ПРИМЕНЕНИЕ ДЕЛЬТА-СОН ИНДУЦИРУЮЩЕГО ПЕПТИДА ДЛЯ ГЕПАТОПРОТЕКТОРНОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ ПРИ ХРОНИЧЕСКОМ ЭМОЦИОНАЛЬНО-БОЛЕВОМ СТРЕССЕ

Изобретение относится к медицине, а именно к гепатологии, физиологии, патофизиологии, и может быть использовано для гепатопротекторного воздействия в условиях хронического эмоционально-болевого стресса.

Известно, что печень является одним из главных органов-мишеней при стресс-реакции (Петрова, В.А. Ограничение стрессорной активации адренергической и гипофизарно-адреналовой систем с помощью альфа-токоферола / В.А. Петрова, В.В. Малышев, Б.Н. Манухин, Ф.З. Меерсон. // Вопр. мед. химии. 1985. - №6. - С.115-118.; Васильцов М.К. Динамика морфофункциональных изменений в фибробластах очага воспаления // Арх. анат. гистол. и эмбриол. 1977. - №2. С.80-83.) и стрессорные повреждения приводят к развитию в ней различных форм патологии. Учитывая важнейшую роль печени в поддержании гомеостаза, данное обстоятельство может отрицательно сказаться и на состоянии других органов и систем.

Как правило, функциональная недостаточность печени сопровождается нарушением обменных процессов, среди которых особое значение имеет изменение метаболизма липидов и структурной организации мембран гепатоцитов (Иванов Ю.В., Матюшин И.А., Мишнев О.Д. и др. Действие мексидола при токсическом поражении печени. Вестник новых медицинских технологий: периодический теоретический и научно-практический журнал. - 2003, №3. - С.68-70). Несмотря на многообразие этиологических факторов, на субклеточном уровне выявляются однотипные механизмы деструкции, среди которых особую роль играют процессы свободно-радикального окисления (СРО) с участием активных форм кислорода (АФК) и активных кислородных метаболитов (АКМ), утилизация которых осуществляется антиоксидантной системой организма.

Установлено, что при различных видах стресса происходит активация перекисного окисления липидов (ПОЛ) в печени (Нестеров Ю.В., Чумакова А.С., Гурченко Н.В. Влияние стресс-индуцированных воздействий разной модальности и антиоксиданта на свободнорадикальные процессы в легких и печени белых крыс // Естественные науки. - 2010. - №3. - С.122-126.; Чумакова А.С., Теплый Д.Л., Нестерова Ю.В. Изменение свободнорадикальных процессов в различных органах крыс разного возраста при остром стрессе // Биологические исследования. - 2009. - №4. - С.34-37).

Это дает основание полагать, что фармакологические вещества, ингибирующие процессы СРО, должны обладать гепатозащитными свойствами (Иванов Ю.В., Матюшин И.А., Мишнев О.Д. и др. Действие мексидола при токсическом поражении печени // Вестник новых медицинских технологий: периодический теоретический и научно-практический журнал. - 2003. - №3. - С.68-70).

Кроме того, известно, что основную роль в поддержании белковго состава плазмы крови играет печень (Радченко В.Г., Шабров А.В., Зиновьева Е.Н. Основы клинической гепатологии. Заболевания печени и билиарной системы. - СПб.: «Издательство «Диалект»; М.: «Издательство БИНОМ», 2005. - 864 с.: ил.), поэтому низкие показатели общего белка в сыворотке крови свидетельствуют о нарушениях ее функционального состояния (Ройтберг Г.Е., Струтынский А.В. Лабораторная и инструментальная диагностика заболеваний внутренних органов. - М.: Медицина. 2007).

Гепатопротекторы - лекарственные средства, улучшающие метаболические процессы в печени, повышающие ее устойчивость к патогенным воздействиям, а также способствующие восстановлению ее функций при различных повреждениях (Каркищенко Н.Н. Клиническая и экологическая фармакология в терминах и понятиях. - М.: IMP-Медицина, 1995. - 304 с.).

Дельта-сон индуцирующей пептид (ДСИП) является эндогенным пептидом с уникальной аминокислотной последовательностью (Trp-Ala-Gly-Gly-Asp-Ala-Ser-Gly-Glu) молекулярной массой 848.98 Да.

Известно, что ДСИП выступает в роли программинг-фактора, в связи с чем все описанные в литературе эффекты данного пептида проявляются особенно явно при экстремальных воздействиях и патологических состояниях организма (Михалева И.И., Свиряев В.И. // Тез. докл. IV Всесоюз. симпоз. «Химия белков и пептидов». Рига, 1983. С.328). Так, после введения ДСИП у мышей при 6-часовой иммобилизации антистрессорный эффект пептида выражался в активации Т-клеток-киллеров (Меерсон Ф.З. // Патогенез и предупреждение стрессорных и ишемических повреждений сердца. М.: Медицина, 1984. С.290). Пептид, будучи иммуностимулятором, снижает инволюцию тимуса при стрессорых воздействиях, влияет на репарацию (Салиева P.M., Яновский К., Ратсан Р., Трофимова Я.П. // Журн. высш. нерв. деятельности им. Н.П. Павлова. 1991. Т.41. №3. С.558), обладает антиметастатическим эффектом (Шмалько В.П., Михалева И.И. // Эксперим. онкология. 1988. Т.10. №2. С.57) и цитопротективной активностью (Балицкий К.П., Шмалько Ю.П. // Эксперим. онкология. 1983. Т.5. №1. С.7). Пептид, восполняя возникающий в организме дефицит эндогенных нейропротекторов, снимает отрицательное действие перенесенного эмоционального стресса и предотвращает негативные последствия при развитии последующей церебральной ишемии. Это способствует развитию компенсаторного коллатерального кровообращения в области ишемии в острейшем периоде и нормализует электрическую активность головного мозга за счет увеличения среднего показателя обеспеченности кровоснабжения ЭЭГ-активности. (Коплик Е.В., Умрюхин П.Е., Конорова И.Л., Терехина О.Л., Михалева И.И., Ганнушкина И.В., Судаков К.В. Дельта-сон индуцирующий пептид и препарат дельтаран: потенциальные пути антистрессорной протекции // Журнал невр. и психиатрии. 2007. №12. С.50-54).

ДСИП способен оказывать анальгетическое воздействие, усиливая связывание мет-энкефалина с опиатными рецепторами (Schoenenberger G.A. // Eur. Neurol. 1984. V.23. P.321-345; Yehuda S., Carasso R. // Int. J. Neurosc. 1988. V.38. P.345-353; Eds. Inoue S., Kruger J., Endogenous Sleep Factors. The Hague: SPB Acad. Publ., 1990; Прудченко И.А., Михалева И.И. // Успехи совр. биологии. 1994. Т.114. С.727-740; Лысенко А.В., Менджерицкий A.M. // Успехи совр. биологии. 1995. Т.115. С.729-739; Стрекалова Т.В. // Нейрохимия. 1998. Т.15. №3. С.227-239; Pollard B.J., Pomfrett C.J.D. // Eur. J. Aneasthesiol. 2001. V.18. P.419-422), обладает противосудорожной активностью (Прудченко И.А., Сташевская Л.В., Михалева И.И., Иванов В.Т. // Биоорган. химия. 1993. Т.19. С.43-55; Stanojiovic О., Zivanovic D., Mirkovic S., Mikhaleva I. // Pharmacol. Biochem. Behav. 2004. V.77, №2. P.227-234; Stanojiovic O.P., Zivanovic D.P., Suzic V.T. // Pharmacol. Res. 2002. V.45. №3. P.241-247).

Тем не менее, применения ДСИП для гепатопротекторго воздействия в условиях хронического эмоционально-болевого стресса не известно.

Техническим результатом изобретения является применение по новому назначению дельта-сон индуцирующего пептида, имеющего формулу (NH₂)Trp-Ala-Gly-Gly-Asp-Ala-Ser-Gly-Glu(COOH) для гепатопротекторного воздействия при хроническом эмоционально-болевом стрессе.

Технический результат изобретения достигается путем применения дельта-сон индуцирующего пептида, имеющего формулу Trp-Ala-Gly-Gly-Asp-Ala-Ser-Gly-Glu для гепатопротекторного воздействия при хроническом эмоционально-болевом стрессе.

В настоящее время, поскольку точно известна химическая формула этого пептида, он может быть синтезирован в любой лаборатории синтеза пептидов либо закуплен у фирм, занимающихся поставкой биологически активных соединений (Sigma, ICN, Merk, Bachim и др.). Нами был использован препарат, синтезированный в НИИ химии Санкт-Петербургского государственного университета. Растворенный в изотоническом растворе хлорида натрия дельта-сон индуцирующий пептид вводят экспериментальным животным (крысы) парентерально (внутрибрюшинно) в дозе 40 мкг/кг массы тела за 60 минут до начала эмоционально-болевого стрессирования в течение 5 суток.

Пример конкретного выполнения.

Экспериментальные животные (крысы-самцы Вистар) массой 310-340 г были разделены на группы по 10-12 особей в каждой (таблица). Животные содержались при температуре воздуха в помещении 22-24°С, световом режиме: 12 часов - свет, 12 часов - темнота, относительной влажность воздуха 40-50% и получали стандартный гранулированный корм и воду в свободном доступе с соблюдением всех правил и Международных рекомендаций Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых при экспериментальных исследованиях (1997), «Руководства по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» (Москва, 2005). На момент проведения экспериментов животные были здоровыми, изменений поведения, аппетита, режима сна и бодрствования обнаружено не было.

Для создания эмоционально-болевого стресса применялась модификация методик Hranilovic et al. и Matthews et al. (Hranilovic D., Bucan M., Wang Y. Emotional response in dopamine D2L receptor-deficient mice // Behav Brain Res. 2008 December 22; 195(2): 246-250. doi:10.1016/j.bbr.2008.09.007.; Matthews D.B., Morrow A.L., O'Buckley Т., Flanigan T.J., Berry R.B., Cook M.N., Mittleman G., Goldowitz D., Tokunaga S., Silvers J.M. Acute mild footshock alters ethanol drinking and plasma corticosterone levels in C57BL/6J male mice, but not DBA/2J or A/J male mice // Alcohol. 2008 September; 42(6): 469-476. doi:10.1016/j.alcohol. 2008.05.001.) в виде электро-кожного раздражения в течение 5 суток по 30 минут ежедневно. Для этого животных попарно помещали в клетку с металлическим полом, на который через каждые 15 секунд подавался постоянный ток силой 0,2 мА и продолжительностью 5 секунд. Растворенный в изотоническом растворе хлорида натрия до получения необходимой дозы 40 мкг/кг массы тела дельта-сон индуцирующий пептид вводили экспериментальному животному парентерально (внутрибрюшинно) каждый раз за 60 минут до начала эмоционально-болевого стрессирования в объеме, полученном из расчета 1 мл на 1 кг массы тела (в 0,1 мл). Контрольные животные получали эквивалентные объемы физиологического раствора. Интактные животные на протяжении всего эксперимента находились в аналогичных условиях, что и контрольные, однако стрессирования не получали.

Животных выводили из эксперимента путем обескровливания под эфирным наркозом. Забор крови осуществлялся из правого желудочка сердца с использованием закрытых системы для взятия крови S-Monovette® с активатором свертывания для получения сыворотки производства SARSTEDT (Германия). После чего пробирки с кровью центрифугировали в течение 15 минут со скоростью 3000 об./мин., а полученную сыворотку замораживали при -20°С.

Кроме того, брали навеску части печени, которую помещали в холодный физиологичесй раствор и гомогенизировали с последующей заморозкой при -20°С.

Функциональное состояние печени оценивали по значениям в сыворотке крови общего белка на автоматическом биохимическом анализаторе «Зиталаб Флексор Е» (Нидерланды) с использованием реагентов Analyticon (Германия) унифицированным методом по биуретовой реакции (Медицинские лабораторные технологии: справочник / под ред. А.И. Карпищенко. - СПб.: Интермедика, 1999. - Т.2. - 656 с.).

В гомогенизате печени определяли содержание супероксиддисмутазы (СОД) (Костюк В.А., Потапов А.Н., Ковалева Ж.В. // Вопр. мед. химии. 1990. №2. С.88-91), каталазы (Королюк М.А., Иванова Л.И., Майорова И.Г., Токарев В.Е. // Лаб. дело. 1988. №1. С.16-19), малонового диальдегида (МДА) (Рагино Ю.И., Душкин М.И. Резистентность к окислению гепаринрезистентных В-липопротеидов сыворотки крови при ишемической болезни сердца // Клин. Лаб. Диагностика. 1998. №11. С.3-5.) с использованием спектрофотометра «Apel 330 PD» (Япония).

Статистическую обработку результатов производили с использованием t-критерия Стьюдента и U-критерия Манна-Уитни.

Проведенные эксперименты показали, что при хроническом эмоционально-болевом стрессе в контрольной группе нарушались биохимические показатели по сравнению с показателями интактных животных: в сыворотке крови достоверно снижалась концентрация общего белка, в печени наблюдалось достоверное снижение антиоксидантных ферментов (каталаза, СОД) при увеличении содержания прооксидантов (МДА). В свою очередь, введение ДСИП в дозе 40 мкг/кг улучшает белково-синтетическую функцию, активирует антиоксидантную и подавляет прооксидантную системы печени, что свидетельствует о гепатопротекторном эффекте (таблица).

Таким образом, результаты проведенных экспериментальных исследований показывают, что использование дельта-сон индуцирующего пептида в дозе 40 мкг/кг вызывает выраженный гепатопротекторный эффект при хроническом эмоционально-болевом стрессе. Данный способ основан на применении регуляторного пептида, относящегося к классу биологически активных веществ, обладающих выраженным модуляторным эффектом и полифункциональностью, не является трудоемким и не требует использования сложного оборудования.