Результат интеллектуальной деятельности: Способ определения ингибитора трипсина в соевых бобах и продуктах их переработки

Изобретение относится к биохимии, сельскому хозяйству и пищевой промышленности и может быть использовано при биохимических исследованиях количества ингибитора трипсина не только в бобах сои и соевых продуктах, а также других бобовых культурах.

Известно несколько методов лабораторного анализа качества продуктов переработки сои в комбикормовой промышленности http://www.ya-fermer.ru/ Некоторые особенности методов лабораторного анализа качества продуктов переработки сои в комбикормовой промышленности).

В качестве специальных методов для оценки продуктов переработки сои используют:

1. цветовое сравнение;

2. скоростной цветовой тест с феноловым красным;

3. тест с крезоловым красным;

4. определение доступности лизина;

5. определение активности уреазы;

6. определение растворимых протеинов;

7. определение индекса дисперсности протеина(PDI);

8. определение активности ингибитора трипсина(TIA);

Первые три метода являются очень приблизительными и могут использоваться на производстве, перерабатывающем сою из постоянного и стабильного источника, а также проводящего исследования сои другими методами на регулярной основе в сторонних лабораториях.

Определение активности уреазы является наиболее популярным и доступным методом анализа сои и продуктов ее переработки. Однако, проводя исследование данным методом, стоит помнить, что есть сорта сои с исходно низким содержанием уреазы. Содержание уреазы может меняться и в случае обработки семян сои или шрота органическими кислотами. На конечный результат также могут влиять некоторые факторы (крупность помола образца, дискретность рН-метра от которой зависит точность результата, точное соблюдение методики). Кроме того следует произвести перерасчет на натурально вещество после анализа обезжиренного образца. Данный метод требует больших энергозатрат и расходов. Все измерения и расчеты производятся по ГОСТу 13979-69. За окончательный результат измерения принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных измерений, расхождение между которыми не должно превышать 30% от среднего арифметического значения рН при доверительной вероятности 0,95.

Определение растворимых протеинов может проводиться различными методами, как по международной методике, так и по российскому ГОСТу. В этом случае результаты для одного и того же образца, полученные разными методами, могут значительно отличаться. Причины этого можно рассмотреть на примере двух методов определения растворимых протеинов: ГОСТ 13979-68 и метод AJINOMOTO HEARTLAND LLC, которые имеют существенные отличия:

1) размер частиц после размола;

2) размер навески (5 г по ГОСТу и 1,5 г по методике AJINOMOTO);

3) объем раствора 0,2% щелочи (натриевая 200 по ГОСТу и калиевая 75 мл по методике AJINOMOTO);

4) метод перемешивания (вручную по ГОСТу и магнитная мешалка по методике AJINOMOTO);

5) время перемешивания (90 минут по ГОСТу и 20 минут по методике AJINOMOTO);

6) фильтрование (по ГОСТу) и центрифугирование (по методике AJINOMOTO);

7) объем супернатанта на анализ (25 мл по ГОСТу и 15 мл по методике AJINOMOTO);

8) количество реагентов на «сжигание» белка (5 мл кислоты по ГОСТу и 12,5 мл по методике AJINOMOTO). Все эти отличия приводят к расхождению в конечном результате на 20%, при том, что анализы проводились в одной комнате, в один день, с одним и тем же оборудованием (http://www.va-fermer.ru/ Некоторые особенности методов лабораторного анализа качества продуктов переработки сои в комбикормовой промышленности).

Определение активности ингибитора трипсина можно проводить двумя методами: AOCS Official Method Ва 12-75 и ISO 14092. Эти методы имеют серьезные отличия, которые могут отразиться на конечном результате:

1) размер частиц образца после размола (по методу AOCS 0,15 мм, а по методу ISO 14092 - 0,5 мм);

2) инкубация (по методу AOCS 3 часа, а по методу ISO 14092 - 15…24 часа в холодильнике при +4°С);

3) важно происхождение и активность фермента. Если в ISO 14092 четко прописан метод контроля активности ингибитора трипсина, то в AOCS данный вопрос почти не раскрыт.Способ по ГОСТ 33427-2015 определение трипсинингибирующей активности продуктов из сои, являющийся наиболее близким по совокупности признаков к заявляемому способу, не позволяет обеспечить необходимую точность определения количественного содержания ингибитора трипсина, требует повышенных затрат времени, многоступенчатости процесса исследования, более сложного технологического оборудования и дорогих реактивов, кроме того формула определения активности трипсинингибирующей активности не лишена недостатков, поскольку она выражает активность ингибитора трипсина в единицах мг/г, где количество мг соответствует массе трипсина, а г -количество массы навески пробы в г. В методике определения активности ингибитора трипсина по ГОСТ 33427-2015 раствор инкубируют в водяной бане при температуре 37°С в течение 600±5 с, но в формуле при расчетах активности этот факт не упоминается. От времени инкубации зависит процесс гидролиза ферментом субстрата и трудно себе представить, чтобы этот важный момент не был отражен в формуле при расчетах. Тем более что активность ферментов выражается в мг расщепленного субстрата определенным количеством ферментативного материала (обычно выражают в мл или л) за единицу времени (мин) (RU 2473699 С2).

Наиболее близким техническим решением определения ингибитора трипсина является ГОСТ 33427-2015, где способ выполнения и методика являются наиболее близкими к предлагаемому методу, который можно считать прототипом нашего изобретения.

Указанный метод включает в себя отбор проб, подготовку анализируемой пробы, экстракцию, проверку активности трипсина, измерение трипсинингибирующей активности. Однако существует значительное отличие между методом по ГОСТу и предлагаемым способом. В приготовлении экстракта по ГОСТу 33427 берут навеску массой 1,0±0.001 г, помещают в коническую колбу и добавляют 50 мл раствора гидроокиси натрия, доводят значение рН до 9,5±0,1 ед. рН раствором соляной кислоты. Закрывают коническую колбу и оставляют на сутки в холодильнике. Содержимое колбы переносят в мерную колбу объемом 100 мл и доводят раствор до метки дистиллированной водой, перемешивают и оставляют на 15 мин.

В предлагаемом нами способе навеска берется массой 0,100±0,01 г. Навеску помещают в пробирку (15 мл), добавляют 9,9 мл раствора Рингера, затем гомогенируют в течение 3 мин, содержимое переливают в пробирку вместимостью 10 мл и центрифугируют не менее 5 мин. Полученный экстракт фильтруют. Подготовленный экстракт используют для исследования в течение всего дня.

Активность трипсина по ГОСТу 33427 проверяют в каждой партии. Для этого готовят контрольный (пробирка №1) и анализируемый (пробирка №2) растворы трипсина.

В центрифужные пробирки последовательно вносят по 5 мл реактива L-BAPA, по 3 мл дистиллированной воды, в пробирку №1 добавляют 1 мл раствора уксусной кислоты. Содержимое пробирки перемешивают с помощью устройства для смешивания и помещают пробирки на водяную баню на 10 минут. Затем в каждую пробирку добавляют по 1 мл рабочего раствора трипсина. Содержимое пробирки перемешивают и помещают в центрифужные пробирки на водяную баню. Через (600±5) с в пробирку №2 добавляют по 1 мл раствора уксусной кислоты. Содержимое пробирок перемешивают с помощью устройства для смешивания и центрифугируют в течение 10 минут при 1500 об/мин. Разница между оптической плотностью анализируемого раствора трипсина и оптической плотностью контрольного раствора трипсина должна быть 0,380±0,050 если условие невыполнимо, то используют новый трипсин.

В предлагаемом способе на стадии проверки активности трипсина в микропробирку (эппендорф на 1,5 мл) последовательно добавляют 450 мкл реактива 1 (буфер рН 8,2), 10 мкл рабочего раствора трипсина инкубируют в течение 3 минут при температуре 37°С после этого добавляют 50 мкл реактива 2 (BAPNA). Содержимое кюветы перемешивают и заправляют в полуавтоматический биохимический анализатор Sinnowa BS3000P, который выполняет определение активности трипсина в автоматическом режиме кинетическим методом с соответствие с заданной программой.

Измерение трипсинингибирующей активности по ГОСТу 33427 выполняют следующим образом: центрифужные пробирки для каждого разведения экстракта последовательно вносят по 5 мл реактива реактива L-ВАРА, по 3 мл дистиллированной воды, в пробирку №1 добавляют 1 мл раствора уксусной кислоты. Содержимое пробирки перемешивают с помощью устройства для смешивания и помещают пробирки на водяную баню на 10 минут. Затем в каждую пробирку добавляют по 1 мл рабочего раствора трипсина. Содержимое пробирки перемешивают и помещают в центрифужные пробирки на водяную баню. Через (600±5) с в пробирку №2 добавляют по 1 мл раствора уксусной кислоты. Содержимое пробирок перемешивают с помощью устройства для смешивания и центрифугируют в течение 10 минут при 1500 об/мин.

В предлагаемом способе для определения активности трипсина в эппендорф последовательно добавляют 450 мкл реактива 1 (буфер рН 8,2), 10 мкл рабочего раствора трипсина и 10 мкл экстракта сои. Содержимое кюветы тщательно перемешивают и инкубируют в течение 4 минут при температуре 37°С. Затем к содержимому микропробирки добавляют 50 мкл субстрата (BAPNA). Содержимое микропробирки снова перемешивают и заправляют в полуавтоматический биохимический анализатор Sinnowa BS3000P для определения кинетическим методом активности трипсина. Расчет трипсинингибирующей активности выполняют следующим образом.

Ит=((К-О):К)×100% (1), где

Ит - количество ингибитора трипсина, %;

К - активность трипсина в контрольной пробе, ед/л;

О - активность трипсина в исследуемой пробе, ед/л;

ТИА=((Ит×0,025):100)×10000:4, (2), где

ТИА - трипсинингибирующая активность в мг расщепленного субстрата (BAPNA) трипсином, свободным от ингибитора трипсина, содержащегося в одном г пробы в течение одной минуты (мг/г/мин);

Ит - ингибитор трипсина, %;

0,025 - коэффициент перевода ингибитора трипсина из процентов в количественное выражение в мг, поскольку в реактиве 2 содержится в 1 мл 5 мг BAPNA, используется для опыта 50 мкл (0,05 мл) и разводится буфером в 10 раз;

100 - коэффициент перевода из процентов в мг;

10000 - коэффициент перевода пробы из фактического, участвующего в биохимической реакции, к количественному выражению в 1 г. Для исследования берем 0,1 г соевого продукта, гомогенизируем, добавляя 10 мл раствора Рингера (1:100), в химической реакции принимает участие 1/100 мл, следовательно, в реакции участвует 1/10000 часть от одного г; 4 - время инкубации раствора.

Таким образом, приведенная выше формула отражает все основные этапы и наиболее объективно связывает ферментативный процесс с временем реакции. Предложенный нами способ определения ингибитора трипсина в соевых бобах и продуктах ее переработки основывается на более современном методе определения активности трипсина, который позволяет упростить процесс определения, сделать его менее затратным по реактивам и по времени выполнения, а также отразить в формуле зависимость химических процессов от времени инкубации фермента и субстрата.

Примеры практического использования способа определения ингибитора трипсина в соевых бобах и продуктах их переработки.

Пример 1. Определения ингибитора трипсина в соевых бобах. Активность трипсина составляет 1950±82,5 ед/л, определение кинетическим методом, в качестве субстрата BAPNA (Mikhailova A.G. et al., 2014). Количество ингибитора трипсина рассчитываем по формуле 1:(1955-1200):1955×100%=38,6%

Это значение подставляем в формулу (2) и определяем

ТИА=(38,6×0,025):100^∧(0,00965×10000):4=24,1 мг/г/мин

Пример 2. Определение ингибитора трипсина в соевом продукте, нагретом при изготовлении до температуры 132°C.

Активность трипсина равна 2049,3 ед/л, а активность трипсина при взаимодействии в соевым продуктом находится на этом же уровне - 2139,4 ед/л. Следовательно, фермент не взаимодействует с ингибитором трипсина вследствие того, что его нет в исследуемом растворе. Таким образом, при высоких температурах ингибитор трипсина в сое полностью разрушается.

Пример 3. Определение активности ингибитора трипсина в соевом продукте, нагретом при изготовлении до 117°С.

Активность трипсина составила 1907,2 ед/л. Рассчитываем активность ингибитора трипсина по формуле (1): (1955-1907):1955×100%=2,4%.

По формуле (2) рассчитываем трипсинингибирующую активность:

ТИА=(2,4×0,025):100=(0,0006×10000):4=1,5 мг/г/мин. Следовательно, при нагревании при производстве соевого продукта до 117°С трипсинингибирующая активность снижается с 24,1 мг/г/мин до 1,5 мг/г/мин, т.е. в 16,1 раза.

Пример 4. Влияние времени инкубации при определении ТИА на результаты исследований.

Примечание: показатели отличаются от первой пробы на достоверную величину *-Р≤0,05; *** - Р≤0,001

Данные табл. 1 показывают, что при увеличении времени инкубации субстрата и трипсина активность снижается и при увеличении времени с 1 до 4 мин имеет достоверную разницу, составляя 90,9% от первоначальной величины. При увеличении время инкубации до 11 мин активность фермента снижается до 80,1% от активности при времени инкубации 1 мин. Аналогичную динамику имеет ТИА у разных соевых продуктов. Анализ соотношения между разными по качеству соевыми продуктами показывает, что наибольшее соотношение отмечается при времени инкубации равном 4 мин, при уменьшении и увеличении показателя отмечается снижение соотношения. Следовательно, в этом случае наблюдается наибольшая разница между сырой соей, содержащей максимальное количество ингибитора трипсина, и исследуемым продуктом. Поэтому указанный интервал времени следует считать оптимальным.

Литература

1. http://www.va-fermer.ru/ Некоторые особенности методов лабораторного анализа качества продуктов переработки сои в комбикормовой промышленности

2. Вертипрахов В.Г., Цуканова Е.С., Бутенко М.Н. Способ определения количественного содержания пищевых белков (патент RU 2473699 С2. 27.03.2013)

3. Mikhailova A.G., Khairullin R.F., Demidyuk I.V., Kostrov S.V., Grinberg N.V., Burova T.V., Grinberg V.Y., Rumsh L.D. Cloning, sequencing, expression, and characterization of thermostability of oligopeptidase В from Serratia proteamaculans, a novel psychrophilic protease /Protein Expression and Purification 93 (2014). - P. 63-76.