Результат интеллектуальной деятельности: Способ получения карбоксипептидазы В из поджелудочной железы свиньи

Изобретение относится к биотехнологии, точнее к способу получения фермента карбоксипептидазы В (кВ) из свиной поджелудочной железы, и может быть использовано в производстве генно-инженерного инсулина.

Известен способ получения кВ из поджелудочной железы свиньи, включающий механическую гомогенизацию исходного сырья, автолиз, получение ацетонового порошка из автолизата, экстракцию, осаждение сульфатом аммония и последующую очистку целевого продукта двумя последовательными хроматографиями на ДЕАЕ-целлюлозе (А.с. №1551742, МКИ C12N 9/48, 1987).

Недостатком способа является использование на первом этапе органических растворителей (ацетон, диэтиловый эфир) и невысокая удельная активность конечного препарата (107-155 ед./мг белка).

Известен способ получения кВ из поджелудочной железы млекопитающих, предлагающий механическую гомогенизацию исходного сырья, автолиз, экстракцию при 50-75°С и дробное осаждение сульфатом аммония 320-416 г/л и диализ (патент RU №1487817, МКИ C12N 9/48, 1989).

Недостатком способа является невысокий выход конечного препарата и сложность диализа с использованием целлюлозных трубок.

Известен способ получения кВ из поджелудочной железы северных оленей (патент SU №1833427, МКИ C12N 9/64, 1991), включающий гомогенизацию, экстракцию, двухступенчатое подкисление до рН 5,2-5.5, затем до рН 3,8-4,2, осаждение ацетоном, повторное осаждение этанолом, лиофилизацию.

Недостатками способа являются сложность получения исходного сырья и использование органических растворителей.

Известен способ получения кВ из поджелудочной железы свиньи (патент RU №2177997, МПК C12N 9/14, 2002), включающий механическую гомогенизацию исходного сырья, автолиз, экстракцию при 60°С, двухступенчатое осаждение сульфатом аммония, повторную термообработку, хроматографию на оксиапатите, повторное осаждение сульфатом аммония, диализ, хроматографию на ДЕАЕ-сефарозе.

Недостатком способа является сложность масштабирования стадий повторного осаждения сульфатом аммония и диализа с использованием диализных трубок.

Наиболее близким является способ получения карбоксипептидазы В из свиной поджелудочной железы (патент RU №2354696, 2007), включающий гомогенизацию, автолиз, экстракцию, осаждение сульфатом аммония, диализ и очистку целевого продукта двукратной хроматографией на Q-сефарозе.

Недостатком способа является сложность масштабирования диализа с использованием диализных трубок.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является масштабирование способа получения карбоксипептидазы В и повышение общего выхода ферментативной активности за один недельный производственный цикл при достижении уровня удельной активности соответствующей требованиям производства генно-инженерного инсулина.

Технический результат достигается тем, что предложен способ получения карбоксипептидазы В из поджелудочной железы свиней, предусматривающий гомогенизацию животного сырья, автолиз, экстракцию двойным объемом буферного раствора, содержащих 0,01 М KH₂PO₄ и 0,001 М ZnCl₂ при температуре 65°С, осаждение экстракта сульфатом аммония из расчета 350 г/л экстракта, центрифугирование, растворение осадка в 0,005 М трис-HCl-буфере, содержащем 0,001 М ZnCl₂, фильтрацию через стекловолоконный фильтр и картонный фильтр при температуре 4°С, разведение фильтрата в 0,005 М трис-HCl-буфере, содержащем 0,001 М ZnCl₂, с последующей ультрафильтрацией в тангенциальном потоке на мембранном кассетном модуле из полиэфирсульфона с пределом отсечения 20 кДа с последующей двукратной ионообменной хроматографией на колонке с UNO Sphere, уравновешенной 0,005 М трис-HCl-буфером, содержащем 0,1 М NaCl, и на колонке с Macro Prep Q, уравновешенной тем же буфером.

Отличием предлагаемого способа является определение условий эффективного освобождения от солей, пептидов и продуктов липолиза с помощью фильтрации через стекловолоконный и картонный фильтры и ультрафильтрации в тангенциальном потоке на мембранном кассетном модуле при очистке препарата кВ в количествах до 4 г за один цикл до удельной активности 150-170 ед./мг.

Пример 1.

12 кг свиных желез дважды гомогенизируют в бытовой мясорубке, помещают в пластиковую емкость и инкубируют для автолиза в течение ночи на шейкере при 18°С.

К полученному автолизату добавляют 2 объема (24 л) 0,01 М KH₂PO₄, рН 6,5, 0,001 М ZnCl₂ и инкубируют в водном термостате 15 минут при 65°С, перемешивая верхнеприводной механической мешалкой при 200 об/мин. Полученный экстракт охлаждают в ванне с проточной холодной водой и центрифугируют при 4500 об/мин, 4°С, 60 минут.

К полученному центрифугату при перемешивании добавляют сульфат аммония (из расчета 350 г/л экстракта) и расчетное количество сухого карбоната натрия для поддержания рН около 6,5 и инкубируют при 4°С в течение ночи. Осаждают образовавшийся преципитат центрифугированием при 4500 об/мин, 40 минут и осадок растворяют в 3-4 л 0,005 М трис-HCl буфера, рН 7,6 содержащего 0,001 М ZnCl₂.

Полученный раствор фильтруют через стекловолоконный фильтр (ТУ 9471 001 00212038-00) под вакуумом 0,05 МПа и получают фильтрат 1.

Фильтрат 1 далее пропускают через «Картон фильтровальный для пищевых жидкостей, тип Т, сорт высший, ГОСТ 12290-89» под вакуумом 0,1 МПа и получают фильтрат 2. Фильтрат 2 разводят в 3 раза буфером 0,005 М трис HCl, рН 7,6, 0,001 М ZnCl₂, охлажденным до 4°С, и подвергают ультрафильтрации в тангенциальном потоке на мембранном кассетном модуле в системе АСФ-009 «Владисарт», используя ультрафильтрационный кассетный модуль «Владисарт» из полиэфирсульфона МКМ 460020 01 У с пределом отсечения 20 кДа и площадью фильтрации 0,1 м². Разбавление буфером 0,005 М трис HCl, рН 7,6, 0,001 М ZnCl₂, охлажденным до 4°С, раствора на входе в модуль производят до тех пор, пока плотность не достигнет значения 0,960 кг/м³ по ареометру. Процесс проводят при 4°С. Хроматография на UNO Sphere Q.

Отдиализованный фильтрат наносят на колонку с UNO Sphere Q (BioRad) объемом 300 мл, предварительно уравновешенную буфером (ТБ) 0,005 М трис-HCl, рН 7,6, содержащим 0,001 М ZnCl₂. Колонку промывают 900 мл данного буфера, элюируют кВ 0,1 М NaCl в ТБ. Собирают расчетные фракции кВ с удельной активностью более 100 ед/мг белка, помещают в диализную трубку и диализуют в течение ночи против 10-кратного объема ТБ. Процесс проводят при 4°С.

Повторная хроматография на Macro Prep О (BioRad).

Отдиализованную фракцию кВ наносят на колонку объемом 150 мл, предварительно уравновешенную ТБ, промывают 450 мл данного буфера. Элюируют кВ 0,07 М NaCl в ТБ. Собирают расчетные фракции кВ с удельной активностью более 150 ед./мг. Процесс проводят при 4°С.

Готовый препарат хранят замороженным при -20°С.

Выход составляет 3,5 г препарата кВ с удельной активностью 167 ед./мг белка.

Пример 2.

12 кг свиных желез дважды гомогенизируют в бытовой мясорубке, помещают в пластиковую емкость и инкубируют для автолиза в течение ночи на шейкере при 18°С.

К полученному автолизату добавляют 2 объема (24 л) 0,01 М KH₂PO₄, рН 6,5, 0,001 М ZnCl₂ и инкубируют при 65°С в водном термостате в течение 15 минут при перемешивании верхнеприводной механической мешалкой при 200 об/мин. Полученный экстракт охлаждают в ванне с проточной холодной водой и центрифугируют при 4500 об/мин, 4°С, 60 минут.

К полученному центрифугату при перемешивании добавляют сульфат аммония (из расчета 350 г на литр экстракта) и расчетное количество сухого карбоната натрия для поддержания рН около 6,5 и инкубируют при 4°С в течение ночи. Осаждают образовавшийся преципитат центрифугированием при 4500 об/мин, 40 минут и осадок растворяют в 3-4 л 0,005 М трис-HCl буфера, рН 7,6, содержащего 0,001 М ZnCl₂.

Полученный раствор фильтруют через стекловолоконный фильтр (ТУ 9471 001 00212038-00) под вакуумом 0,05 МПа и получают фильтрат 1.

Фильтрат 1 далее пропускают через «Картон фильтровальный для пищевых жидкостей, тип Т, сорт высший, ГОСТ 12290-89» под вакуумом 0,1 МПа и получают фильтрат 2. Фильтрат 2 разводят в 3 раза буфером 0,005 М трис HCl, рН 7,6, 0,001 М ZnCl₂, охлажденным до 4°С, и подвергают ультрафильтрации в тангенциальном потоке на мембранном кассетном модуле в системе АСФ-009 «Владисарт», используя ультрафильтрационный кассетный модуль «Владисарт» из полиэфирсульфона МКМ 460010 01 У с пределом отсечения 10 кДа и площадью фильтрации 0,1 м². Разбавление буфером 0,005 М трис HCl, рН 7,6, 0,001 М ZnCl₂, охлажденным до 4°С, раствора на входе в модуль производят до тех пор, пока плотность не достигнет значения 0,960 кг/м³ по ареометру. Процесс проводят при 4°С. Хроматография на UNO Sphere Q. Отдиализованный фильтрат наносят на колонку с UNO Sphere О (BioRad) объемом 300 мл, предварительно уравновешенную буфером (ТБ) 0,005 М трис-HCl буфером, рН 7,6, содержащим 0,001 М ZnCl₂. Колонку промывают 900 мл данного буфера, элюируют кВ 0,1 М NaCl в ТБ. Собирают расчетные фракции кВ с удельной активностью более 100 ед/мг белка, помещают в диализную трубку и диализуют в течение ночи против 10-кратного объема ТБ. Процесс проводят при 4°С.

Повторная хроматография на Macro Prep Q (BioRad). Отдиализованную фракцию кВ наносят на колонку объемом 150 мл, предварительно уравновешенную ТБ, промывают 450 мл данного буфера. Элюируют кВ 0,07 М NaCl в ТБ. Собирают расчетные фракции кВ с удельной активностью более 150 ед/мг. Процесс проводят при 4°С. Готовый препарат хранят замороженным при -20°С. Выход за один недельный производственный цикл составляет 6,0 г препарата кВ с удельной активностью 155 ед./мг белка.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет из 12 кг исходного сырья очистить 3-4 г препарата карбоксипептидазы В с удельной активностью 150-170 ед./мг или 450000-680000 единиц за один цикл. По сравнению с прототипом (патент RU №2354696, 2007) способ позволяет за один недельный производственный цикл получать в 30 раз больше общей активности фермента с удельной активностью, соответствующей требованиям производства генно-инженерного инсулина.