Способ получения препарата эубиотика Лактобактерин

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способам получения биологически активных препаратов из микробов-антагонистов.

Существуют препараты на основе микробов-антагонистов, объединенных под общим названием эубиотики. Это широко известные и применяемые препараты - колибактерин, лактобактерин, бификол, бифидумбактерин и др. В настоящее время получают признание комплексные - поликомпонентные биопрепараты, включающие как несколько видов микроорганизмов, так и различные вещества с защитным или стимулирующим свойствами (Иммунобиологические препараты. Сб. науч. трудов. Московский НИИ Эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского. – Москва. - 1989 г.). Все эти препараты выпускают лиофильно высушенными, что продлевает их срок хранения и улучшает возможность доставки потребителю (Громова О.А. Антибиотики и эубиотики / Под ред. С.А. Лебедевой. - Иваново, 1991 г.).

Однако в настоящее время известно, что часть лиофильно высушенной культуры лактобактерий из состава препарата Лактобактерин гибнет, не обладая возможностью восстановить свои способности к активным репаративным процессам. Перевод этой части популяции бактериальных клеток к пролиферации способен усилить действие препарата и уменьшить риск потери жизнеспособности входящих в его состав бактериальных клеток. Увеличение количества жизнеспособных клеток в составе препарата будет способствовать успешному преодолению естественных барьеров теплокровного организма (желудочный сок, желчь, ферменты пищеварительного сока), которые также могут негативно воздействовать на степень активности препарата. Поэтому и создаются комплексные бактерийные препараты, способствующие повышению количества активного действующего начала препарата-эубиотика (Пинегин Б.В., Мальцев В.Н., Коршунов В.М. Дисбактериозы кишечника. - М.: Медицина, 1984 г.).

Существует стандартная методика получения препаратов эубиотиков: клетки выращивают в достаточном объеме (не менее 10 /мл), отделяют от жидкой среды центрифугированием, затем суспендируют осадок в стерильном криопротекторе (20% снятое молоко или 24% раствор сахарозы, 10% декстран и т.д.). Суспензию бактерий наливают в ампулы. Ампулы замораживают в течение часа при температуре t=-60÷-65°С, затем высушивают в вакууме 2-3⋅10^-2 мм рт.ст. в течение 18 часов. По окончании высушивания ампулы запаивают (Методы общей бактериологии. Т. 1 / Под ред. Ф. Герхардта. - М.: Мир, 1983 г.). Известны способы получения комплексных бактерийных препаратов. Так, предложен способ получения эубиотика - биоспорина - заявка №96123690/13 от 18.12.96 6 А61К 35/74. Поберий И.А., Харченко А.Т., Кузнецов В.В., Филин В.А., Доронин А.Н., Смирнов В.В., Сорокулова И.Б., где авторы предлагают получать глубинные нативные или концентрированные культуры эубиотиков (Bacillus subtilis и B.licheniformis), стабилизировать культуру сухим обезжиренным молоком, сахарозо-желатиновой защитной средой с последующей лиофилизацией в ампулах. Предложены также способы соединения микроорганизма с основой (патент №2017486 Григорьев А.В. 1994 г. (5 А61К 31/00) Способ получения комплексного бактерийного препарата), где в качестве основы предлагается использовать активированный уголь в виде порошка с размером частиц 30 мкм или использовать лактозу в качестве стимулятора (патент на изобретение №2123343, БИ N 16, ч. 1, с. 34 Алин Б.И., Красильникова О.Б., Ворончихин А.А., Ким Г.Б., Чупринина Р.П., 1998 г.).

Наиболее близким к заявляемому способу, выбранным в качестве прототипа, является способ получения лактобактерина (патент №2200566, опубликовано 20.03.2003, Бюл. №8. Несчисляев В.А., Фадеева И.В. Способ получения лактобактерина). Данный способ предусматривает следующие этапы в технологии получения препарата Лактобактерин:

1. Накопление бактериальной биомассы Lactobacillus acidophilus сахарозо-желатиновой среде.

2. Добавка обезжиренного молока как дополнительного компонента защитной среды в состав бактериальной суспензии перед высушиванием с последующей расфасовкой в стерильные ампулы.

3. Лиофильная сушка.

Однако препарат, получаемый при использовании данной технологии, отличается довольно низкой биологической активностью, что выражается в необходимости оптимизации способа получения препарата и повышение его биологической активности путем дополнительного введения лактобактерий вида L.acidophilus. Поэтому мы предлагаем способ получения активного препарата Лактобактерин, где в качестве стимулятора выступают фармакологические формы высшего съедобного гриба шиитаке (Lentinus edodes), а именно натуральный сок, порошок.

Шиитаке - высший съедобный гриб, относящийся к классу Basidiomycetes, культивируется в мире в промышленных масштабах (Псурцева Н.В., Белова Н.В. Биотехнология, 1994. - N 7. - с. 35-39). Данный гриб используется в качестве основы лекарственных препаратов, обладающих карциностатическим, противоэкзэматозным действием (патент Японии (IP) №60-23392). Известно противоопухолевое действие препаратов мицелия и питательной среды, в которой выращивали мицелий гриба (ЕПВ Европейский патент №0088151). Кроме того, в медицине базидиальные грибы используются как продуценты антибиотических субстанций. Особо заслуживает внимания обнаруженный факт, что наблюдается вирицидная активность и в отношении ретровирусов (СПИД). Активные вещества высших базидиальных грибов представлены терпенойдами, пуринами, хинонами, пиримидинами, производными фенолов (Феофилова Е.П. Прикладная биохимия и микробиология, 1998, том 34, N 2. - с. 131-138).

Данные о биологически активных компонентах, содержащихся в грибах шиитаке, представлены в сборнике научных трудов "Окружающая среда и здоровье человека", Иваново, 1998 г. Биокомпоненты гриба шиитаке обнаруживают иммуномодулирующее действие (Immunopotentiating activity of the water-soluble lignin rich fraction prepared from LEM - the extract of the solid culture medium of Lentinus edodes mycelia / Yamamoto Y., Shirono H., Kono K., Ohashi Y. // Biotechnol Biochem. - 1997. - Vol. 61, N11. - P. 1909-1912; Wang GL, Lin ZB The immunomodulatory effect of lentinan // Yao Hsueh Hsueh Pao 1996. - N2, Vol. 31. - P. 86-90; An in vivo study of hepatic and splenic interleukin-1 beta mRNA expression following oral PSK or LEM administration / Morinaga H, Tazawa K, Tagoh H, Muraguchi A, Fujimaki M // Jpn J. Cancer Res. - 1994. - Vol. 85, N 12. - P. 1298-1303).

Выявлена иммуномодулирующая активность и у сока плодовых тел данного гриба (Сотникова Н.Ю., Куликова (Милькова) Е.В., Мартенова А.А., Кузнецов О.Ю. Влияние биокомпонентов гриба Lentinus edodes на иммунокомпетентные клетки in vitro у женщин с вагинальным кандидозом / Тезисы 3-й научной международной конференции "Дни иммунологии в Санкт-Петербурге", 18-20 Мая 1999 г. - с. 137.).

Технический результат заключается в разработке способа получения препарата эубиотика Лактобактерин, содержащего L.acidophilus, с большим терапевтическим эффектом за счет увеличения количества жизнеспособных клеток и присутствия в его составе природных биологически активных компонентов, оказывающих положительное воздействие на различные системы и органы макроорганизма.

Сок получали путем механического измельчения плодовых тел гриба, из полученной биомассы выжимали сок, который подвергался стерилизации путем ультрафильтрации, например, с использованием каолиновых свечей Шамберлана с размером пор 0,12 мкм (Муравьев И.А. Технология лекарственных форм. М.: Медицина. - 1998 г.). Порошок гриба шиитаке получали путем высушивания свежих грибов при температуре 70°С до влажности 10-12% и размалывали до размера частиц 0,2-1,0 мм, а затем стерилизовали вместе с питательной средой лактобакагар (производство ФГУН ГНЦПМиБ г. Оболенск) в автоклаве при температуре 121±1°С в течение 15 минут.

Основные этапы предлагаемого технологического процесса по заявляемому способу: выращивание биомассы L.acidophilus, получение концентрированной биомассы путем центрифугирования, декантация надосадочной жидкости; в биомассу добавляют сахарозо-желатозо-молочную защитную среду и стимулятор роста лактобактерий - фармакологические формы высшего съедобного гриба шиитаке (Lentinus edodes), а именно стерильный натуральный сок или порошок в объеме 2,5% от объема защитной среды, расфасовка в ампулы; лиофильная сушка препарата, его маркировка.

Была проведена сравнительная оценка колониеобразующей способности лактобактерий из состава препарата Лактобактерин при посеве на питательную среду - лактобакагар и среду лактобакагар с добавлением стерильного сока или порошка высшего съедобного гриба шиитаке. Для этого биомассу лактобактерий из препарата Лактобактерин высевали на питательную среду из разведения препарата на физиологическом растворе 10³. В опыте в препарат вносили стерильный сок или порошок гриба в объеме 2,5% от объема среды; в качестве контроля использовались разведения препарата без внесения стимулятора (сок или порошок гриба шиитаке). Результаты представлены в таблице.

При внесении сока в среду в меньшей концентрации (менее 2,5% от объема защитной среды) стимулирующий эффект на лактобактерий был выражен незначительно. При увеличении концентрации более 2,5% стимулирующий эффект не изменялся, судя по количеству КОЕ/мл лактобактерий, поэтому считаем нецелесообразным увеличивать дозу стимулятора, так как эффект не изменяется, но увеличивается его расход. При внесении различных фармакологических форм гриба шиитаке достоверно (р<0,05) увеличивается число колониеобразующих единиц лактобактерий с 5,24±0,49 КОЕ* 10³/мл в контроле до 7,32±0,47 КОЕ*10³/мл с соком, а с порошком до 7,66±0,42 КОЕ* 10³/мл. Процент увеличения КОЕ*10³/мл L.acidophilus с добавлением сока по сравнению с контролем составляет 39,7%; порошок с контролем - 46,2%.

Оценивая полученные результаты, считаем, что предлагаемый способ получения активного препарата Лактобактерин значительно повысит терапевтическое действие препарата за счет повышения регенераторной способности лактобактерий после лиофилизации.