СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ РАЗВИТИЯ ПЕЧЕНОЧНОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ ПРИ МЕХАНИЧЕСКОЙ ЖЕЛТУХЕ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ

Изобретение относится к экспериментальным исследованиям и может быть использовано в клинической практике.

Известен способ прогнозирования прогрессирования печеночной недостаточности (ПН) при внутрипеченочном холестазе (Патент РФ №2154276, G01N 33/68, Бюл. №22, 10.08.2000 г.), включающий биохимическое исследование сыворотки крови. Определяют отношение желчных кислот (ЖК) к холестерину (ХС), ЖК к триглециридам (ТГ), ЖК к липопротеидам низкой плотности (ЛПНП), ЖК к липопротеидам высокой плотности (ЛПВП). При значении ЖК/ХС у больных с печеночной недостаточностью класса А менее 3, класса В от 3 до 8, класса С более 8; и при значении ЖК/ТГ у больных с печеночной недостаточностью класса А менее 20, класса В 20-30 и класса С более 30; при значениях ЖК/ЛПНП у больных с печеночной недостаточностью класса А менее 5, класса В 5-10, класса С более 10; при значениях ЖК/ЛПВП у больных с печеночной недостаточностью класса А менее 20, класса В 20-50, класса С более 50 прогнозируют прогрессирование печеночной недостаточности. Недостатком этого способа является определение значений только ЖК. К рутинным методам диагностики печеночной недостаточности при внутрипеченочном холестазе относится определение значений билирубина, аспартатаминотрансферазы (АСТ), аланинаминотрансферазы (АЛТ), гаммаглутамилтрансфе разы (ГГТ), щелочной фосфотазы (ЩФ).

Известен при диагностике различной патологии с применением АСМ способ определения степени злокачественности рака молочной железы (заявка РФ №2012120249, G01N 33/48, Бюл. №3, 27.01.2014 г.), включающий проведение тонкоигольной пункционной аспирационной биопсии узлов молочной железы под контролем ультразвукового исследования. Из полученных пунктатов готовят мазки и проводят атомно-силовую микроскопию (АСМ), при этом определяют высоту цитоплазмы клетки и высоту ядра клетки с последующим вычислением соотношения высоты ядра к высоте цитоплазмы клетки, также определяют форму и размер ядрышек, проводят оценку полученных данных: для высокодифференцированного рака молочной железы характерно преобладание ядрышек цилиндрической формы с диаметром 0,6 мкм, соотношение высоты ядра к высоте цитоплазмы составляет 2,9 мкм; для умеренно-дифференцированного рака молочной железы характерно преобладание ядрышек цилиндрической формы с диаметром 3 мкм, соотношение высоты ядра к высоте цитоплазмы составляет 3,7 мкм; при низкой степени дифференцировки рака молочной железы ядрышки различной формы, диаметр их составляет 2 мкм, соотношение высоты ядра к высоте цитоплазмы - 3,2 мкм. Определять печеночную недостаточность лишь по одному показателю нельзя, для диагностики этой патологии необходима совокупность показателей: биохимические исследования, гистологическое исследование, АСМ.

Задача предлагаемого способа: раннее прогнозирование развития печеночной недостаточности при механической желтухе.

Поставленную задачу осуществляют за счет того, что дополнительно проводят приготовление мазков крови с последующим сканированием эритроцитов методом полуконтактной атомно-силовой микроскопии и измерения их параметров, затем определяют индекс печеночной недостаточности по формуле:

где Бил - показатель значения билирубина,

ГГТ - показатель значения гаммаглютамилтрасферазы,

АЛТ - показатель значения аланинаминотрансферазы,

АСТ - показатель значения аспартатаминотрасферазы.

ΔV - относительный объем эритроцита, который определяют как:

ΔV=V/V0,

где V - объем эритроцита в эксперименте, a V0 - объем эритроцита в норме, оба объема вычисляют по данным атомно-силовой микроскопии,

и при ИПН=0,5 и выше прогнозируют риск развития печеночной недостаточности.

Для подтверждения наличия печеночной недостаточности было выполнено гистологическое исследование ткани печени при разной степени тяжести МЖ.

Способ осуществляют следующим образом: у экспериментального животного при разной степени тяжести МЖ берут периферическую кровь, определяют биохимические показатели: билирубин, гаммаглутаминтрансфераза (ГГТ), аспартатаминотрансферазу (ACT), аланинаминотрасферазу (АЛТ, делают нативный мазок крови для проведения АСМ. Рассчитывают ИПН по вышеприведенной формуле.

В соответствии с полученными данными, экспериментальные животные в соответствии с упрощенной классификацией Э.И. Гальперина от 2012 г., разделены на 4 группы. В 1-ю группу вошли животные без оперативного вмешательства, служившие контрольной группой, где значения билирубина составляет до 5 мкмоль/л, ГГТ до 32 ед/л, значения относительного объема эритроцита (V) не превышает 1, АЛТ до 1,3 мкмоль/л, ACT до 1,1 мкмоль/л. Во 2-ю группу вошли животные со степенью тяжести МЖ класса А, где значения билирубина составляет от 5 до 15 мкмол/л, ГГТ от 32 до 99 ед/л, АЛТ от 1,3 до 2,3 мкмоль/л, ACT от 1,1 до 2,3 мкмоль/л, V От 1 до 1,2; в 3-ю - класса В: значение билирубина от 15-50 мкмол/л, ГГТ от 99 до 330 ЕД, АЛТ от 2,3 до 2,8 мкмоль/л, ACT от 2,3 до 2,9 мкмоль/л, V от 1,2 до 1,43, и в 4-ю класса С, со значениями билирубина от 50 мкмол/л и выше, ГГТ от 330 ЕД и выше, АЛТ от 2,8 мкмоль/л и выше, ACT от 2, 9 мкмоль/л и выше, V от 1,43 и выше (табл. 1).

Как видно из табл. 1, при ИПН=0,5 и выше прогнозируют развитие печеночной недостаточности при механической желтухе.

Для подтверждения этого у экспериментальных животных с разными классами механической желтухи была выполнена биопсия печени и сопоставлены данные биохимического и гистологического исследований, а также данные АСМ.

На рис. 1.1, 1.2 отображены препараты срезов ткани печени экспериментальных животных контрольной группы. На рис. 1.1 видны печеночная долька, портальные тракты без склероза и воспаления. Окраска Г-Э. x100. Портальные тракты тонкие, правильные, обрамляют печеночные дольки. Желчные протоки сохранены, не пролиферируют. Лимфоидная инфильтрация портальных трактов минимальная, представленная рассеянными лимфоцитами и плазматическими клетками.

Гистоархитектоника расположения гепатоцитов сохранена. Гепатоциты обычного строения, с очаговой невыраженной вакуолизацией цитоплазмы. Центральные вены не расширены. В просвете синусоидов определяется стояние единичных лимфоцитов и нейтрофилов. На рис. 1.2 - портальный тракт без склероза и воспаления. Желчные протоки сохранены. Окраска PAS. Х200. При окраске срезов PAS-реакцией определяются едитничные гепатоциты в состоянии апоптоза, что свидельствует о нормальном строении ткани печени.

На рис. 2.1, 2.2 препараты срезов ткани печени экспериментальных животных с МЖ класса А. Рис. 2.1 - портальный тракт с воспалительной инфильтрацией лимфоцитами и плазмоцитами. Единичные лимфоциты в эпителии желчного протока, пролиферация эпителия желчного протока. Г-Э. x100. Определяется склероз и утолщение портальных трактов, а так же перипортальных полей. Имеется воспалительная инфильтрация портальных трактов, в большинстве полей зрения слабая, в единичных полях зрения достигает умеренных значений. Инфильтрация представлена лимфоцитами и плазматическими клетками, с примесью единичных нейтрофилов и макрофагов. Инфильтрация внутрипортальная, не проникает за границы триады, ступенчатых и мостовидных некрозов в препаратах - нет. Желчные протоки в портальных трактах сохранены, очагово имеется проникновение лимфоцитов через базальную пластинку на эпителий желчных протоков, пролиферация эпителия с образованием сосочков.

Гистоархитектоника расположения гепатоцитов сохранена. Гепатоциты обычного строения, с очаговой невыраженной вакуолизацией цитоплазмы. Центральные вены немного расширены, стенки центральных вен с признаками невыраженного склероза и отека. В просвете синусоидов определяется стояние единичных лимфоцитов и нейтрофилов. На рис. 2.2 - воспалительная инфильтрация портальных трактов, представлена лимфоцитами и плазматическими клетками, с примесью единичных нейтрофилов и макрофагов. PAS. x200. При окраске срезов PAS-реакцией определяются единичные гепатоциты в состоянии апоптоза. При исследовании паренхимы печеночных долек определяются внутридольковые некрозы отдельных гепатоцитов, очаговая пролиферация клеток Купфера. Полученные данные свидетельствуют о незначительном нарушении в ткани печени.

На рис. 3.1, 3.2 препараты срезов ткани печени экспериментальных животных с МЖ класса В. На рис. 3.1 - портальный тракт с явлениями фиброза, очаговым полиморфно-клеточным воспалительным инфильтратом. Внутридольковые воспалительные инфильтраты. Очаговая пролиферация холангиол. Г-Э x100. Определяются признаки ПН: склероз и утолщение портальных трактов, а так же перипортальных полей с образованием портальных септ. В портальных трактах имеется очаговая пролиферация холангиол. Воспалительная инфильтрация портальных трактов не выражена, представлена лимфоцитами и плазматическими клетками.

В центролобулярных отделах так же определяется повышенное количество аргентофильных волокон, особенно по периферии центральных венул. Определяются явления внеклеточного холестаза - небольшие скопления желчи, без выраженной клеточной реакции по периферии. Рис. 3.2 - внутридольковое скопление желчи с клеточной реакцией по периферии. Гепатоциты с пенистой и вакуолизированной цитоплазмой, очаговой жировой инфильтрацией цитоплазмы. PAS х200. При исследовании паренхимы печеночных долек определяются внутридольковые некрозы отдельных гепатоцитов. Имеются рассеянные гепатоциты с жировой инфильтрацией цитоплазмы. В просвете синусоидов, очагово определяются скопления лимфоцитов и нейтрофилов, единичных эозинофилов, имеется небольшое количество апоптотических телец Каунсильмена. Полученные гистологические данные при МЖ класса В, свидетельствуют о наличии признаков ПН.

На рис. 4.1, 4.2 препараты срезов ткани печени экспериментальных животных с МЖ класса С. Рис. 4.1 - внутридольковое скопление желчи вблизи портального тракта, некрозы гепатоцитов в этой области, инфильтрация лимфоцитами и нейтрофилами. Г-Э x100. Определяется наличие печеночной недостаточности: склероз и утолщение портальных трактов, а также перипортальных полей с образованием портальных септ. В портальных трактах и фиброзных септах имеется очаговая пролиферация холангеол. Воспалительная инфильтрация портальных трактов от слабой до умеренной представлена лимфоцитами и плазматическими клетками, с примесью небольшого количества эозинофилов, нейтрофилов. По периферии фиброзированных портальных трактов гепатоциты формируют псевдоацинусы.

В центролобулярных отделах определяются выраженные явления внеклеточного холестаза - массивные скопления желчи в виде «озер», со сдавлением гепатоцитов к периферии, очаговыми некрозами гепатоцитов, расположенных среди желчи. По периферии скоплений желчи определяется макрофагальная реакция ткани - пролиферация клеток Купфера и инфильтрация нейтрофилами.

Рис. 4.2 - внутридольковые скопления желчи, с некрозом гепатоцитов в этих зонах, воспалительной инфильтрацией. PAS х200. При исследовании паренхимы печеночных долек определяются внутридольковые некрозы как отдельных гепатоцитов, так и групп гепатоцитов. Имеются рассеянные гепатоциты с жировой инфильтрацией цитоплазмы. В просвете синусоидов, очагово, определяются скопления лимфоцитов и нейтрофилов, единичных эозинофилов, имеется множество апоптотических телец Каунсильмена, что является гистологическим признаком ПН.

Предлагаемый способ позволяет по данным АСМ и биохимических исследований осуществить раннее прогнозирование развития печеночной недостаточности при механической желтухе, что требует в последующем своевременного патогенетического лечения, еще до начала появления клинических признаков печеночной недостаточности.