СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АУТОПРОБИОТИКА, СОДЕРЖАЩЕГО ЖИВЫЕ БИФИДОБАКТЕРИИ И ЛАКТОБАЦИЛЛЫ

Изобретение относится к медицине, а именно к микробиологии, и может быть использовано для лечения и профилактики заболеваний, связанных с нарушениями состава и функций нормальной микрофлоры человека и животных.

Микрофлора человека и животных является результирующей совокупностью множества микробиоценозов, занимающих многочисленные экологические ниши на коже и слизистых открытых полостей макроорганизма.

В любом микробиоценозе всегда регистрируются постоянно обитающие виды бактерий (автохтонная, индигенная микрофлора), а также транзиторные, случайные виды (аллохтонная микрофлора). Нормальная микрофлора в организме хозяина выполняет многообразные функции - и одной из них является неспецифическая защита. Кроме того, нормальная микрофлора выступает как постоянный действующий тренер нашей иммунной системы, вызывая активацию специфических факторов защиты. При нарушениях неспецифической и специфической защиты происходит возникновение различных патологических процессов. В ходе данных процессов происходит нарушение в составе нормальных микробиоценозов, закрепление в их структуре патогенных и несвойственных для данных микробиоценозов условно-патогенных микроорганизмов, способных привести макроорганизм к возникновению инфекционной болезни. В перечне заболеваний и патологических состояний, связанных с такими микроэкологическими нарушениями, можно отметить инфекционные и неинфекционные заболевания, в том числе так называемые "болезни цивилизации" (атеросклероз, мочекаменная болезнь, аллергические и онкологические заболевания и др.).

В настоящее время в арсенале восстановления нарушенного микробиоценоза человека и животных используются разнообразные приемы, прежде всего - это введение в больших количествах в составе пробиотиков (фармакопейных препаратов или продуктов функционального питания) антагонистических штаммов бактерий - представителей нормальной микрофлоры (бифидобактерий, лактобацилл и др.). Эти бактерийные препараты и продукты функционального питания являются достаточно эффективным лечебно-профилактическим средством, но их эффективность в значительной степени ограничена тем, что используемые в их составе в качестве действующего начала штаммы микроорганизмов - представителей нормальной микрофлоры являются привносимыми (пусть даже и в больших количествах) и чужеродными для организма реципиента. Как результат - вносимые штаммы микроорганизмов из состава пробиотиков, не приживаются на слизистых кишечника и транзитом выводятся из организма. В связи с этим для достижения положительных результатов от введения в макроорганизм пробиотических штаммов требуется их довольно длительное и регулярное применение в высоких концентрациях жизнеспособных клеток бактерий (не менее 10⁷ КОЕ бактерий в 1 дозе) (Шендеров Б.А., Манвелова М.А. Патент РФ №2139070, Бюлл. изобр. №28 от 10.10.1999.).

Известен способ ускорения лечения дисбактериозов кишечника путем введения аутоштаммов бифидобактерий и лактобацилл (Авторское свидетельство СССР N 1286212, A61K 35/74, 30.01.87.).

Аутоштаммы выделяли из фекалий следующим образом: первоначально готовили последовательные десятикратные разведения исследуемого материала до 10^-8 физиологическим раствором. Исследуемый материал из различных разведении засевали на соответствующие питательные среды для определения исходных уровней энтеробактерий, энтерококков, стафилококков, лактобактерий, бифидобактерий. Затем через двое суток материал из изолированных колоний лактобактерий, выросших на среде МРС-4, в наибольшем разведении (10³) и из изолированных колоний бифидобактерий, выросших на питательной среде Блаурокка в наибольшем разведении (10⁷), вновь пересевали на соответствующие селективные питательные среды. Выросшие через 2 суток после второго пассажа изолированные колонии бифидобактерий и лактобактерий пересевали на жидкие среды МРС-4 и Блаурокка для получения биомассы микроорганизмов, которая была использована в виде аутоштаммов для лечения дисбактериоза кишечника.

Недостатками данного способа было использование всего по одному штамму выделенных отдельно бифидобактерий и лактобацилл из всего многообразия видов этих индигенных микроорганизмов (до 5 видов бифидобактерий и более 10 видов лактобацилл). Кроме того, при данном способе выделения аутоштаммов велика вероятность того, что выделенные культуры являются клонами чужеродных для хозяина микроорганизмов, случайно попавших в пищеварительный тракт с пищей и водой, а также возможность случайного отбора среди культур лактобактерий и бифидобактерий не самых активных в антагонистическом отношении штаммов.

Наиболее близким к заявляемому изобретению является «Способ получения аутопробиотика, содержащего живые бифидобактерий и лактобациллы» Шендерова Б.А. и Манвеловой М.А. - Патент РФ №2139070, Бюлл. изобр. №28 от 10.10.1999.

Предложенный способ позволяет использовать в качестве аутопробиотика полученную биомассу выделенных аутобактерий для восстановления микрофлоры кишечника человека и ценных экземпляров животных и птиц. Аутоштаммы бифидобактерий и лактобацилл выделяют одновременно в виде естественных комплексов кишечника человека и/или животных путем деконтаминации содержимого кишечника от посторонней микрофлоры за счет многократных разведении исследуемого материала жидкой питательной средой, содержащей селективные агенты, пригодной для выделения и культивирования бифидобактерий и лактобацилл, с последующим удалением аллохтонной микрофлоры путем добавления к биоматериалу, разведенному до 10^-6, сыворотки крови того же индивидуума, у которого был взят образец кишечного содержимого, последующего его культивирования в течение 48 часов при 38°C и дальнейшего пересева полученной биомассы на жидкие питательные среды для культивирования бифидобактерий и лактобацилл без добавления селективных агентов.

Существенным недостатком данного способа является использование сыворотки крови исследуемых индивидуумов для последующего ее применения при выделении совокупного микробиценоза бифидобактерий и лактобацилл. Общеизвестно, что многие люди испытывают сильное стрессовое состояние в ходе процедуры взятия крови из вены. Именно данный факт заставляет их отказаться от выделения бактериальных штаммов аутобиотического препарата (его создания), и, в конечном счете, вообще от его использования в коррекции нарушений микрофлоры своего организма.

Цель настоящего изобретения - получение аутопробиотика, содержащего комплекс живых бифидобактерий и лактобацилл - представителей индигенной микрофлоры кишечника хозяина, предназначенный для восстановления нарушенной микроэкологии его кишечника.

Поставленная цель достигается тем, что бифидобактерий и лактобациллы выделяют одновременно в виде естественных комплексов кишечника человека и/или животных путем деконтаминации содержимого толстого кишечника от посторонней микрофлоры за счет многократных разведении исследуемого материала жидкой питательной средой, пригодной для выделения и культивирования бифидобактерий и лактобацилл, с последующим удалением аллохтонной микрофлоры путем добавления к биоматериалу, разведенному до 10^-6, стерильного разведения на физиологическом растворе слюны того же индивидуума, у которого был взят образец кишечного содержимого, последующего его культивирования в течение 48 часов при 38°C и дальнейшего пересева полученной биомассы на жидкие питательные среды для культивирования бифидобактерий и лактобацилл без добавления селективных агентов.

Полученная после культивирования биомасса представляет собой аутопробиотик, содержащий бифидобактерий и лактобациллы, являющиеся истинными представителями индигенной микрофлоры хозяина и он может быть использован как препарат для восстановления и коррекции микроэкологических нарушений кишечника макроорганизма (человека и животных).

Способ осуществляют поэтапно следующим образом:

Этап 1. Пробоподготовка.

Для получения аутопробиотика необходимо отобрать у одного и того же организма фекалии и слюну. Особенности отбора проб описаны ниже.

Взятие материала для последующего выделения аутокультур микроорганизмов из содержимого толстой кишки выполняют от последнего приема пище не менее 8 часов. Накануне исследования необходимо соблюдать диету без употребления в составе пищи раздражающих компонентов (перец, горчица, алкоголь и т.п.), а также других способных повлиять на качественный и количественный состав микробиоценоза кишечника. Проба фекалий отбирается в стерильный контейнер, который до и после отбора взвешивается. Это необходимо знать для последующих расчетов по количественной оценке концентраций микроорганизмов.

Слюну забирают утром, через час после еды. Перед забором слюны ротовую полость ополаскивают дистиллированной водой или теплым бледно-розовым раствором перманганата калия, затем через 5-10 минут начинают отбор слюны в чистую пробирку или флакон в объеме 1,0-5,0 мл. Впоследствии весь объем полученной слюны переносят в пробирку с физиологическим раствором в соотношении 1:1 до общего объема до 5 мл, центрифугируют 10 минут при 1500 об/мин.

После центрифугирования аккуратно, стараясь не взмутить осадок, надосадочную часть отбирают в чистую емкость. Затем выполняют ультрафильтрацию полученного раствора слюны через мелкопористые фильтры с диаметром пор не более 0,22 мкм для получения стерильного раствора слюны.

Этап 2. Деконтаминация биоматериала от транзиторной микрофлоры.

Первоначально делают последовательную десятикратную раститровку исследуемого образца отобранного биоматериала любой жидкой питательной средой, пригодной для выделения и культивирования бифидобактерий и лактобацилл, например МРС или БС-средой, с добавлением селективных агентов.

Готовят два ряда таких разведении с соблюдением правил асептики. Первый ряд состоит из пробирок до разведения 10^-9 и он предназначен для оценки общего количественного содержания бифидобактерий и лактобацилл в исходном биоматериале. Второй ряд состоит из пробирок с биоматериалом до разведения 10^-6 и он предназначен для получения аутопробиотика.

Причины конечного выбора данного титра (10^-6) определяются следующим. Установлено, что иммуноглобулины (и, прежде всего IgA) препятствуют адгезии к стенкам кишечника и тем самым способствуют выведению чужеродных микроорганизмов во внешнюю среду. Подтверждением роли IgA в предотвращении колонизации слизистых посторонними микроорганизмами является тот факт, что 99% бактерий - представителей индигенной анаэробной флоры не покрыты секреторными иммуноглобулинами.

В то же время обнаружен феномен иммунологической толерантности к индигенной микрофлоре (Van der Vaaij D. Evidence of imminoregulation of the composition of intestinal microflora and its practical consequences. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis., 1988, vol. 7.), когда энтеробактерии, энтерококки и другие аэробные бактерии кишечника полностью покрыты IgA. Обнаружено, что слизистые желуд очно-кишечного тракта начинают реагировать на вводимые микроорганизмы синтезом IgA только тогда, когда количество микроорганизмов составляет 10⁶ и более клеток на грамм содержимого тонкой кишки (Lorenz A. Interaction of some species of the gut microflora and their influence on the amount of IgA in the gut lumen of gnotobiotic rats. Abstr. XII Intern. Sympos. Gnotobiology, Honolulu, June 23-28, 1966.).

Учитывая этот факт можно считать, что микроорганизмы в концентрациях менее 10⁶ КОЕ/мл являются малозначимыми для оказания воздействия на физиологические изменения в организме данного живого организма.

Использование слюны исследуемого макроорганизма в процессе пробоподготовки определяется более высокой концентрацией секреторного иммуноглобулина IgA (115,3-299,7 мг/мл) по сравнению с содержанием его в других биологических жидкостях (сыворотка крови 1,69-5,67 мг/мл, моча 5,2-24,2 мг/мл, слезная жидкость 58,46-93,62, вагинальный секрет 57,87-112,19 мг/мл, программа Медиалог для оценки клинических результатов исследования). (www.medialog.ru, Справочник по иммунотерапии для практического врача. Под ред. Симбирева А.С., изд-во "Диалог" Санкт-Петербург, 2002, 479 с.), а также пониженной биологической опасностью при получении и использовании.

Этап 3. Деконтаминации биоматериала от чужеродных микроорганизмов и получение аутопробиотика.

В составе микробиоценоза кишечника возможно существование в большом количестве (превышающем разведения 10⁶ КОЕ/г) аллохтонных (транзиторных) микроорганизмов, в том числе и патогенных видов. Для того, чтобы исключить их накопление впоследствии выполняют следующие манипуляции. В пробирку с биоматериалом второго ряда разведения 10^-6 добавляют стерильный раствор слюны того же индивидуума, подготовленный согласно пробоподготовке по этапу 1 (добавляемый объем 50% объема исследуемого образца). Полученную пробу перемешивают и помещают на инкубацию при 38°C на 48 часов. Затем пробу вынимают из термостата, определяют количество бифидобактерий, лактобацилл и наличия посторонней микрофлоры, делая контрольные высевы. После проверки при отсутствии посторонней микрофлоры проводят пересев материала (1:10) в жидкую питательную среду для культивирования бифидобактерий и лактобацилл без добавления селективных агентов и культивируют при 38°C в течение 48 часов. Полученная биомасса является аутопробиотиком, содержащим комплекс штаммов бифидобактерий и лактобактерий, характерных для данного индивидуального организма. Контроль за микробным представительством штаммов полученного аутопробиотика осуществляют согласно общепринятом методом посева на различные селективные питательные среды Эндо, Плоскирева, МПА и ТГС для определения посторонней микрофлоры - на этих средах рост в аэробных условиях должен отсутствовать. Для оценки количественного содержания бифидобактерий и лактобацилл в полученном аутопробиотике отдельно делают посевы на среды МРС и бифидум - среду с добавлением соответствующих селективных агентов. Все определения ведут общепринятыми методами. Таким образом, предложен способ получения аутопробиотика, содержащего живые бифидобактерий и лактобациллы на основе естественного комплексного микробиоценоза бифидобактерий и лактобацилл толстой кишки человека и животных. Полученный по данному способу аутопробиотик может быть использован для лечения дисбактериоза и заболеваний, связанных с нарушениями нормальной микрофлоры кишечника у человека, а также ценных экземпляров животных и птиц.