Результат интеллектуальной деятельности: ШТАММ "ГС-11" ВИРУСА ИНФЕКЦИОННОГО БРОНХИТА КУР ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА ИНАКТИВИРОВАННЫХ СОРБИРОВАННЫХ И ЭМУЛЬГИРОВАННЫХ ВАКЦИН, А ТАКЖЕ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ЦЕЛЕЙ

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии и может быть использовано при изготовлении средств диагностики и профилактики инфекционного бронхита кур.

Инфекционный бронхит кур (ИБК) - высококонтагиозная болезнь, проявляющаяся поражением респираторного тракта, а также мочеполовой системы птиц [4, 9]. Экономический ущерб, причиняемый ИБК, складывается из убытков от гибели и вынужденной выбраковки птицы, длительного снижения яйценоскости у кур, снижения качества инкубационных и пищевых яиц, затрат на препараты, а также за счет снижения качества мясной продукции. К вирусу ИБК восприимчивы куры всех возрастных групп. Возбудитель ИБК - РНК-содержащий вирус, принадлежащий к роду Coronavirus семейства Coronaviridae. Вирус ИБК впервые выделили Бич и Шалк в США в 1936 г. В настоящее время заболевание широко распространено практически во всех странах с развитым птицеводством [9, 11].

Вирусу ИБК свойственна высокая генетическая изменчивость в результате накопления точечных мутаций, инсерций и делеций и рекомбинации [10, 12]. Возникающие вариантные штаммы вируса ИБК зачастую становятся причиной поражения птицепоголовья, вакцинированного классическими вакцинными штаммами, принадлежащими к серотипу Массачусетс, которые обеспечивают лишь частичную защиту от заражения вариантными вирусами ИБК [3, 10, 12]. Исследования показали, что во многих странах циркулируют различные вариантные штаммы вируса ИБК [11]. Вакцинация птиц одним серотипом не гарантирует полной защиты от гетерологичных штаммов вируса ИБК, однако было показано, что использование живых вакцин из комбинаций классического и вариантного штаммов дает возможность обеспечить высокую защиту [7, 13, 15]. Многие исследователи считают наиболее эффективным применение комбинации вакцинных штаммов, относящихся к генотипам Массачусетс и 793 В. Проведенный на территории РФ мониторинг с помощью ОТ-ПЦР и секвенирования указывает, что в 2005-2011 гг., по сравнению с данными за период 1998-2004 гг., сократилось количество изолятов вируса ИБК генотипа Массачусетс и возросло количество изолятов вируса ИБК генотипа 793 В и QX [5, 8, 14].

Известен штамм "Чапаевский" вируса ИБК для контроля напряженности иммунитета [2]; известен штамм "AM" вируса ИБК для изготовления живых вакцинных препаратов [1]; известны вакцинные штаммы «Н-120» и «Н-52» вируса ИБК. Но все они относятся к серотипу Массачусетс.

Известен вакцинный штамм «4/91» (Nobilis IB 4/91) серотипа 793/В; известны отечественные вакцинные штаммы «РВ-07» и «А/91» того же серотипа.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является полевой штамм «Таганрогский» серотипа 793/В [6].

Однако перечисленные штаммы уступают по биологической и антигенной активности.

Задачей настоящего изобретения является получение нового вариантного штамма вируса инфекционного бронхита кур (ИБК) серотипа 793/В, обладающего высокой биологической активностью в нативном виде, а также высокой антигенной и иммуногенной активностью после инактивации с целью изготовления высокоспецифичных и чувствительных диагностикумов и высокоиммуногенных и безвредных инактивированных вакцинных препаратов.

Поставленная задача достигается получением штамма «ГС-11» вируса инфекционного бронхита кур для производства инактивированных сорбированных и эмульгированных вакцин, а также диагностических целей.

Штамм «ГС-11» вируса инфекционного бронхита кур выделен из почек клинически больных цыплят-бройлеров (ОАО «Тольяттинская птицефабрика») на развивающихся СПФ эмбрионах кур 9- суточного срока инкубации. После проведения 5 адаптационных последовательных пассажей на куриных эмбрионах титр биологической активности вируса составляет 10^7,4-10^8,0 ЭИД_50/см³.

Полученный штамм депонирован в Государственной коллекции вирусов в НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского ФГБНУ «ФНИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России под №2838. По сравнению с прототипом, штамм «ГС-11» вируса ИБК обладает более высокой биологической и антигенной активностью в нативном виде и после инактивации.

Экспериментально подтверждена возможность его использования для изготовления диагностических препаратов и инактивированной вакцины против ИБК.

Штамм «ГС-11» вируса ИБК поддерживается на развивающихся СПФ эмбрионах кур. Для поддержания и наработки вируссодержащего материала используется система посевных материалов (seed lot system).

Штамм «ГС-11» вируса ИБК характеризуется следующими признаками и свойствами. Морфологические свойства

При электронно-микроскопическом исследовании методом негативного контрастирования фосфорно-вольфрамовой кислотой установлено, что вирусные частицы штамма «ГС-11» имеют оболочку с пепломерами, образующими корону, полиморфны, имеют в основном округлую форму, средний размер вирионов колеблется в пределах 75-120 нм.

Генетические признаки

При молекулярно-генетическом исследовании установлено, что Штамм «ГС-11» имеет 98% гомологии с вариантными щтаммами и изолятами генотипа 793/В.

Биотехнологические характеристики

Штамм «ГС-11» вируса ИБК культивируются на развивающихся эмбрионах кур. суточных СПФ эмбрионах кур. Оптимальными условиями накопления вируса являются: инокулирование в аллантоисную полость 9-10 дневных развивающихся СПФ эмбрионов кур заражающей дозы, равной 4,0 lg ЭИД50/_{0,2 см}³, инкубация инфицированных эмбрионов при 37°C и относительной влажности 60-70% в течение 72 часов. Титр вируса в собранной аллантоисной вируссодержащей жидкости достигает +10^8,0 ЭИД_50/см³.

Патогенные свойства

Экспериментально установлено, что окулярно-интраназальное введение вируса в объеме 0,5-0,1 см³ в дозе 10^4,0 ЭИД₅₀ СПФ-цыплятам суточного возраста вызывает у цыплят на 5-7 сутки после инокуляции вялость, сонливость, ухудшение аппетита, гибель до 30%. Респираторные признаки выражены очень слабо. При патологоанатомическом вскрытии у цыплят отмечаются поражения почек от незначительных до выраженных: почки увеличены, встречаются с пестрым рисунком.

Штамм «ГС-11» вируса ИБК является умеренно вирулентным для цыплят.

Антигенные свойства

Штамм «ГС-11» вируса ИБК индуцирует у кур выработку вируснейтрализующих и преципитирующих антител к вирусу ИБК.

Инактивированный вируссодержащий материал в адъювантной форме, введенный парентерально цыплятам, индуцирует выработку антител в высоких титрах, регистрируемых в ИФА.

Устойчивость к химическим агентам

Штамм «ГС-11» вируса ИБК неустойчив к хлороформу, дезоксихолату натрия, фенолу, формалину, четвертичным аммонийным соединениям. 0,5-1,0%-е растворы формальдегида, фенола, 70%-й этиловый спирт, раствор соды (1:10000) разрушают вирус в течение 3 минут.

Условия хранения

При хранении штамма в нативном состоянии при температуре -70°C допустимая длительность хранения без освежения составляет 24 мес, а при хранении в лиофилизированном состоянии под вакуумом при той же температуре - 5 лет.

Дополнительные сведения о штамме

Свободен от контаминации бактериями, микоплазмами, грибами и другими вирусами.

На основании полученных данных можно утверждать, что вариантный штамм «ГС-11» вируса ИБК является оригинальным, в таксономическом отношении новым, ранее неизвестным изолятом вариантного вируса ИБК.

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его использования:

Пример 1. Приготовление диагностического антигена

Вируссодержащий материал разводили до оптимальной заражающей дозы. Полученным разведением заражали СПФ-эмбрионы кур в аллантоисную полость в объеме 0,2 см³.

Инфицированные эмбрионы помещали в термостат с температурой 37,0±0,5°C и при относительной влажности 60-70%. Срок инкубации составлял 72 ч.

Овоскопирование

проводили два раза в сутки. Эмбрионы, павшие в течение первых 24 ч после заражения выбраковывали. Эмбрионы, павшие позже 24 час до вскрытия, хранили в холодильнике при температуре 4-6°C.

Перед сбором вируссодержащего материала оставшиеся живые эмбрионы предварительно охлаждали при температуре 4-6°C в течение 6-12 часов.

Охлажденные эмбрионы вскрывали и экстраэмбриональную жидкость и хорионаллантоисную оболочки собирали во флаконы емкостью 450 см³. Вируссодержащий материал гомогенизировали при 3000-5000 об/мин, центрифугировали при 3000 g в течение 30 мин. Из надосадочной жидкости отбирали пробы для определения биологической активности вируса. Вируссодержащий материал, имеющий биологическую активность не ниже 10^7,4 ЭИД_50/см³, подвергали инактивации. Инактивацию вируссодержащего материала проводили теотропином. Контроль полноты инактивации вируса осуществляли методом трех последовательных пассажей на развивающихся эмбрионах кур. Контроль стерильности - посевом на стерильные питательные среды: МПА, МПБ, МППБ под вазелиновым маслом и бульон Сабуро. Полученный антиген был пригоден для постановки реакции диффузионной преципитации.

Пример 2. Приготовление инактивированной вакцины

Для изготовления инактивированной эмульгированной вакцины против ИБК использовали антиген вируса ИБК из вариантного штамма «ГС-11», полученный по методике, указанной в примере 1. Эмульсию получали методом гомогенизации водного и масляного компонентов в соотношении 30:70 с помощью гомогенизатора Ultraturrax Т-25. В качестве масляной фазы использовали адъювант АБ-4М (или другой). Полученную вакцину контролировали на стерильность, стабильность и вязкость эмульсии, полноту инактивации, безвредность и антигенную активность.

Пример 3. Определение антигенной активности вакцины

Проведены сравнительные испытания антигенной активности трех инактивированных эмульгированных вакцин против ИБК из штамма «ГС-11», штамма «4/91» и штамма «Чапаевский». В изготовлении вакцин был использован вируссодержащий материал с одинаковой биологической активностью, равной 10^7,7ЭИД_50/см³, определенной до инактивации. Цыплята 20-дневного возраста в количестве 60 голов были разделены на 3 группы по 20 голов в каждой. Цыплят каждой группы иммунизировали соответствующим образцом инактивированной вакцины. Дополнительно 10 голов цыплят оставили в качестве чистого контроля. Иммунизацию цыплят осуществляли подкожным введением препарата объемом 0,5 см³ в среднюю треть шеи. Через 28 дней после вакцинации от всех цыплят взяли кровь, получили сыворотки и исследовали их в ИФА на наличие антител к вирусу ИБК. Вакцину считали антигенно активной, если титры поствакцинальных антител в ИФА к вирусу ИБК не менее чем в 2 раза превышали минимальный положительный титр, указанный в инструкции набора BioChek (1:834) при отрицательном иммунном фоне (уровень титров антител к вирусу ИБК у цыплят контрольной группы) или не менее чем в 2 раза превышали уровень иммунного фона.

Результаты исследований образцов вакцин на антигенную активность представлены в Таблице 1.

Пример 4. Приготовление диагностической сыворотки

СПФ-цыплят 20-дневного возраста двукратно с интервалом в 30 дней иммунизировали инактивированной эмульгированной вакциной против ИБК из штамма «ГС-11». Иммунизацию цыплят осуществляли подкожным введением препарата объемом 0,5 см³ в среднюю треть шеи. Через 3-4 недели после второй вакцинации цыплят обескровливали, получали сыворотку и определяют ее активность в ИФА.

Таким образом, штамм «ГС-11» вируса инфекционного бронхита кур, полученный в соответствии с предлагаемым изобретением, обладает высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью, пригоден для изготовления высокоиммуногенных инактивированных вакцин, а также диагностических целей, и расширяет арсенал новых отечественных производственных вариантных штаммов вируса ИБК.

Источники информации

1. SU 1707076 A1; C12N 7/00; 23.01.92.

2. SU 1822792 A1; A61K 39/215, C12N 7/00; 23.06.93.

3. Бочков Ю.А. Диагностика инфекционного бронхита кур / Ю.А. Бочков, А.В. Борисов, С.В. Фролов и др. // Ветеринария. - 2003. - №4. - С. 21-24.

4. Вирусные болезни животных / В.Н. Сюрин, А.Я. Самуйленко, Б.В. Соловьев и др. – М.: ВНИТИБП, 1998. - 928 с., ил.

5. Овчинникова Е.В. Генетическая характеристика полевых изолятов вируса инфекционного бронхита кур, выявленных в России в 2004-2005 гг. / Е.В. Овчинникова, Г.В. Батченко, О.А. Чупина и др. // Тр. Федерального центра охраны здоровья животных. - Владимир, 2006. - Т. 4. - С. 362-369.

6. Фролов С.В. Обоснование использования российских вариантных штаммов инфекционного бронхита кур для изготовления инактивированной вакцины / С.В. Фролов, Ю.А. Бочков, Г.В. Батченко и др. // Тр. Федерального центра охраны здоровья животных. - Владимир, 2005. - Т. 1. - С. 343-357.

7. Alvarado, I.R. Evaluation of the protection conferred by commercial vaccines against the California 99 isolate of infectious bronchitis virus /I.R. Alvarado, P. Villegas, J. El-Attrache et al. // Avian Diseases. - 2003. - Vol. 47, No. 4. - P. 1298-1304.

8. Bochkov, Y.A. Molecular epizootiology of avian infectious bronchitis in Russia / Y.A. Bochkov, G.V. Batchenko, L.O. Shcherbakova et al. // Avian Pathology. - 2006. - Vol. 35. - P. 379-393.

9. Calnek, B.W. Infectious bronchitis / B.W. Calnek, H.J. Barnes, C.W. Beard et al. // Diseases of Poultry, Tenth Edn. Iowa State University Press Ames, Iowa, USA - 1997. - P. 510-526.

10. Cavanagh, D., Naqi S. Infectious bronchitis // Diseases of Poultry. - 11th ed. - Ames, Iowa, 2003. - P. 101-119.

11. de Wit, J.J. Infectious bronchitis virus variants: a review of the history, current situation and control measures. / J.J. de Wit, J.K.A. Cook, H. M. J. F. Van Der Heijden // Avian Pathology. - 2011. - Vol. 40, No. 3. - P. 223-235.

12. Ignjatovic, J. Isolation of a variant infectious bronchitis virus in Australia that further illustrates diversity among emerging strain / J. Ignjatovic, G. Gould, S. Sapats et al. // Arc. Virol. - 2006. - Vol. 151, - P. 1567-1585.

13. Martin M.P. Evaluation of the effectiveness of two infectious bronchitis virus vaccine programs for preventing disease caused by a California IBV field isolate. / M.P. Martin, P.S. Wakenell, P. Woolcock et al. // Avian Diseases. - 2007. - Vol. 51, No. 2. - P. 584-589.

14. Ovchlnnikova, E. Molecular characterization of infectious bronchitis virus isolates from Russia and neighbouring countries: identification of intertypic recombination in the SI gene / E. Ovchlnnikova, Y. Bochkov, L. Shcherbakova, Z. Nikonova et al. // Avian Pathology. - 2011. - Vol. 40, No. 5. - P. 507-514.

15. Terregino, C. Pathogenicity of a QX strain of infectious bronchitis virus in specific pathogen free and commercial broiler chickens, and evaluation of protection induced by a vaccination programme based on the Ma5 and 4/91 serotypes. / C. Terregino, A. Toffan, M. Serena Beato et al. // Avian Pathology. - 2008. - Vol. 37, No. 5 - P. 487-493.