СПОСОБ ГЕНЕТИЧЕСКОГО КОНТРОЛЯ ЭКЗОЦИТОЗА НА ОСНОВЕ ГЕНЕТИЧЕСКИХ КОНСТРУКЦИЙ ДЛЯ ТРАНСФЕКЦИИ КЛЕТОК АСТРОГЛИИ

Область техники

Изобретение относится к области молекулярной биологии для генетического контроля экзоцитоза посредством специфической трансфекции клеток астроглии с целью контроля везикулярного транспорта астроглии, в частности для исследования нейродегенеративных заболеваний, может быть использовано в области медицины для коррекции нейродегенеративных заболеваний.

Уровень техники

Известно изобретение «Пептиды, ингибирующие нейронный экзоцитоз» (патент РФ №2461568), при котором используется химическое соединение, обладающее способностью регулировать нейронный экзоцитоз.

Недостатком этого способа является то, что с помощью описанного в нем химического соединения (пептида) не представляется возможным контролировать везикулярный транспорт астроглии, стимулировать или ингибировать экспрессию определенных (целевых) генов в популяциях клеток астроглии мозга, а также экспрессировать в клетках астроглии генетически кодируемый кальциевый индикатор.

Известно изобретение «Усовершенствование генетических конструкций для повышения эффективности антивич терапии» (патент РФ №2533817), при котором используется сходное по своей природе с используемым в заявленном способе химическое соединение, обладающее антивирусной активностью в отношении вируса иммунодефицита человека.

Недостатком этого способа является то, что с помощью описанного в нем химического соединения (генетической конструкции) не представляется возможным контролировать экзоцитоз, а также стимулировать или ингибировать экспрессию определенных (целевых) генов в популяциях клеток астроглии мозга, экспрессировать в клетках астроглии генетически кодируемый кальциевый индикатор.

Наиболее близким по технической сущности заявляемому способу, выбранному в качестве прототипа, является изобретение «Пептиды, ингибирующие нейронный экзоцитоз» (патент РФ №2461568, 2007 г., C07K 14/705, C07K 14/47, C07K 7/06, C07K 7/08, A61K 8/64, A61Q 19/08), при котором используется химическое соединение, обладающее способностью регулировать нейронный экзоцитоз, а также лечить состояния, требующие регулирования нейронного экзоцитоза, таких как, например, мышечная спастичность, асимметрия лица и/или морщины на лице.

Недостатком этого способа является отсутствие возможности контроля везикулярного транспорта астроглии, стимуляции или ингибирования экспрессии таргетных генов в популяциях клеток астроглии мозга, а также экспрессии в них генетически кодируемого кальциевого индикатора.

Раскрытие изобретения

Задачей заявляемого изобретения является реализация механизма таргетного генетического контроля экзоцитоза путем специфической трансфекции клеток астроглии с целью контроля везикулярного транспорта астроглии, в частности, для исследования нейродегенеративных заболеваний, может быть использовано в области медицины для коррекции нейродегенеративных заболеваний.

Поставленная задача решается тем, что в способе генетического контроля экзоцитоза на основе генетических конструкций для трансфекции клеток астроглии, при котором используют химическое соединение, обладающее способностью контролировать экзоцитоз на основе модификации везикул клеток астроглии головного мозга, для создания нового типа терапии нейродегенеративных заболеваний, согласно изобретению, разрабатывают способ генетического контроля экзоцитоза на основе генетической конструкции для трансфекции клеток астроглии, обладающей способностью осуществлять таргетный контроль внутриклеточных каскадов, ассоциированных с везикулярным транспортом астроглии, а также экспрессировать в них генетически кодируемый кальциевый индикатор.

Для эффективного таргетного контроля внутриклеточных каскадов, ассоциированных с везикулярным транспортом астроглии, предусмотрено встраивание в последовательность генетической конструкции клеточно-специфического промотора, обеспечивающего синтез интересующих генов только в определенном типе клеток.

Для таргетного контроля внутриклеточных каскадов, ассоциированных с везикулярным транспортом астроглии, предусмотрено встраивание в последовательность генетической конструкции генов, экспрессия которых активируется под воздействием химических стимулов, что, в свою очередь, приводит к повышению концентрации определенных веществ, оказывающих влияние на выделение глиотрансмиттеров, которые, в свою очередь, оказывают влияние на жизнедеятельность нейронов, а также обеспечивающих возможность визуализировать отдельные клетки головного мозга за счет флуоресценции.

Причем в наиболее близком по технической сущности заявляемому способу используется химическое соединение, отличное по своему строению от вирусного вектора и не способное встраиваться в геном клеток мозга.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1 представлено схематическое изображение генетической конструкции на основе лентивирусного вектора, специфически трансфецирующего клетки астроглии для осуществления генетического контроля экзоцитоза. Генетическая конструкция для трансфекции клеток астроглии с целью генетического контроля экзоцитоза содержит:

LTR - длинный терминальный повтор лентивируса;

GAL4 - химерный трансактиватор, состоящий из части трансактиваторного домена мышиного белка NF-κBp65, слитого с ДНК-связывающим доменом белка дрожжей GAL4;

CMV - минимальный промотор цитомегаловируса человека;

GFAP - компактный промотор глиального фибриллярного кислого белка;

GCaMP3 - последовательность, кодирующая генетически кодируемый кальциевый индикатор GCaMP3;

WPRE - посттранскрипционный регуляторный элемент вируса гепатита сурка.

На фиг. 2 представлена карта плазмиды LVV-GFAP-GCaMP3, характеризующейся:

5' LTR (1-75) - длинный терминальный повтор лентивируса;

SV40 poly(A) сигнал (75-196) - сигнал полиаденирования SV40;

GAL4 (1045-1485) - химерный трансактиватор, состоящий из части трансактиваторного домена мышиного белка NF-κBp65, слитого с ДНК-связывающим доменом белка дрожжей GAL4;

CMV (1586-1624) - промотор цитомегаловируса человека;

GFAP (1743-2425) - укороченный промотор клеточно-специфического маркера глиального фибриллярного кислого белка (астроглия-специфичный промотор);

GCaMP3 (2448-3920) - последовательность, кодирующая генетически-кодируемый кальциевый индикатор GCaMP3;

ECFP (2748-3017) - усиленный синий флуоресцентный белок;

EGFP (3039-3470) - усиленный зеленый флуоресцентный белок;

Кальмодулин (3477-3920) - кальцийсвязывающий белок;

WPRE (3923-4540) - посттранскрипционный регуляторный элемент вируса гепатита сурка;

bGH poly(A) сигнал (4741-4965) - сигнал полиаденилирования;

ori (6309-6897) - высококопийная точка начала репликации плазмид Co1E1/pMB1/pBR322/pUC;

AmpR (7068-7928) - последовательность, обеспечивающая устойчивость к ампецилину, карбенциллину и другим связанным антибиотикам;

AmpR промотор (7929-8033) - промотор, обеспечивающий резистентность к ампициллину;

RRE (8534-8767) - rev-отвечающий элемент ВИЧ-1, который обеспечивает Rev-зависимый экспорт мРНК из ядра в цитоплазму;

3' LTR (8768-9186) - длинный терминальный повтор лентивируса;

9186 bp - длина последовательности плазмиды, равная 9186 нуклеотидам.

Осуществление изобретения

Способ осуществляется следующим образом.

Заявленный способ основан на применении генетических конструкций для трансфекции клеток астроглии, несущих клеточно-специфический промотор для управления одновременной экспрессией нужного трансгена и сильный искусственный активатор транскрипции для усиления транскрипции посредством связывания специфических сайтов связывания, введенных в последовательность промотора. Таким образом, задействуют два клеточно-специфических промотора: один для транскрипции интересующего трансгена, другой для экспрессии трансактиватора.

Используемые генетические конструкции представляют собой разнонаправленную лентивирусную векторную систему (Фиг. 1), содержащую усиленные в части транскрипционной активности промотор компактного глиального фибриллярного кислого белка (GFAP, клеточно-специфический промотор для клеток астроглии), а также в противоположной ориентации промотор, полученный из цитомегаловируса человека (CMV), расположенный в нуклеотидной последовательности выше клеточно-специфического промотора. Таким образом, создают синтетические разнонаправленные промоторы, фланкированные двумя генами экспрессионной кассеты. Искусственный активатор транскрипции транскрибирует 5'-конец кассеты. Последовательность кассеты, расположенная по ходу транскрипции, управляет синтезом интересующего гена.

Генетическая конструкция для специфической трансфекции клеток астроглии с целью генетического контроля экзоцитоза (Фиг. 2) построена с использованием лентивирусного вектора на основе самоинактивированного ВИЧ и включает, по меньшей мере,

rev-отвечающий элемент (RRE),

химерный трансактиватор, состоящий из части трансактиваторного домена мышиного белка NF-κBp65, слитого с ДНК-связывающим доменом белка дрожжей GAL4 (GAL4),

промотор цитомегаловируса человека (CMV) в противоположной ориентации,

укороченный промотор клеточно-специфического маркера глиального фибриллярного кислого белка (GFAP) для трансфекции клеток астроглии,

генетически-кодируемый кальциевый индикатор (ГККИ) (GCaMP3 и др.) в качестве маркерного гена,

посттранскрипционный регуляторный элемент вируса гепатита сурка (WPRE) для повышения титра вектора и улучшения экспрессии трансгена.

Генетическая конструкция для трансфекции клеток астроглии LVV-GFAP-GCaMP3 была сконструирована на основе усовершенствованного лентивирусного шаттл-вектора pTYF-SW-Linker, содержащего в своей последовательности сайты узнавания для нескольких эндонуклеаз рестрикции (SceI, EcoRV, NheI, SalI, SmaI, BamHI, SacII, SpeI, MluI, XhoI, NotI, ClaI, I-SceI, KpnI), Rev-чувствительный элемент ВИЧ-1, обеспечивающий Rev-зависимый экспорт мРНК из ядра в цитоплазму, CMV-TATA-TAR - рекомбинантный непосредственно-ранний промотор/энхансер цитомегаловируса с заменой в 5'-U3 длинного концевого повтора, gag - белок вирусного ядра, cPPT-FLAP - последовательность центрального полипуринового тракта и сайт полиаденилирования.

Для повышения титра вектора и улучшения экспрессии трансгена в структуру шаттл-вектора pTYF-SW-Linker, предварительно гидрализованного по сайтам NotI и ClaI, был клонирован амплифицированный фрагмент посттранскрипционного регуляторного элемента вируса гепатита сурка (WPRE) - последовательность SEQ ID N1. Для чего нами была проведена полимеразная цепная реакция со специфически подобранными праймерами WPRE_Forw (CCGCTCCCGTTATTT) WPRE_Rev (TTTATTGCCCTCGCC). Полученную плазмиду нарабатывали в препаративных количествах для последующего клонирования в нее ГККИ.

С помощью пары праймеров GCaMP3_Forw (AGAGCTGGTTTAGTGA) и CCaMP3_Rev (AATGTGGTATGGCTG), используя в качестве матрицы плазмиду pN1-Lck-GCaMP3 (Clontech), был амплифицирован ПЦР-продукт длиной 1570 п.о. - последовательность SEQ ID N2, которую клонировали pTYF-SW-Linker-WPRE, предварительно гидролизованный по сайтам Bg1II и NotI. Полученную плазмиду нарабатывали в препаративных количествах для последующего клонирования в нее клеточно-специфичного промотора.

Для специфической трансфекции клеток астроглии головного мозга в последовательность генетической конструкции был клонирован клеточно-специфический промотор глиального фибриллярного кислого белка (GFAP). ПЦР-продукт длиной 704 п.о. - последовательность SEQ ID N3 была получена посредством амплификации с помощью пары праймеров GFAP_Forw (GACGCTGCTCTGACA) и GFAP_Rev (CTGAGACTGGGGAAT), используя в качестве матрицы плазмиду pGfaABC1D-nLac. Полученный таким образом фрагмент нуклеотидной последовательности был клонирован в pTYF-SW-Linker-WPRE-GCaMP3, предварительно гидролизованный по сайтам MluI и SpeI.

Таким образом, нами была получена SEQ ID N4 генетическая конструкция - LVV-GFAP-GCaMP3 для трансфекции клеток астроглии и экспрессирования в них ГККИ GCaMP3.

Продуцирование генетической конструкции осуществляется в культуре клеток HEK293FT посредством транзиентной ко-трансфекции сконструированной генетической конструкции, упаковочного вектора pNHP и плазмиды pHEF-VSVG, кодирующей оболочку лентивируса.

Заявленный способ генетического контроля экзоцитоза на основе генетических конструкций осуществляется посредством трансфецирования культур первичных клеток астроглии, полученных из трехдневных крысят и выращиваемых на модифицированной Дульбекко среде Игла (DMEM) (с 4,5 г/л глюкозы, глутамином, и пируватом) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки. При этом за день до трансфекции клетки высеивают в 24-луночные культуральные планшеты с плотностью клеток 5×10⁴ на лунку и инкубируют в течение 8-14 часов, после чего клетки астроглии трансфецируют разработанной генетической конструкцией -SEQ ID N4 - LVV-GFAP-GCaMP3 в присутствии полибрена (8 мкг/мл), промывают фосфатным буфером и культивируют в течение 40-52 часов в среде DMEM. После чего контроль экзоцитоза осуществлялся посредством индуцирования каскадов пуринорецепторов Р2Х и P2Y, β-адренорецепторов. Покровные стекла с клетками отмывают от ростовой среды DMEM полным сбалансированным раствором Хенкса (HBSS) при комнатной температуре и переносятся в экспериментальную ячейку. Клетки оставляют в покое на 30 минут при комнатной температуре. Экспериментальная ячейка переносится на предметный столик лазерного сканирующего конфокального микроскопа и устанавливаются настройки возбуждающего флуоресценцию лазера и светофильтров для регистрации флуоресценции. Для активации Р2У зависимых Са²⁺ каскадов в экспериментальную ячейку добавляется 10 мкМ 2-MeSATP и регистрируется изменение уровня флуоресценции. Для активации Р2Х зависимых Са²⁺ каскадов в экспериментальную ячейку добавляется 10 мкМ а,b-мАТФ и регистрируется изменение уровня флуоресценции. Для активации р-адренергических зависимых Са²⁺ каскадов в экспериментальную ячейку добавляется 50 мкМ изопротеренола и регистрируется изменение уровня флуоресценции.

Использование заявленного изобретения позволяет осуществлять генетический контроль экзоцитоза на основе генетических конструкций (для трансфекции клеток астроглии (SEQ ID N4 -LVV-GFAP-GCaMP3), поскольку в разработанную генетическую конструкцию встроен генетически-кодируемый кальциевый индикатор - GCaMP3, что позволяет контролировать характерный для клеток астроглии Са²⁺ - зависимый экзоцитоз. Кроме того, использование заявленного изобретения позволяет осуществлять визуализацию in vitro трансфецированных клеток за счет встраивания в разрабатываемую генетическую конструкцию генетически кодируемого кальциевого индикатора.