Питательная среда для глубинного культивирования мицелия базидиальных грибов

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано, в частности, для приготовления жидкой питательной среды с целью глубинного культивирования высших базидиальных грибов при выращивании их мицелия.

Известна питательная среда для культивирования высших базидиальных грибов на основе пивного сусла (Александрова Е.А., Завьялова Л.А., Терешина в.М., Гарибова Л.В., Феофилова Е.П. Получение плодовых тел и глубинного мицелия Lentinus edodes (Berk.) Sing. [Lentinula edodes (Berk.) Pegler] // Микробиология, 1998. T. 67. №5. C. 649-654).

Недостатком этой среды является небольшой выход биомассы мицелия высших базидиальных грибов из-за отсутствия в ней достаточного количества минеральных веществ и энергетического субстрата (углеводов).

Известно получение посевного мицелия высших базидиомицетов с использованием стерильной жидкой питательной среды, предусматривающей наличие следующих компонентов (г/л воды): пшеничная мука - 10-40 г/л, картофельный отвар - 50-200 г/л, при последующем добавлении в среду стимулятора роста высших базидиомицетов, в качестве которого используют суточную культуру бактерий рода Azospirillum. Приготовленную стерильную питательную среду засевают базидиомицетом, культивируют при 26°С в течение 3-х дней, а затем в полученную мицелиальную биомассу вносят суспензию бактерий Azospirillum из расчета 10 мл суспензии на 200 мл среды и затем осуществляют совместное культивирование базидиомицета и вышеуказанных бактерий в течение 14 дней (RU 2249614 С2, 10.04.2005).

Таким образом, в данной питательной среде одновременно происходит культивирование двух микробных культур - необходимого мицелия высших базидиальных грибов и бактерий рода Azospirillum, стимулирующих развитие данного мицелия.

Основным недостатком описанной питательной среды является ее трудоемкость приготовления, поскольку необходимо дополнительно готовить питательную среду для бактерий и отдельно осуществлять их культивирование, а также последующий асептический подсев бактерий в среду, используемую для получения основного интересуемого мицелия базидиальных грибов.

Здесь происходит резкое возрастание риска нарушения асептических условий из-за многозвенности процесса приготовления окончательного объема стерильной жидкой питательной среды, что может негативно сказаться на гарантии качества данной среды (нарушение стерильности и возможное присутствие в среде посторонних микробов-конкурентов).

Известен способ достижения ингибирования развития микробных контаминатов различной природы в составе питательной среды, предназначенной для последующего культивирования в ней необходимого грибного мицелия за счет внесения в состав питательной среды перекиси водорода в конечной концентрации 0,03-0,15% (R. Rush Wayne, Ph.D. Growing Mushrooms the Easy Way Home Mushroom Cultivation with Hydrogen Peroxide Volume I. Growing Mushrooms the Easy WayHome Mushroom Cultivation with Hydrogen Peroxide Copyright © 1999.).

Недостатки данного способа заключаются в следующем. В концентрациях, совместимых с ростом базидиальных грибов, перекись водорода не будет уничтожать все живые формы плесеневых контаминантов, находящихся в среде, (небольшие источники заражения при этом погибнут) и затем подвергнется быстрому разложению под воздействием энзимов, содержащихся в составе питательной среды.

Наиболее близким по техническому результату к заявляемому объекту является питательная среда на основе пивного сусла, содержащая концентрат («Концентрат КС») наноструктурных частиц коллоидного серебра в водной дисперсии (Герасименя В.П. Инновационные биотехнологии промышленного культивирования грибов Pleurotus ostreatus (Fr.) Kumm, используемых в фармакологической практике для создания медицинских препаратов / В.П. Герасименя, С.В. Захаров, В.М. Брусникин, М.А. Клыков, Л.П. Семашева; под ред. В.П. Герасимени, В.Ю. Полякова. - М.: Институт химической физики имени Н.Н. Семенова РАН, ООО «Инбиофарм», 2013, с. 158-160; 168).

Данная среда содержит добавку наносеребра, которая применяется в технологическом процессе двухстадийного культивирования мицелия Pleurotus ostreatus 1137, в качестве дополнительного вспомогательного средства к способам аэрации питательной среды в колбах Эрленмейера емкостью 750 мл с объемом среды 300 мл, при одновременном создании асептических (стерильных) условий для глубинного культивирования мицелия Pleurotus ostreatus 1137 на качалках в течение 7 суток (I пассаж) и глубинного культивирования ферментативного мицелия (II пассаж) до момента получения его биомассы в увеличенном объеме. Конечная концентрация наносеребра (коллоидного серебра) в водной фазе по данному изобретению составляет 0,005%.

Недостатком данной питательной среды для создания селективности при культивировании мицелия внутри ферментеров с помощью нанодисперсного серебра, взвешенного в водной фазе, является факт отсутствия 100% гарантии ингибирования культур нитчатых грибов-контаминантов, которые могут быть внесены вместе с необходимым для культивирования мицелием интересующего нас гриба.

Известно, что отдельные широко распространенные виды и штаммы нитчатых грибов способны расти в присутствии наноструктурного серебра, находящегося в составе питательной среды (Ребрикова Н.Л. Исследование действия наносеребра и нитрата серебра на рост микроскопических грибов. Перспективы использования наносеребра для защиты реставрационных материалов. Иммунопатология, аллергология, инфектология, Антимикотики и фунгициды. 2010, №1, с. 224).

Данные грибы-конкуренты при случайном попадании (нарушении правил асептики) в среду культивирования могут впоследствии составить серьезную конкуренцию культивируемому мицелию высших базидиальных грибов и вызвать порчу всего используемого объема питательной среды.

Таким образом, практически невозможно добиться гарантированной селективности данной жидкой питательной среды, используемой для длительного культивирования глубинного культивирования мицелия базидиальных грибов. Другими словами, использование только одного коллоидного серебра как компонента, защищающего среду от возможной контаминации микробными агентами (бактериями и грибами), не может полноценно обеспечить длительную защиту всего объема питательной среды во время роста и развития в ней базидиальных грибов.

Задачей заявленного способа является обеспечение селективности среды для глубинного культивирования мицелия базидиальных грибов в течение длительного времени без снижения его жизнеспособности и биологической активности, а также расширение области применения среды по заявляемому изобретению для более широкого круга видов базидиомицетов.

Питательная среда по заявляемому изобретению готовится на основе следующих компонентов: неохмеленное пивное сусло - 8-10%, углеводы - как энергетическая добавка и источник углерода, например глюкоза, мальтоза, фруктоза, сахароза или их смесь (до 4%); мука зерновых в качестве источника азота (до 0,2%) и селективная добавка: перекись водорода и водный раствор коллоидного серебра (ТУ 9392-001-87997849-2009. Раствор серебра коллоидный. Иваново, 2009) в следующей конечной концентрации: перекись водорода 0,01-0,02% и водный раствор коллоидного серебра 0,0015-0,0045%.

Технический результат заключается в том, что добавление перекиси водорода и водного раствора коллоидного серебра в следующей конечной концентрации (перекись водорода 0,01-0,02% и водный раствор коллоидного серебра 0,0015-0,0045%) в состав питательной среды не вызывает ингибирующего воздействия на развитие мицелия базидиомицетов в ходе глубинного культивирования и предотвращает развитие в ходе длительного культивирования в ней случайно попавших из-за возможных нарушений правил асептики конкурентных микроорганизмов.

Пример 1

В жидкую питательную среду, содержащую пивное сусло (8-10%), углеводы (3,5%), муку зерновых (0,15%) и воду (остальное), добавляли перекись водорода - 0,01-0,02% и водный раствор коллоидного серебра - 0,0015%. Данную жидкую питательную среду засевали культурой Pleurotus ostreatus (Jacg.Fr) Kumm (3%) и смесью культур грибов Penicillun chrysogenum, Aspergillus niger van Thieghem, Trichoderma viride Pers.ex. Fr в виде суспензии спор (0,1%) как грибов-конкурентов. Пересев, выращивание культуры плесневых грибов, указанных выше, с оценкой их жизнеспособности выполняли по ГОСТ 9.048 (приложение 3). Суспензию спор, используемую в дальнейшем в эксперименте, готовили по ГОСТ 9.048 (приложение 4) в концентрации 1,0-2,0 млн/см³.

После внесения культур грибов в жидкую питательную среду осуществляли их глубинное совместное культивирование в термостатируемых условиях при 27°С в течение 4 суток. По окончании культивирования выполняли высевы полученного биологически активного материала, полученного в ходе длительного глубинного культивирования, на агаризованную питательную среду в чашках Петри без присутствия ингибиторов роста для нитчатых грибов - пивное сусло-агар и осуществляли культивирование данных чашек в течение 7-10 дней. Контролем в данном эксперименте был аналогичный эксперимент глубинного культивирования Pleurotus ostreatus (Jacg.Fr) Kumm и смеси нитчатых грибов без наличия в среде перекиси водорода и водного раствора коллоидного серебра. На всех чашках опыта в дальнейшем было обнаружено отсутствие роста культур нитчатых грибов и рост культуры гриба Pleurotus ostreatus (Jacg.Fr) Kumm.

Результатом данного эксперимента было подтверждение селективности жидкой питательной среды в отношении гриба Pleurotus ostreatus (Jacg.Fr) Kumm и ингибирование развития нитчатых грибов.

Пример 2

В жидкую питательную среду, содержащую пивное сусло (8-10%), углеводы (3,5%), мука зерновых (0,15%) и воду (остальное), добавляли перекись водорода - 0,01-0,02% и водный раствор коллоидного серебра - 0,0045%. Данную жидкую питательную среду засевали культурой Lentinus edodes (Berk.) Singer (3%) и смесью культур грибов Penicillun chrysogenum, Aspergillus niger van Thieghem, Trichoderma viride Pers. ex. Fr в виде суспензии спор (0,1%) как грибов-конкурентов. Пересев, выращивание культуры плесневых грибов, указанных выше, с оценкой их жизнеспособности выполняли по ГОСТ 9.048 (приложение 3). Суспензию спор, используемую в дальнейшем в эксперименте, готовили по ГОСТ 9.048 (приложение 4) в концентрации 1,0-2,0 млн/см³.

После внесения культур в жидкую питательную среду осуществляли их глубинное совместное культивирование в термостатируемых условиях при 27°С в течение 5-7 суток. По окончании культивирования выполняли высевы полученного биологически активного материала, полученного в ходе длительного глубинного культивирования, на агаризованную питательную среду в чашках Петри без присутствия ингибиторов роста для нитчатых грибов - пивное сусло-агар и осуществляли культивирование данных чашек в течение 10-14 дней. Контролем в данном эксперименте был аналогичный эксперимент глубинного культивирования Lentinus edodes (Berk.) Singer и смеси нитчатых грибов без наличия в среде перекиси водорода и водного раствора коллоидного серебра. На всех чашках в опыте было обнаружено отсутствие роста культуры гриба Penicillun sp.и рост культуры гриба Lentinus edodes (Berk.) Singer.

Результатом данного эксперимента было подтверждение селективности жидкой питательной среды в отношении гриба Lentinus edodes (Berk.) Singer и ингибирования развития всех нитчатых грибов по данному примеру.