Способ хемогенетической регистрации и коррекции нейрогенеза на основе генетических конструкций для трансфекции астроцитов и нейронов

Изобретение относится к области молекулярной биологии для регистрации и коррекции нейрогенеза посредством специфической трансфекции клеток астроглии с целью таргентного контроля внутриклеточных каскадов, в частности, для исследования нейродегенеративных заболеваний, а также может быть использовано в области медицины для терапии нейродегенеративных заболеваний.

Известно изобретение «Способ и композиция для стимуляции нейрогенеза и ингибирования дегенерации нейронов» (патент РФ №2440346), содержащее сходное с используемым в заявленном способе химическое соединение, обладающее способностью к стимуляции нейрогенеза и (или) ингибированию нейрональной дегенерации.

Недостатком этого способа является то, что с помощью описанного в нем химического соединения не представляется возможным стимулировать или ингибировать экспрессию таргетных генов в популяциях нейронов мозга, а также экспрессировать в нейронах флуоресцентный маркер.

Наиболее близким по технической сущности заявляемому способу, выбранному в качестве прототипа, является «Способ и композиция для стимуляции нейрогенеза и ингибирования дегенерации нейронов» (патент РФ №2440346 20.01.2012), при котором используется химическое соединение, обладающее активностью стимуляции образования нервной ткани и (или) ингибирования дегенерации нейронов.

Недостатком этого способа является отсутствие возможности стимуляции или ингибирования экспрессии таргетных генов в популяциях астроцитов и нейронов мозга, а также экспрессии в нейронах флуоресцентного маркера.

Задачей заявляемого изобретения является реализация механизма таргентного контроля внутриклеточных каскадов в астроцитах с целью стимулирования нейрогенеза и (или) ингибирования нейрональной дегенерации, в частности, для исследования нейродегенеративных заболеваний путем специфической трансфекции клеток астроглии и нейронов генетическими конструкциями, позволяющими визуализировать отдельные типы клеток головного мозга с помощью флуоресцентных маркеров.

Поставленная задача решается тем, что в способе хемогенетической регистрации и коррекции нейрогенеза на основе генетических конструкций для трансфекции астроцитов и нейронов, при котором используют химическое соединение, обладающее активностью стимуляции и образования нервной ткани и (или) ингибирования дегенерации нейронов, согласно изобретению, разрабатывают генетические конструкции на основе лентивирусного вектора для специфической трансфекции астроцитов и нейронов, обладающие возможностью стимулировать или ингибировать экспрессию таргетных генов в популяциях астроцитов и нейронов, а также экспрессировать в них флуоресцентный маркер.

Для эффективного ингибирования экспрессии таргетных генов предусмотрено встраивание в последовательность генетической конструкции клеточно-специфических промоторов, обеспечивающих синтез интересующих генов только в определенном типе клеток.

Для управляемого стимулирования нейрогенеза и (или) ингибирования таргетных генов предусмотрено встраивание в последовательность генетической конструкции генов, экспрессия которых активируется под воздействием химических стимулов, что, в свою очередь, приводит к повышению концентрации определенных веществ, оказывающих влияние на выделение глиотрансмиттеров, которые, в свою очередь, оказывают влияние на жизнедеятельность нейронов и нерогенез, в частности, а также обеспечивающих возможность визуализировать отдельные клетки головного мозга за счет флуоресцирования.

Причем в наиболее близком по технической сущности заявляемому способу используется химическое соединение, отличное по своему строению от вирусного вектора и не способное встраивается в геном клеток мозга.

На фиг. 1 представлено схематическое изображение генетической конструкции на основе лентивирусного вектора, специфически трансфецирующего астроциты и (или) нейроны. Генетическая конструкция содержит:

LTR - длинный терминальный повтор лентивируса;

GAL4 - химерный трансактиватор, состоящий части трансактиваторного домена мышиного белка NF-κBp65, слитого с ДНК-связывающим доменом белка дрожжей GAL4;

CMV - минимальный промотор цитомегаловируса человека;

GFAP - компактный промотор глиального фибриллярного кислого белка;

SYN - промотор человеческого синапсина-1;

Case12 - зеленый флуоресцентный Са²⁺-чувствительный белок;

WPRE - посттранскрипционный регуляторный элемент вируса гепатита сурка.

На фиг. 2 представлено схематическое изображение генетической конструкции для специфической трансфекции астроцитов. Генетическая конструкция LVV-Astro-Case12 содержит:

5' LTR (1-25) - длинный терминальный повтор лентивируса;

RRE - rev-отвечающий элемент;

GAL4 - химерный трансактиватор, состоящий из части трансактиваторного домена мышиного белка NF-κBp65, слитого с ДНК-связывающим доменом белка дрожжей GAL4;

CMV - промотор цитомегаловируса человека;

GFAP - укороченный промотор клеточно-специфического маркера глиального фибриллярного кислого белка (астроцит-специфичный промотор);

Case12 - зеленый флуоресцентный Са²⁺-чувствительный белок;

MCS - сайт множественного клонирования;

WPRE - посттранскрипционный регуляторный элемент вируса гепатита сурка;

11781 bp - длина последовательности плазмиды, равная 11781 нуклеотиду.

На фиг. 3 представлено схематическое изображение генетической конструкции для специфической трансфекции астроцитов. Генетическая конструкция LVV-Neuron-EGFP содержит:

RRE - rev-отвечающий элемент;

GAL4 - химерный трансактиватор, состоящий из части трансактиваторного домена мышиного белка NF-κBp65, слитого с ДНК-связывающим доменом белка дрожжей GAL4;

CMV - промотор цитомегаловируса человека;

SYN - промотор человеческого синапсина-1 (нейрон-специфичный промотор);

EGFP - зеленый флуоресцентный белок; MCS - сайт множественного клонирования;

WPRE - посттранскрипционный регуляторный элемент вируса гепатита сурка;

11100 bp - длина последовательности плазмиды, равная 11100 нуклеотидам.

Способ осуществляется следующим образом.

Заявленный способ основан на использовании клеточно-специфического промотора для управления одновременной экспрессией нужного трансгена и сильного искусственного активатора транскрипции для усиления транскрипции посредством связывания специфических сайтов связывания, введенных в последовательность промотора. Таким образом, задействуют два клеточно-специфических промотора: один для транскрипции интересующего трансгена, другой для экспрессии трансактиватора.

Используемые генетические конструкции представляют собой разнонаправленную лентивирусную векторную систему, содержащую усиленные в части транскрипционной активности промотор человеческого синапсина-1 (SYN, клеточно-специфический промотор для нейронов) и промотор компактного глиального фибриллярного кислого белка (GFAP, клеточно-специфический промотор для астроцитов), а также в противоположной ориентации промотор, полученный из цитомегаловируса человека (CMV), расположенный в нуклеотидной последовательности выше клеточно-специфических промоторов. Таким образом, создают синтетические разнонаправленные промоторы, фланкированные двумя генами экспрессионной кассеты. Искусственный активатор транскрипции транскрибирует 5'-конец кассеты. Последовательность кассеты, расположенная по ходу транскрипции, управляет синтезом интересующего гена.

Генетическая конструкция для специфической трансфекции астроцитов (Фиг. 2) построена с использованием лентивирусного вектора на основе самоинактивированного ВИЧ и включает, по меньшей мере,

rev-отвечающий элемент (RRE),

химерный трансактиватор, состоящий из части трансактиваторного домена мышиного белка NF-κBp65, слитого с ДНК-связывающим доменом белка дрожжей GAL4 (GAL4),

промотор цитомегаловируса человека (CMV) в противоположной ориентации,

укороченный промотор клеточно-специфического маркера глиального фибриллярного кислого белка (GFAP) для трансфекции астроцитов,

генетически кодируемый кальциевый индикатор - Case12 в качестве маркерного гена,

сайт множественного клонирования (MCS),

посттранскрипционный регуляторный элемент вируса гепатита сурка (WPRE) для повышения титра вектора и улучшения экспрессии трансгена.

Генетическая конструкция для специфической трансфекции нейронов (Фиг. 3) построена с использованием лентивирусного вектора на основе самоинактивированного ВИЧ и включает, по меньшей мере,

rev-отвечающий элемент (RRE),

химерный трансактиватор, состоящий части трансактиваторного домена мышиного белка NF-κBp65, слитого с ДНК-связывающим доменом белка дрожжей GAL4 (GAL4),

промотор цитомегаловируса человека (CMV) в противоположной ориентации,

промотор человеческого синапсина-1 (SYN) для специфической трансфекции нейронов,

флуоресцентный белок - EGFP в качестве маркерного гена,

сайт множественного клонирования (MCS),

посттранскрипционный регуляторный элемент вируса гепатита сурка (WPRE) для повышения титра вектора и улучшения экспрессии трансгена.

Продуцирование генетических конструкций осуществляется в культуре клеток HEK293FT посредством транзиентной котрансфекции сконструированной генетической конструкции, упаковочного вектора pNHP и плазмиды pHEF-VSVG, кодирующей оболочку.

Трансфецирование культур первичных астроцитов и нейронов, полученных из трехдневных крысят и выращиваемых для астроцитов - на модифицированной Дульбекко среде Игла (DMEM) (с 4,5 г/л глюкозы, глутамином, и пируватом) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки, для нейронов - на модифицированной Дульбекко среде Игла (DMEM) (с 4,5 г/л глюкозы, глутамином, и пируватом) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки и 5% лошадиной сыворотки, осуществляют следующим образом: за день до трансфекции клетки высеивали в 24-луночные культуральные планшеты с плотностью клеток 5×10⁴ на лунку и инкубировали в течение 8-14 часов, после чего астроциты и нейроны трансфецировали разработанными генетическими конструкциями (каждая культура соответствующей конструкцией) в присутствии полибрена (8 мкг/мл), промывали фосфатным буфером и культивировали в течение 40-52 часов в среде DMEM.

Использование заявленного изобретения позволяет осуществлять клеточно-специфическую трансфекцию различных популяций клеток нервной ткани, в частности, астроцитов и нейронов с целью ингибирования и (или) активирования нейрогенеза, а также осуществлять визуализацию in vitro трансфецированных клеток за счет встраивания в разрабатываемую конструкцию флуоресцентных маркеров.