений (И.В.Березовская. Классификация химических веществ по параметрам острой токсичности при парентеральных способах введения. Хим.-фарм. журнал, 2003, т.37, №3, с.32-34) изучаемые производные пирроло[1,2-а]бензимидазола можно отнести к классу умеренно токсичных (3 класс).

Результаты расчета условного терапевтического индекса антиоксидантной активности веществ Iа и Iб представлены в табл.1.

Из табл.1 видно, что по условному терапевтическому индексу на модели аскорбат-зависимого ПОЛ соединения Iа (4517,5) и Iб (1534,9) значительно превосходят дигидрохлорид IIб (566,5), а также препараты сравнения дибунол (701,0) и мексидол (3,9).

Результаты расчета условного терапевтического индекса антирадикальной активности веществ Iа, б представлены в табл.2.

Из табл.2 видно, что по условному терапевтическому индексу антирадикальной активности, полученной на модели взаимодействия со стабильным свободным радикалом ДФПГ•, соединение Iа (146,6) превосходит дибунол (142,5) и мексидол (89,0), а вещество Iб (66,7) уступает препаратам сравнения.

Таким образом, сульфаты 2-арил-4-диалкиламиноэтил-3-фенил-пирроло[1,2-a]бензимидазолов Iа, б превосходят по условному терапевтическому индексу антиоксидантной активности дигидрохлориды тех же оснований, а также препараты сравнения дибунол и мексидол. По условному терапевтическому индексу антирадикальной активности соединение Iа превосходит все препараты сравнения. Учитывая вышесказанное, исследуемые соединения, в первую очередь вещество Iа, могут быть рекомендованы к дальнейшему детальному изучению антиоксидантных и антирадикальных свойств на моделях in vitro и in vivo.