Способ генетической регистрации и коррекции нейрогенеза на основе генетических конструкций для трансфекции нейронов

Изобретение относится к области молекулярной биологии для регистрации и коррекции нейрогенеза посредством специфической трансфекции нейронов с целью таргентного контроля внутриклеточных каскадов, в частности, для исследования нейродегенеративных заболеваний, а также может быть использовано в области медицины для терапии нейродегенеративных заболеваний.

Известно изобретение «Способ и композиция для стимуляции нейрогенеза и ингибирования дегенерации нейронов» (патент РФ №2440346), содержащее сходное с используемым в заявленном способе химическое соединение, обладающее способностью к стимуляции нейрогенеза и (или) ингибированию нейрональной дегенерации.

Недостатком этого способа является то, что с помощью описанного в нем химического соединения не представляется возможным стимулировать или ингибировать экспрессию таргетных генов в популяциях нейронов мозга, а также экспрессировать в нейронах флуоресцентный маркер.

Наиболее близким по технической сущности заявляемому способу, выбранному в качестве прототипа, является «Способ и композиция для стимуляции нейрогенеза и ингибирования дегенерации нейронов» (патент РФ №2440346, 20.01.2012), при котором используется химическое соединение, обладающее активностью стимуляции образования нервной ткани и (или) ингибирования дегенерации нейронов.

Недостатком этого способа является отсутствие возможности стимуляции или ингибирования экспрессии таргетных генов в популяциях нейронов мозга, а также экспрессии в нейронах флуоресцентного маркера.

Задачей заявляемого изобретения является реализация механизма таргентного контроля внутриклеточных каскадов в нейронах с целью стимулирования нейрогенеза и (или) ингибирования нейрональной дегенерации, в частности, для исследования нейродегенеративных заболеваний путем специфической трансфекции нейронов генетическими конструкциями, позволяющими визуализировать отдельные типы клеток головного мозга с помощью флуоресцентных маркеров.

Поставленная задача решается тем, что в способе генетической регистрации и коррекции нейрогенеза на основе генетических конструкций для трансфекции нейронов, для создания нового типа терапии нейродегенеративных заболеваний, согласно изобретению разрабатывают генетическую конструкцию SEQ ID N4 на основе лентивирусного вектора для специфической трансфекции нейронов, обладающую способностью осуществлять таргетный контроль внутриклеточных каскадов, в частности, для исследования нейродегенеративных заболеваний, а также экспрессировать в них генетически кодируемый кальциевый индикатор.

В разработанной для осуществления способа генетической регистрации и коррекции нейрогенеза генетической конструкции SEQ ID N4 в качестве вектора используют лентивирусный вектор на основе ВИЧ-1, модифицированный последовательностями SEQ ID N1, кодирующей посттранскрипционный регуляторный элемент вируса гепатита сурка (WPRE), SEQ ID N2, кодирующей генетически кодируемый кальциевый индикатор (TN-XXL), SEQ ID N3, кодирующей искусственный фенотип-специфический нейрональный промотор (PRSx8), экспрессия которых приводит клеточно-специфической экспрессии генетически кодируемого кальциевого индикатора в катехоламинергических нейронах головного мозга.

Для эффективного ингибирования экспрессии таргетных генов предусмотрено встраивание в последовательность генетической конструкции клеточно-специфических промоторов, обеспечивающих синтез интересующих генов только в определенном типе клеток.

Для управляемого стимулирования нейрогенеза и(или) ингибирования таргетных генов предусмотрено встраивание в последовательность генетической конструкции генов, экспрессия которых активируется под воздействием химических стимулов, что, в свою очередь, приводит к повышению концентрации определенных веществ, оказывающих влияние на выделение глиотрансмиттеров, которые, в свою очередь, оказывают влияние на жизнедеятельность нейронов и нейрогенез, в частности, а также обеспечивающих возможность визуализировать отдельные клетки головного мозга за счет флуоресцирования.

Причем, в наиболее близком по технической сущности заявляемому способе используется химическое соединение, отличное по своему строению от вирусного вектора и не способное встраивается в геном клеток мозга.

На фиг. 1 представлено схематическое изображение генетической конструкции на основе лентивирусного вектора, специфически трансфецирующего нейроны. Генетическая конструкция содержит:

LTR - длинный терминальный повтор лентивируса;

PRSx8 - искусственный фенотип-специфический нейрональный промотор;

TN-XXL - последовательность, кодирующая генетически кодируемый кальциевый индикатор TN-XXL;

WPRE - посттранскрипционный регуляторный элемент вируса гепатита сурка;

bGH poly(A) сигнал - сигнал полиаденилирования;

RRE - rev-отвечающий элемент ВИЧ-1, который обеспечивает Rev-зависимый экспорт мРНК из ядра в цитоплазму.

На фиг. 2 представлена карта плазмиды LVV-PRSx8-TN-XXL, характеризующейся:

5'LTR (1-25) - длинный терминальный повтор лентивируса;

PRSx8 (26-262) - искусственный фенотип-специфический нейрональный промотор;

TN-XXL (288-2147) - последовательность, кодирующая генетически кодируемый кальциевый индикатор TN-XXL;

ECFP variant (291-1604) - усиленный синий флуоресцентный белок;

EYFP (1626-2141) - усиленный желтый флуоресцентный белок;

WPRE (2154-2771) - посттранскрипционный регуляторный элемент вируса гепатита сурка;

bGH роду(А) сигнал (2972 - 3196) - сигнал полиаденилирования;

ori (4540 - 5128) - высоко-копийная точка начала репликации плазмид ColE1/pMB1/pBR322/pUC;

AmpR (5299-6159) - последовательность, обеспечивающая устойчивость к ампициллину, карбенциллину и др. связанным антибиотикам;

AmpR промотор (6160-6264) - промотор, обеспечивающий резистентность к ампициллину;

bom (6509-6647) - базовый мобильный регион плазмиды pBR322;

RRE (9492-9725) - rev-отвечающий элемент ВИЧ-1, который обеспечивает Rev-зависимый экспорт мРНК из ядра в цитоплазму;

3'TR (9726 - 10144) - длинный терминальный повтор лентивируса;

10144 bp - длина последовательности плазмиды, равная 10144 нуклеотидам.

Способ осуществляется следующим образом.

Заявляемый способ основан на использовании клеточно-специфического промотора для управления одновременной экспрессией нужного трансгена и сильного искусственного активатора транскрипции для усиления транскрипции посредством связывания специфических сайтов связывания, введенных в последовательность промотора. Таким образом, задействуют два клеточно-специфических промотора: один для транскрипции интересующего трансгена, другой для экспрессии трансактиватора.

Используемые генетические конструкции представляют собой разнонаправленную лентивирусную векторную систему (Фиг. 1), содержащую усиленные в части транскрипционной активности искусственный фенотип-специфический нейрональный промотор (PRSx8, клеточно-специфический промотор катехоламинергических нейронов). Искусственный активатор транскрипции транскрибирует 5'-конец кассеты. Последовательность кассеты, расположенная по ходу транскрипции, управляет синтезом интересующего гена.

Генетическая конструкция для специфической трансфекции нейронов (Фиг. 2) построена с использованием лентивирусного вектора на основе само-инактивированного ВИЧ и включает, по меньшей мере,

rev-отвечающий элемент (RRE),

искусственный фенотип-специфический нейрональный промотор (PRSx8) для трансфекции катехоламинергических нейронов,

генетически кодируемый кальциевый индикатор (ГККИ) (TN-XXL) в качестве маркерного гена,

посттранскрипционный регуляторный элемент вируса гепатита сурка (WPRE) для повышения титра вектора и улучшения экспрессии трансгена.

Лентивирусный вектор LVV-PRSx8-TN-XXL был сконструирован на основе усовершенствованного лентивирусного шаттл-вектора pTYF-SW-Linker.

Для повышения титра вектора и улучшения экспрессии трансгена в структуру шаттл-вектора pTYF-SW-Linker, предварительно гидролизованного по сайтам NotI и ClaI, был клонирован амплифицированный фрагмент пост-транскрипционного регуляторного элемента вируса гепатита сурка (WPRE) - последовательность SEQ ID N1.

Для чего нами была проведена полимеразная цепная реакция со специфически подобранными праймерами WPRE_Forw (CCGCTCCCGTTATTT) WPRE_Rev (TTTATTGCCCTCGCC). Полученную плазмиду нарабатывали в препаративных количествах для последующего клонирования в нее ГККИ.

С помощью пары праймеров TN-XXL_Forw (CTTTTGCTGGCCTTT) и TN-XXL_Rev (CTTTCGGGCTTTGTT), используя в качестве матрицы плазмиду pRsetB-TN-XXL (Clontech), был амплифицирован ПЦР-продукт длиной 1860 п.о. - последовательность SEQ ID N2, которую клонировали pTYF-SW-Linker-WPRE, предварительно гидролизованный по сайтам BamHI и EcoRI Полученную плазмиду нарабатывали в препаративных количествах для последующего клонирования в нее клеточно-специфичного промотора.

Для специфической трансфекции катехоламинергических нейронов головного мозга в последовательность генетической конструкции был клонирован искусственный фенотип-специфический нейрональный промотор (PRSx8). ПЦР-продукт длиной 237 п.о. - последовательность SEQ ID N3 была получена посредством амплификации с помощью пары праймеров PRSx8_Forw (GCACCTTCCAGATCT) и PRSx8_Rev (GGACACGCTGAACTT), используя в качестве матрицы плазмиду рХсХ-PRS-EGFP. Полученный таким образом фрагмент нуклеотидной последовательности был клонирован в pTYF-SW-Linker-WPRE-GCaMP3, предварительно гидролизованный по сайтам BamHI и I-SceI.

Таким образом, нами был получен SEQ ID N4 лентивирусный вектор -LVV-PRSx8-TN-XXL для трансдукции в катехоламинергических нейронах и экспрессирования в них ГККИ TN-XXL.

Продуцирование генетической конструкции осуществляется в культуре клеток HEK293FT посредством транзиентной ко-трансфекции сконструированной генетической конструкции, упаковочного вектора pNHP и плазмиды pHEF-VSVG, кодирующей оболочку.

Трансфецирование культур первичных нейронов, полученных из трехдневных крысят и выращиваемых на модифицированной Дульбекко среде Игла (DMEM) (с 4,5 г/л глюкозы, глутамином, и пируватом) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки, осуществляют следующим образом: за день до трансфекции клетки высеивали в 24-луночные культуральные планшеты с плотностью клеток 5×10⁴ на лунку и инкубировали в течение 8-14 часов, после чего клетки астроглии трансфецировали разработанной генетической конструкцией (каждая культура соответствующей конструкцией) в присутствии полибрена (8 мкг/мл), промывали фосфатным буфером и культивировали в течение 40-52 часов в среде DMEM.

Использование заявленного изобретения позволяет осуществлять клеточно- и фенотип-специфическую трансфекцию катехоламинергических нейронов с целью таргетного контроля внутриклеточных каскадов, а также осуществлять визуализацию in vitro трансфецированных клеток за счет встраивания в разрабатываемую генетическую конструкцию генетически кодируемого кальциевого индикатора.