Способ получения наночастиц полистирольных ионообменников для доставки противоопухолевых препаратов

Изобретение относится к области наномедицинских технологий, а именно к созданию нанотранспортеров лекарственных веществ для противоопухолевой химиотерапии.

Снижение эффективности противоопухолевой химиотерапии при лечении онкологических больных связано прежде всего с прогрессированием злокачественных новообразований и появлением в ходе опухолевой прогрессии клеток, обладающих так называемой множественной лекарственной устойчивостью, связанной с активацией мембранных транспортеров, выводящих противоопухолевые вещества из клеток. Кроме того, ряд лекарственных веществ, применяемых в терапии онкологических заболеваний, обладает низкой гидрофильностью, а также оказывает токсическое действие на здоровые ткани организма. Эти проблемы могут быть преодолены путем использования суспензий наноразмерных ионитов, доставляющих лекарственные вещества в опухолевые клетки.

Известен способ получения наночастиц для доставки лекарственного вещества [WO 2014124329, кл. A61K 47/48, опубл. 2014].

В способе используют сферические магнитные частицы железа или оксида железа, в том числе покрытые золотом или оксидом кремния.

Для терапии онкологических заболеваний закрепление лекарственного вещества на магнитных наночастицах происходит за счет использования связующего компонента, например эфира.

Под воздействием внешнего нагрева или электромагнитного поля частицы нагреваются, что вызывает внутримолекулярную циклизацию связующего, приводя к высвобождению лекарственного вещества.

Способ позволяет осуществлять контролируемое высвобождение лекарственного вещества, тем самым сводя к минимуму побочные эффекты и повышая терапевтическую эффективность обычных фармацевтических веществ.

Недостатком описанного способа является необходимость использования дополнительного внешнего воздействия для получения терапевтического эффекта. Еще одним недостатком способа является то, что некоторые формы магнитных частиц могут быть токсичны.

Известен способ получения наноконтейнеров, фармацевтических составов и комплексов наноносителей лекарственного вещества для терапии онкологических заболеваний [US 20140147508, кл. A61K 31/513; A61K 47/48; A61K 9/51, опубл. 29.05.2014].

В известном способе получают наноносители противоопухолевых веществ, состоящие из сферической металлической наночастицы и полинуклеотида для закрепления лекарственного вещества.

Данный способ позволяет оказывать терапевтическое воздействие на опухолевые клетки за счет контролируемого высвобождения лекарственного вещества в зоне поражения.

Недостатком способа является то, что наноконтейнеры не осуществляют доставку лекарственного вещества непосредственно внутрь опухолевых клеток, а выход лекарственного вещества осуществляется в непосредственной близости от клеток, что снижает эффективность метода за счет включения в опухолевых клетках механизмов множественной лекарственной устойчивости.

Известен способ [Ingo Ott, Modulation of the Biological Properties of Aspirin by Formation of Bioorganometallic Derivative, Angewandte Chemie International Edition 2009, 48, No. 6, 1160-1163], в котором получают комплекс кобальта с ацетилсалициловой кислотой, обладающий ингибирующим действием по отношению к росту опухолевых клеток.

Известен способ подавления опухолевого роста с использованием соли окта-4,5-карбоксифталоцианина Со и аскорбиновой кислоты [патент RU 2106146, кл. A61K 31/375, A61K 31/555, A61K 45/00, A61P 35/00, A61P 43/00, A61K 31/40, опубл. 1998 г.]. Этот способ позволяет добиться ингибирования пролиферации опухолевых клеток человека in vitro, а также торможения роста опухоли и увеличения средней продолжительности жизни животных с перевивными злокачественными опухолями in vivo. Комплекс - натриевая соль - окта-4,5-карбоксифталоцианина кобальта, который получил название "Терафтал" (ТФ), испытывается и используется в настоящее время в качестве лекарственного средства для лечения злокачественных новообразований в составе бинарной каталитической системы. Бинарная каталитическая система "ТФ+АК" оказывает выраженное противоопухолевое действие in vitro и in vivo.

Недостатком описанных способов с применением ионов кобальта является низкая эффективность транспортировки лекарственного вещества, так как на одну наночастицу лиганда приходится один ион кобальта.

Наиболее близким способом к предложенному является способ получения наночастиц нитрида бора для доставки противоопухолевых веществ [РФ 2565432, кл. A61K 31/00, A61K 47/48, A61K 9/51, B82B 3/00, опубл. 2015].

Способ характеризуется тем, что синтезируют сферические наночастицы нитрида бора размером 50-300 нм с развитой наружной поверхностью методом химического осаждения из газовой фазы с применением реакционного и транспортного газов, а также порошковых смесей, состоящих из аморфного бора и реагентов-окислителей. Проводят диспергирование агломератов полученных наночастиц нитрида бора методом ультразвуковой обработки, насыщение наночастиц нитрида бора противоопухолевым веществом методом сорбции и промывку наночастиц в дистиллированной воде.

Способ позволяет улучшать эффективность противоопухолевой химиотерапии за счет повышения активности поглощения клетками наноконтейнеров с противоопухолевым веществом, предотвращения токсичности наноконтейнеров для клеток.

Недостатком описанного способа является малая емкость частицы-транспортировщика, определяемая ее внешней поверхностью.

Технический результат, достигаемый в предложенном изобретении, заключается в повышении эффективности противоопухолевой химиотерапии, за счет повышения активности поглощения клетками наноконтейнеров с противоопухолевым веществом, предотвращения токсичности наноконтейнеров для клеток вследствие применения диспергированных наночастиц полистирольных ионообменников размером 50-300 нм с развитыми наружной и внутренней поверхностями.

Указанный технический результат достигается следующим образом.

Способ получения наночастиц полистирольных ионообменников для доставки противоопухолевых веществ включает предварительное получение водной суспензии наночастиц размером 50-300 нм, обладающих ионообменными свойствами, путем предварительной подготовки ионита его размола, добавления воды, отделения путем центрифугирования суспензии частиц, характеризующейся Н-формой для катионита или ОН-формой для анионита и отсутствием в воде коионов, и определение концентрации функциональных групп ионита, содержащихся в водной суспензии и последующее насыщение наночастиц суспензии противоопухолевым препаратом путем добавления ионогенного лекарственного вещества к суспензии в количестве, не превышающем эквивалентное количество функциональных групп ионита, при этом коионами, добавляемыми вместе с ионогенным лекарственным веществом, являются ионы OH^- или Cl^- для катионита и Н⁺ или Na⁺ для анионита.

Предпочтительно в качестве ионита использовать массово выпускаемые зернистые ионообменные смолы.

Целесообразно предварительную подготовку ионита проводить путем замачивания ионита в дистиллированной воде до полного набухания, отмывку от взвешенных частиц, перевод ионита в Н-форму для катионита или ОН-форму для анионита и его сушку, размол подготовленного ионита проводить в две стадии, первую стадию размола до десятков мкм проводят роторным дезинтегратором, а вторую стадию до требуемой дисперсности проводят в керамической шаровой мельнице.

Целесообразно размол во второй стадии проводить в течении 100-200 часов, водную суспензию готовить из расчета 1-3 л дистиллированной воды на 1 л исходного крупного ионита, а центрифугирование суспензии частиц проводить со скоростью не менее 7000-10000 об/мин в три стадии, первую из которых проводят в течение 1-3 минут, вторую в течение 10-20 минут и третью в течение 60-120 минут.

Способ получения наночастиц полистирольных ионообменников (НИО) для доставки противоопухолевых веществ включает несколько стадий.

Получение водной суспензии наночастиц

Исходный зернистый ионит (товарный) готовится путем обработки кислотой (катионит) или щелочью (анионит) для перевода в нужную ионную форму (в форму соответствующих ионов воды), отмывается водой, сушится при комнатной температуре, размалывается до десятков мкм с помощью роторного дезинтегратора.

Вторая ступень размола до требуемой дисперсности проводится с помощью керамической шаровой мельницы (время размола 100-160 часов), затем из продукта размола приготавливается водная суспензия из расчета 1-3 л дистиллированной воды на 1 л исходного крупного ионита, отделяется крупная фракция путем отстаивания в течение 60 мин и декантации, затем выделяется суспензия НИО с размером частиц 50-300 нм путем постадийного центрифугирования (1-3 минут, 10-20 минут и 60-120 минут) со скоростью 7000-10000 об/мин и отсечения центрифугата от осадка.

В ряде экспериментов были получены наносуспензии сульфокатионита (НИК) и высокоосновного анионита (НИА) с матрицей сополимера стирола и 8% дивинилбензола.

Полученная суспензия наночастиц характеризуется Н-формой для катионита или ОН-формой для анионита и отсутствием в воде коионов. Коионами по отношению к иониту называются ионы, имеющие тот же знак, что и заряд функциональных групп ионита, например анионы по отношению к катиониту; под отсутствующими здесь подразумеваются компоненты с концентрацией не выше 10^-5 М.

2. Определение ионообменной емкости суспензии НИО. Определение емкости, т.е. концентрации функциональных групп (кратко: концентрации) суспензии НИО проводится методом прямого или обратного кислотно-основного титрования с индикатором фенолфталеином. Емкость суспензий составляла от 7 до 40 мМ.

3. Определение весовой концентрации суспензий. Проводится весовым методом путем отбора точного объема суспензии в предварительно взвешенную посуду, высушивании досуха при температуре 60-70°C и определении веса сухого остатка по разности. Значения весовых концентраций находились в диапазоне 1.5-4.5 г/л.

4. Приготовление конечного продукта - суспензии НИО в форме иона лекарственного вещества путем добавления к суспензии наноионита с функциональными группами заданной полярности противоопухолевого ионогенного лекарственного вещества (ИЛВ) противоположной полярности путем добавления его соли с коионами к суспензии в количестве, измеряемом в г-экв, не превышающем эквивалентное количество функциональных групп ионита, причем коионами могут быть ионы ОН^- для катионита в Н-форме и Н⁺ для анионита в ОН-форме, так как они нейтрализуются ионами формы ионита, или Cl^- для катионита и Na⁺ для анионита, уравновешиваемые соответственно натриевой щелочью и соляной кислотой до нейтральной реакции без превышения по концентрации 0.9%-ного раствора NaCl.

В качестве лекарственного вещества в химиотерапии могут использоваться различные неорганические и органические соли, состоящие из целевого вещества ИЛВ и сопутствующего нелекарственного коиона. Присутствующие в них нелекарственные коионы могут приносить вред организму, во избежание чего в качестве коионов могут быть ионы ОН^- или Cl^- для катионита в Н-форме и Н⁺ или Na⁺ для анионита в ОН-форме, уравновешиваемые соответственно натриевой щелочью и соляной кислотой до нейтральной реакции без превышения по концентрации 0.9%-ного раствора NaCl.

Пример 1. Приготовление и испытание образца нано-ионита катионообменного (НИК), обработанного катионами доксорубицина («Образец НИКДОР»)

1. Получение НИК. 1 л катионита КУ-2-8 (Кемерово, ГОСТ 203-01-74, 2011 г.) замачивают в 800 мл дистиллированной воды до полного набухания, отмывают от взвешенных частиц. Набухший катионит переносят в колонку, соединенную с напорной емкостью с 1 М раствором HCl. Пропускают 10 л HCl со скоростью 1.6 л/ч, после чего отмывают дистиллированной водой до нейтральной реакции по универсальному индикатору. Катионит подсушивают на фильтровальной бумаге и затем размалывают порциями в роторном дезинтеграторе с ножами из нержавеющей стали. Продукт первичного размола помещают в барабан шаровой мельницы объемом 3 л и производили размол со скоростью вращения барабана 30 об/мин в течение 120 ч. По окончании размола из барабана извлекают шары и заливают содержимое 1,5 л бидистилированной воды, все тщательно перемешивают, разливают поровну в 3 высоких литровых стакана и оставляют отстаиваться на 1,5 ч. Самая крупная фракция садилась на дно стаканов. Взвесь над осадком декантируют и еще раз разделяют после отстаивания. Осадки после декантации сушат для повторного размола. Полученную взвесь центрифугируют со скоростью 7000 об/мин в 3 стадии. Каждый раз центрифугат отделяют от осадка и собирают в чистую емкость, осадок сушат для повторного размола. 1 стадия - центрифугирование в течение 1 мин, 2 стадия - 15 мин, 3 стадия - 60 мин. Центрифугат последней стадии представлял собой суспензию нанокатионита в форме ионов водорода НИК(Н) с размером частиц 50-300 нм. Размеры частиц определяли методом электронной микроскопии.

2. Титруют суспензию НИК(Н) раствором 0.05 М NaOH в присутствии фенолфталеина, ее концентрация - 0.007 мг-экв/мл.

3. Определяют весовую концентрацию НИК. Она составила 1.35 г/л.

4. Насыщение наносуспензии доксорубицином. Доксорубицин C₂₇H₂₉O₁₁ - молекулярный вес 580 г, умеренно растворим (гидролизуется) в воде с образованием протонированной катионной формы с коионом ОН^-, устойчив в слабокислой и нейтральной среде (диапазон pH от 3 до 7). Рассчитывают количество суспензии, эквивалентное 50 мг доксорубицина: 50/580/0,007=12,3 мл суспензии. Используют препарат «Доксорубицин - ЛЭНС», один флакон которого содержал 10 мг доксорубицина и 40 мг маннита. К 12,3 мл суспензии НИК(Н) добавляют содержимое 5 флаконов лекарственного вещества «Доксорубицин - ЛЭНС». Растворяют порошок при нагревании в водяной бане и через сутки фильтруют через бумажный фильтр «синяя лента». Не растворившаяся часть порошка составляла по весу 10% от исходного веса каждого компонента. Исходя из этого в полученной модифицированной суспензии концентрация доксорубицина - 50⋅0,9 / 12,3=3,7 г/л, маннита - 200⋅0,9 /12,3=14,6 г/л.

5. Испытание образца НИКДОР in vitro

Инкубируют линию клеток рака шейки матки HeLa в среде DMEM с 10% эмбриональной сывороткой и 40 мкг/мл гентамицина при 37°С в 25 см² плоскодонных пластиковых культуральных флаконах. Для проведения эксперимента клеточный монослой переводят в суспензию трипсинизацией и помещают в 96-луночные плоскодонные планшеты COSTAR. Вносят исследуемые соединения до конечных разведений в лунках (4 на точку) 10-100х. 10-кратные разведения получают внесением по 20 мкл непосредственно образца в 200 мкл суспензии клеток и ресуспендированием, последующие - последовательным переносом по 20 мкл суспензии из лунок с 10х в следующие, получая разведения - 100х-1000х. Через 24 ч (согласно рекомендациям [1]) учитывали жизнеспособность клеток при помощи МТТ теста, отражающего функцию митохондрий.

Влияние веществ на жизнеспособность клеток определяют микроколориметрическим методом - МТТ-тестом [Mosmann Т]. Это простой и удобный метод для скрининга. Основан на способности ферментов дыхательной цепи митохондрий (сукцинатдегидрогеназа) живых клеток восстанавливать бледно-желтый водорастворимый 3-(4,5-диметилтиазолил-2)-2,5-дифенилтетразолий бромистый (МТТ) в голубые кристаллы формазана, не растворимые в воде, но растворимые в диметилсульфоксиде.

Количество образовавшегося формазана (определяемое колориметрическим методом после его растворения в органических растворителях) характеризует интенсивность окислительно-восстановительных процессов в опухолевых клетках, т.е. их жизнеспособность.

После проведения инкубации в культуру клеток добавляют раствор МТТ (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-2Н-тетразолиум бромид) («ПанЭко») до конечной концентрации 0,5 мг/мл. Клетки инкубируют 4 часа, удаляют среду инкубации и растворяют образовавшиеся кристаллы формазана органическим растворителем (DMSO). Планшет встряхивают в течение 20 минут, затем проводят оценку оптической плотности образцов на планшетном сканере Униплан™ АИФР-01 при длине волны λ=530 нм. На основании средних значений из 4 параллельных измерений для каждой концентрации вещества вычисляют процент выживаемости от соответствующего контроля.

Результат испытания образца №3 in vitro на клетках культуры HeLa в условиях инкубации в течение 48 часов представлен в таблице 1.

Вывод: эффективность доксорубицина, импрегнированного водной суспензией наночастиц НИК, в 3-6 раз выше по сравнению с той же дозой чистого доксорубицина. Такой эффект связан с концентрированием лекарственного компонента на наночастицах ионита. Это позволяет снизить концентрацию токсичного лекарства при химиотерапии в 3-6 раз.

Пример 2. Приготовление и испытание образца наноионита анионообменного (НИА), насыщенного гексанитрокобальтатом в растворе NaCl (CONAN)

1. Получение суспензии наноионита в форме ионов OH^- НИА(OH). 1 л анионита замачивают в 800 мл дистиллированной воды до полного набухания, отмывают от взвешенных частиц. Набухший анионит переносят в колонку, соединенную с напорной емкостью с 1 М раствором НСl. Пропускают НСl до отсутствия железа в пробах фильтрата (контроль по роданиду аммония). После этого анионит отмывают дистиллированной водой до нейтральной реакции по универсальному индикатору. Перевод анионита в ОН-форму: через колонку пропускают 1 М раствор NaOH до выравнивания концентраций на входе и выходе колонки. После этого анионит отмывают дистиллированной водой до нейтральной реакции по универсальному индикатору. Далее анионит подсушивают и подвергают размолу и постадийному центрифугированию согласно методике, описанной в примере 1, п.1.

2. Методом обратного титрования определяют концентрацию НИА(ОН). К точной аликвоте НИА (V_НИА) добавляют избыточное количество соляной кислоты (C_HClV_HCl), тщательно перемешивают и спустя 5 мин оттитровывают избыток кислоты щелочью известной концентрации (C_NaOH) (индикатор фенолфталеин). Концентрацию НИА рассчитывают по формуле:

,

она составила 0.0021 М.

3. Определяют весовую концентрацию НИА - 1.21 г/л.

4. Натриевая соль комплекса кобальта, Na₃[(Co(NO₂)₆], гексанитрокобальтат натрия, хорошо растворима в воде с нейтральной реакцией с образованием 3-зарядных анионов лекарственного вещества - гексанитрокобальтата и коионов натрия. Раствор гексанитрокобальтата натрия готовят из перекристаллизованной соли. Готовят целевой продукт CONAN в виде суспензии НИА в форме анионов гексанитрокобальтата в растворе NaCl. 25 мл суспензии НИА(ОН) с концентрацией 2.1 мМ нейтрализовали 105 мкл 0,5 М НСl, затем добавляют 105 мкл свежеприготовленного 0,5 г-экв/л раствора Na₃[(Co(NO₂)₆].

5. Испытание образца CONAN in vitro с концентрацией C=2.1 мМ на клетках HeLa (см. Пример 1, п. 5).

Наибольший цитостатический эффект на клетки HeLa оказывал препарат CONAN с концентрацией 0.1 мМ. Такая концентрация может создаваться при введении изучаемого вещества в 4 л крови в количестве 200 мг.