Способ определения концентрации селеноорганических соединений в биологически активных добавках

Предлагаемое изобретение относится к исследованиям в области аналитической химии, а именно к способам анализа биологически активных веществ, входящих в состав селенидсодержащих БАДов, в частности к анализу селенидсодержащих биологически активных добавок к пищевому рациону человека. Способ может быть использован в качестве стандартного теста при сертификации качества биологических добавок, поступающих в продажу через розничную аптечную сеть и специализированные магазины продуктов для здорового образа жизни.

Селен - жизненно важный, необходимый микроэлемент с уникальными биологическими функциями и широким спектром биологического действия его соединений. Он играет важную антиоксидантную роль в биосфере. В организмах существует класс Se-содержащих и Se-зависимых ферментов. Их синтез регулируется генетически, и они осуществляют важные биохимические и физиологические функции. Недостаток селена в среде и организмах сопровождается развитием ряда сердечно-сосудистых и опухолевых заболеваний человека. Поэтому в большинстве стран мира проводится коррекция селенодефицита с учетом статуса микроэлемента в среде (Ермаков В.В., Ковальский В.В. Биологическое значение селена. М.: Наука 1974. 300 с.). Согласно современным представлениям, многие болезни, присущие преклонному возрасту, а также общее физическое и умственное ослабление организма в значительной мере обусловлены химически сверхактивными свободными радикалами. В настоящее время уделяется заметное внимание так называемому "оксидативному стрессу" - окислительному повреждению биологических молекул за счет образования избытка свободных радикалов. Окисление углеводородов, спиртов, жиров и других веществ кислородом воздуха представляет собой цепной процесс. Основные реакции в липидной фазе биологических мембран и липопротеинов крови можно продемонстрировать с помощью схемы (где L - триглицерид, GSH - восстановленный глутатион):

Биологическая роль селена связана с тем, что ряд его соединений наряду с витаминами Е и С, а также каротиноидами и биофлавоноидами является антиоксидантом. Витамины, флавоноиды, коэнзимы не могут заменить селен. Он входит в состав глутатионпероксидазы (ГПО) - фермента, обезвреживающего самые опасные и агрессивные свободные радикалы, именно те, с которыми другим антиоксидантам справиться не удается.

Именно с открытием ГПО и выяснением ее биологической функции связан значительный прогресс в понимании роли селена в организме. Считается что от 30 до 60% селена, содержащегося в организме, находится в этом ферменте. И именно этот фермент является главным депо селена в организме. ГПО - одно из 30-ти селенсодержащих биологически активных веществ. Каждая из четырех известных к настоящему времени глутатионпероксидаз содержит в одной молекуле четыре остатка Se-цистеина.

Все селеноцистеины кодируются UGA (УГА)-триплетом. Все четыре фермента экспрессируются различными генами и иммунологически различны. Три из них - внутриклеточные (питоплазматические. мембраносвязанные) и одна - внеклеточная (плазматическая). Единственная внеклеточная ГПО состоит из 4-х субъединиц с молекулярной массой 24 кДа и отличается функционально, иммунологически и структурно от остальных глутатионпероксидаз. Основные ткани, секретирующие внеклеточную ГПО, - почки, плацента, бронхи, легкие. Эти органы находятся под наибольшим влиянием окислительного стресса и нуждаются в дополнительной защите от пероксидов и кислородных радикалов. ГПО - мощные антиоксидантные ферменты, участвующие, кроме того, и в других функциях: регулирование биосинтеза простагландинов, простациклинов, лейкотриенов и тромбоксанов. Если селена недостаточно, то это наиважнейшее звено антиоксидантной защиты не работает. Недостаток селена не только снижает иммунитет и работоспособность, но и приводит к развитию сердечнососудистых и онкологических заболеваний, накоплению тяжелых металлов и преждевременному старению, сахарному диабету, болезням суставов, мужскому бесплодию и родовой слабости у женщин.

Известны селенорганические соединения разных классов:

- Алкилселениды (C₂H₅)₂Se

- Арилселениды (С₆Н₅)₂Se

- Диалкилселениды RSe - SeR₁

- Галогеноселениды - фенилселенобромид C₆H₅SeBr

- Селенолы (аналоги спиртов) этанселенол C₂H₅SeH

- Селенолаты (аналоги алкоголятов) - фенилселенолат натрия C₂H₅SeNa

- Селенокетоны - диметилселенокетон CH₃CSeCH₃

- Селеноальдегиды типа RCOSeH

- Селенокарбоновые кислоты типа RCOSeH

Некоторые классы соединений содержат связанный с селеном кислород. Существуют разнообразные гетероциклические соединения, в состав которых входит селен.

В настоящее время большое распространение получили БАДы на основе диметилдипиразолилселенида (препараты группы «Селекор»), вводимые, в частности, в состав поваренной соли, приведенной ниже формулы с содержанием селена до 32-33%.

Существует проблема контроля содержания «Селекора» в поваренной соли как на стадии производства и сертификации на соответствие заявленным показателям качества БАД, так и в процессе их хранения. Кроме того, в настоящее время предложено реализовать через аптечную сеть несколько препаратов, содержащих селекор (например, «Селекор-макси», таблетки массой 200 мг, сертификат №004287.Р.643.05.2002), или выпускаемая в республике Беларусь питьевая вода «Богатырь». Однако контроль содержания активно действующего вещества практически отсутствует. Количество селекора в БАД и препаратах на его основе контролируют косвенно по общему содержанию микроэлемента. При этом не учитывается присутствие естественного содержания селена в других формах.

Для определения микроколичеств селена в биоматериалах используют различные методы: спектрофлуориметрию, нейтроноактивационный анализ, атомно-абсорбционную спектрометрию (ААС), эмиссионную спектроскопию с индуктивно связанной плазмой, масс-спектрометрию с индуктивно связанной плазмой, газовую и жидкостную хроматографию, рентгенофлуоресцентный анализ и другие.

Известен способ определения селена методом атомной адсорбции [Морачевский Д.Ю., Церковницкая И.А. Основы аналитической химии редких элементов. Ленинград, Издательство ленинградского университета, 1980 г., стр. 182].

Для легкоионизируемых элементов, таких как селен, используются безэлектродные газоразрядные лампы с микроволновым возбуждением. Чувствительность определения селена по линии 196,1 нм с применением воздушно-ацетиленового и воздушно-пропанового пламени 1 мкг/мл при тщательно выбранных условиях определения (природы пламени, силы тока, характеристики лампы, скорости поступления воздуха и ацетилена). Посторонние элементы и анионы, присутствующие в 1000-кратных количествах к определяемому элементу, увеличивают поглощение света на 5-15%. Солевой состав должен быть идентичен в анализируемых и стандартных условиях. Введение селена в пламя в виде соединения в органическом растворителе повышает чувствительность метода в 1,5 и 2,4 раза для ацетиленовоздушного и водородно-воздушного пламени.

Посредством известного способа измеряют концентрации общего (валового) селена в различных материалах (природные воды, почвы, растения) после концентрирования воды или разложения проб почв и растений минеральными кислотами.

Известен электрохимический способ определения миллиграммовых количеств селеноорганических ионообразующих соединений методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на примере селенолов (RSeH), диселенидов (RSe-SeR₁) и селенилсульфидов (RS-ых SeR₁) в стандартных метанольно-водных растворах с применением колонки C₁₈. В данном случае использовался электрохимический детектор при -1,10 вольт относительно Ag/AgCl электрода с использованием подвижной фазы ацетонитрил/5 М фосфатный буфер с рН 2,9 с добавкой октилсульфата натрия (40 мг/л) в объемном соотношении 5:95 [Н.М.А. Killa and D.L. Rabenstein. Detemination of selenols, Diselenides, and Selenyl Sulfides by Reversed-Phase Liguid Chromatografy with Electrochemical Detection. Anal.Chem., 1988. Vol. 60. P. 2283].

Этот метод эффективен в основном для селенолов, обладает малой чувствительностью, позволяет определять только вещества типа селенолов в растворах стандартных веществ. Он не приемлем для измерения концентраций диметилдипиразолилселенида как в чистых растворах, так и в БАДах на основе селекора, а также в пищевой поваренной соли с добавками указанного неионообразующего соединения ввиду малой чувствительности анализа.

Рассмотренные выше способы определения «валового» селена и отдельных его соединений предназначены для измерения общего содержания микроэлемента и не позволяют определять собственно концентрации диметилдипиразолилселенида.

Наиболее близким способом к предложенному является способ измерения концентраций неорганических и селеноорганических соединений методом ВЭЖХ [Ермаков В.В., Тютиков С.Ф., Хушвахтова С.Д., Данилова В.Н., Боев В.А., Барабанщикова Л.Н., Чудинова Е.А. Особенности количественного определения селена в биоматериалах // Вестник Тюменского государственного университета, 2010. №3. С. 206-214].

В способе материал разлагается смесью азотной и хлорной кислот и все соединения селена окисляются до селенит-иона с последующим комплексообразованием его с 2,3-диаминонафталином (ДАН). Концентрацию образовавшегося комплекса (пиазоселенола) измеряют спектрофлуориметрически после отделения его от продуктов окисления посредством ВЭЖХ на колонке С 18. В качестве элюента используют смесь гексана и этанола (1:1, по объему) с расходом 1 мл/мин.

Критическими стадиями анализа биоматериалов с использованием ДАН является подготовка образца, переведение его в раствор, стадия восстановления Se (VI) до Se (IV) и рН раствора при комплексообразовании селенита с ДАН (образование пиазоселенола). Образцы (0,1-1,0 г), как правило, выдерживают с концентрированной азотной кислотой не менее 12 часов. После этого вводят хлорную кислоту или в сочетании с фтористоводородной кислотой и концентрируют минерализат при температуре испарения азотной кислоты. Затем температуру смеси повышают и нагревают до появления паров хлорного ангидрида. После охлаждения смеси вносят 1 мл бидистиллированной воды и вновь нагревают раствор до паров хлорного ангидрида. На этой стадии процесс «дымления» в полузакрытых системах длится до 15 мин. В этом случае остатки азотной кислоты удаляются полностью. Затем полученный бесцветный минерализат обрабатывают разбавленной хлороводородной кислотой для восстановления Se (VI) до Se (IV). И, наконец, минерализат разбавляют бидистиллированной водой, добавляют маскирующие реагенты и устанавливают значение рН около 2,5-3,0, используя индикаторы (метиловый оранжевый, феноловый красный, тимоловый синий), а затем вносят раствор ДАН в 0,1 М HCl. В этом случае рН раствора становится оптимальным, составляя 1,8-2,0.

Несмотря на селективность данного метода, он достаточно трудоемок, продолжителен по времени (три дня), требует больших материальных затрат и позволяет определять только валовое содержание селена.

Задачей, на решение которой направлено настоящее изобретение, является упрощение способа определения селеноорганических соединений и обеспечение возможности непосредственного определение микроколичеств общего селена в анализируемых объектах.

Указанный результат достигается способом определения концентрации селеноорганических соединений в биологически активных добавках методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с ультрафиолетовым детектированием, заключающимся в том, что анализируемую пробу предварительно растворяют в смеси ацетонитрил-вода, взятой в объемном соотношении 1:2,0-2,3, в качестве подвижной фазы используют бинарную смесь на основе ацетонитрила при скорости пропускания ее 0,6-0,8 мл/мин, а детектирование осуществляют при длине волны 200-250 нм.

Преимущественно используют бинарную смесь ацетонитрила и воды в соотношении 90-10 об. %

Обычно элюирование ведут при давлении 40-45 бар. Способ отработан на примере определения микроколичеств селеноорганических соединений - препаратов группы «Селекор», используемых для обогащения БАДов. При хроматографическом определении селекора используют прибор, состоящий из двух насосов (Knauer), инжектора, УФ-спектрофотометра 320 (Hitachi) с жидкостной кюветой объемом 7 мкл и объемом петли 20 мкл. В работе используют колонку С18 (150 мм длиной и 4,5 мм в диаметре) и подобные.

Для выбора оптимальных условий определения «селекора» посредством ВЭЖХ с УФ-детектором были получены спектры поглощения вещества в различных системах растворителей, представленных на фиг. 1, где

1 - ацетонитрил-ацетатный буфер рН 4,7; (80%-20%);

2 - ацетонитрил-ацетатный буфер рН 4,7; (92,5%-7,5%);

3 - ацетонитрил-ацетатный буфер рН 4,7; (97,5%-2,5%);

4 - ацетонитрил-метанол; (80%-20%);

5 - ацетонитрил-вода (76%-24%);

6 - ацетонитрил-вода (60%-40%);

7 - ацетонитрил-вода (90%-10%).

Анализ спектров поглощения показывает сдвиг максимальной абсорбции вещества в более длинноволновую область при использовании нейтральных растворителей в смеси с бидистиллированной водой. Наиболее оптимальной является смесь с содержанием воды 10%, увеличение или уменьшение количества ацетонитрила в бинарной смеси приводит к снижению предела обнаружения анализируемого вещества.

Основным компонентом бинарной смеси элюента был выбран ацетонитрил с целью:

а) сохранения гомогенности системы (экстрагент - ацетонитрил, элюент - ацетонитрил);

б) повышения чувствительности определения селекора (слабое поглощение элюента);

в) снижение межмолекулярных взаимодействий в системе: селекор-растворитель при поглощении квантов облучаемою света.

Пример 1.

К 5 г соли добавляют 10 мл дистиллированной воды и 5 мл ацетонитрила. Смесь интенсивно перемешивают и оставляют на 30 минут в холодильнике при температуре -10°C (до максимального разделения двух фаз испытуемого раствора). Затем из органической фазы отбирают 20 мкл на анализ посредством ВЭЖХ с УФ-детектором.

Условия анализа: аналитическая колонка С18 (Диасфер-200, 5 мкм, 150 мм × 4,6 мм в диаметре), детектор УФ-стектрофотометр 320 (Hitachi) с жидкостной кюветой 7 мкл. Измерения осуществляют при длине волны 215 нм. Элюент - ацетонитрил (для ВЭЖХ) - вода бидистиллированная в соотношении 9:1 (об. %). Скорость элюирования - 0,75 мл/мин. Давление в колонке 40 бар.

Для построения калибровочной кривой использовали БАД «Селекор» (ТУ 9291-007-59582032) с концетрациями (мкг): 1.25; 2.5; 3.75; 5. Данные по содержанию пищевой добавки «Селекор» в солях представлены в таблице 1.

Пример 2.

К двум таблеткам «селекор макси» (ТУ 9291-009-59582032-06), предварительно измельченным, добавляют 3 мл ацеотонитрила. Реакционную смесь интенсивно встряхивают в течение 5 мин и центрифугируют. Ацетонитрильный экстракт анализировали посредством ВЭЖХ по методике, описанной в примере 1.

Экспериментальные данные по содержанию собственно селекора и общего селена в пищевой добавке «Селекор» и в таблетках «Селекор макси» представлены в таблице 2.

Способ позволяет проводить селективное определение концентрации диметилдипиразолилселенида (селекора) в поваренной соли, в биологической активной добавке к пище «Селекор макси» и тем самым получать непосредственно данные о концентрации селенида. Способ прост в исполнении, не требует длительной пробоподготовки и его можно использовать как стандартный тест при сертификации БАД.

Учитывая конформационные и спектральные характеристики ряда органических соединений, применяемых в практической медицине и ветеринарии (1,5-дифенил-3селенапентадион-1,5, диацетофенонилселенид, селенопиран), а также аналога селекора (селедант), представленный способ может быть использован для их количественного определения в препаративных формах и растворах.