Результат интеллектуальной деятельности: ПРИМЕНЕНИЕ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ ЛЕСНЫХ ДРЕВЕСНЫХ ПОРОД В КАЧЕСТВЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ МОДЕЛЕЙ ПРИ ПРОГНОЗИРОВАНИИ КРУГОВОРОТОВ АЗОТА И УГЛЕРОДА В ЛЕСНЫХ ЭКОСИСТЕМАХ

Изобретение относится к области экологии, в частности к математическому моделированию круговорота элементов в лесных экосистемах.

Известен способ определения скорости разложения растительных остатков, состоящий в оценке потери массы листьев различных видов деревьев в процессе их разложения в лабораторных условиях (микрокосме) в почвенной смеси неопределенного состава при одном значении температуры и одном значении влажности в течение 16 месяцев (De Angelis P., Chigwerewe K.S., Mugnozza G.E.S. Litter quality and decomposition in a CO₂-enriched Mediterranean forest ecosystem // Plant and Soil, 2000, 224:31-41). К недостаткам этого известного способа следует отнести низкую точность выбранного метода анализа (потеря массы) и весьма значительный интервал между измерениями (один раз в четыре месяца). Уменьшение интервала между измерениями весьма затруднено, так как каждое новое измерение требует использования нового набора образцов - после проведения измерений они становятся непригодными для дальнейшего использования в эксперименте.

Также известен способ определения скорости разложения растительных остатков, состоящий в оценке эмиссии СО₂ с помощью газового хроматографа в процессе разложения корней трансгенных растений гибридного тополя с измененной лигнификацией и соотношением азот:углерод, проходящем в лабораторных условиях в почвенной смеси неопределенного состава при одном значении температуры и одном значении влажности в течение 5 месяцев (Pilate G., Guiney Е., Holt K. et al. Field and pulping performances of transgenic trees with altered lignification // Nature Biotechnology, 2002, 20:607-12).

К недостаткам данного способа следует отнести короткую продолжительность эксперимента (5 месяцев), в течение которого разложению подвергаются только быстроразлагаемые фракции растительной биомассы, и отсутствие математического моделирования влияния последствий выращивания данных растений в значительных масштабах и в течение длительного периода времени на экосистему.

Наиболее близким известным прототипом является способ математического моделирования разложения органического вещества, состоящий в оценке скорости разложения растительных остатков в лабораторных условиях в почвенной смеси неопределенного состава при одном значении температуры и одном значении влажности путем определения потери массы в течение одного года и использования полученных данных в модели динамики органического вещества ROMUL (Безрукова М.Г., Быховец С.С, Грабарник П.Я. и др. Анализ неопределенности параметров модели разложения органического вещества: байесовский подход // Известия Самарского научного центра РАН, 2009, 11:1424-1429).

К недостаткам ближайшего прототипа следует отнести низкую точность выбранного метода анализа; жестко заданные значения температуры и влажности, не позволяющие оценить влияние их колебаний в естественных условиях на скорость разложения; неопределенный состав почвенной смеси, который может оказывать значительное влияние на процесс разложения и не позволяет сравнивать результаты из различных исследований; невозможность использования полученных результатов для растений тех же видов, но с модифицированным соотношением азота и углерода, которое оказывает значительное влияние на скорость разложения.

В литературе отсутствуют данные по использованию трансгенных растений в качестве биологических моделей для математического моделирования круговорота элементов в экосистемах.

Целью изобретения является прогнозирование круговорота азота и углерода в лесных экосистемах при выращивании трансгенных растений лесных древесных пород с заданными характеристиками в условиях меняющегося климата.

Поставленная задача решается благодаря тому, что в способе математического моделирования разложения органического вещества, включающем лабораторный эксперимент по длительному разложению образцов различных органов растений, данные которого используются в модели динамики органического вещества ROMUL, предусмотрено следующее отличие: объектом служат трансгенные растения древесных лесных пород с различными заданными характеристиками, вызывающими в химическом составе растений изменение соотношения азота и углерода.

Кроме того, предложенный способ отличается тем, что:

- длительность разложения растительных образцов составляет не менее одного года;

- оценка скорости разложения проводится путем определения эмиссии CO₂ с помощью газового хроматографа с определенной периодичностью отбора проб воздуха;

- периодичность отбора проб воздуха составляет не менее 8 отборов в первые 10 недель разложения и не менее 8 отборов в последующее время;

- в качестве образцов используются различные органы (листья для лиственных пород или хвоя для хвойных пород, корни, стебли) одного и того же генотипа растения;

- разложение проводится в стерилизованном песке с добавлением водной вытяжки лесного растительного опада;

- разложение проводится в условиях с различными значениями (не менее трех) физических параметров, в качестве которых выступают температура и влажность.

Способ осуществляется следующим образом.

Песок, просеянный через сито 0,5 мм, промывают водопроводной водой в течение нескольких часов при периодическом перемешивании и затем не менее трех раз дистиллированной водой. Промытый песок высушивают при 105°С в течение 12 часов и затем прокаливают при 200°С в течение 3 часов. Определяют влагоемкость прокаленного песка по Минееву (2001). Растительную массу (отдельно стебли, корни, листья) измельчают секатором или ножницами и растирают в фарфоровой ступке до однородной массы, после чего высушивают при 65°С в течение трех суток. Влагоемкость растительной массы определяют аналогично песку. В стеклянные пробирки с резиновыми пробками объемом 12-15 мл добавляют растительную массу и песок в соотношении 1:10-1:20 по весу и тщательно перемешивают. Масса песка не должна превышать 2 г. Погрешность при взвешивании растительной массы и песка не должна превышать 1%. Для обеспечения разложения в пробирки добавляют 50 мкл водной вытяжки из лесного растительного опада (10 г опада заливают 0,5 л водопроводной воды, перемешивают в течение 1 ч и фильтруют) и дистиллированную воду в количестве, необходимом для достижения определенной доли влажности от влагоемкости песка и растительной массы (не менее трех вариантов). В качестве контроля используют пробирку с песком без увлажнения. Все пробирки (кроме контрольной) взвешивают с точностью до 1 мг и помещают в термостаты, обеспечивающие погрешность не более 1°C, с различной температурой (не менее трех вариантов). Для каждого варианта используют не менее трех пробирок. В ходе эксперимента пробирки периодически (не реже одного раза в месяц) взвешивают и в случае уменьшения массы более чем на 10% от начальной восполняют потерю массы дистиллированной водой до исходного значения. В течение года через определенные промежутки времени (в соответствии с планом эксперимента, но не менее 16 раз) из пробирок с помощью шприца отбирают пробы воздуха, в котором с помощью газового хроматографа определяют содержание углекислого газа. После отбора проб пробирки помещают под вытяжку, открывают и проветривают не менее 30 минут. Полученные данные используют для расчета в модели динамики органического вещества ROMUL.

Изобретение позволяет повысить точность прогнозирования круговорота азота и углерода в лесных экосистемах за счет использования более точного метода, получения большего числа данных за счет более частых измерений и использования образцов различных органов растений одного и того же вида и оценить влияние на круговорот элементов выращивания трансгенных растений с заданными характеристиками, вызывающими изменение соотношения азот:углерод, существенно влияющего на скорость разложения растительных остатков. Получение данных для различных значений температуры и влажности позволит прогнозировать круговорот элементов для различных сценариев изменения климата.

Пример 1. Влияние различных заданных характеристик трансгенных растений древесных лесных пород на соотношение азота и углерода

В ходе генетической трансформации березы рекомбинантным геном глутаминсинтетазы GS1 с целью повышения продуктивности был получен ряд клонов с ускоренным ростом и измененным соотношением азота и углерода в стеблях. Характеристики данных растений представлены в таблице 1.

В ходе генетической трансформации осины рекомбинантным геном ксилоглюканазы Xeg с целью изменения структуры и механических свойств клеточной стенки был получен ряд клонов с измененными содержанием пентозанов и соотношением азота и углерода в различных органах растений. Характеристики данных растений представлены в таблице 2.

В ходе генетической трансформации осины инвертированными повторами гена 4-кумарат-КоА-лигазы 4CL с целью модификации содержания лигнина был получен ряд клонов с измененными содержанием лигнинов и соотношением азота и углерода в различных органах растений. Характеристики данных растений представлены в таблице 3.

Пример 2. Влияние изменения соотношения азота и углерода в трансгенных растениях березы с геном глутаминсинтетазы на скорость разложения

Соотношение углерод:азот считается хорошим показателем скорости разложения растительных остатков, и наличие рекомбинантного гена глутаминсинтетазы в стеблях березы привело к заметному повышению содержания азота (снижению величины C/N) и увеличению потерь углерода при разложении стеблей березы с рекомбинантным геном глутаминсинтетазы GS1 (фиг. 1). Наиболее заметное повышение скорости разложения наблюдалось у клонов GS-8b и GS-9b, тогда как клон GS-11b практически не отличался от контрольных нетрансгенных растений.

Линейная обратная зависимость между скоростью разложения стеблей березы с рекомбинантным геном глутаминсинтетазы и величиной C/N в растительной ткани (фиг. 2) оказалась достоверной (R²=0.95), поэтому наблюдаемые различия скоростей разложения, скорее всего, связаны с различным содержанием азота в стеблях березы, которое может быть связано с переносом рекомбинантного гена глутаминситетазы GS1.

Пример 3. Влияние типа органа растения на скорость разложения

Кумулятивная эмиссия СО₂ при разложении различных органов трансгенной осины с геном Xeg отражает скорость разложения растительных тканей (фиг. 3). Листья разлагаются быстрее, чем стебли, а стебли - быстрее, чем корни.

Пример 4. Влияние температуры на скорость разложения

Влияние температуры на скорость разложения трансгенных растений показано на примере контрольных и трансгенных растений осины с геном Xeg (фиг. 4а и 4б). Скорость разложения листьев и стеблей осины существенно зависела от температуры инкубирования. Она была максимальной при температуре 22°C и минимальной - при 2°C.

Пример 5. Влияние влажности на скорость разложения

Влияние влажности на скорость разложения растительных тканей показано на примере трансгенных растений осины с геном Xeg (фиг. 5а и 5б). Листья и стебли осины разлагались примерно одинаково при влажности 20 и 50% ППВ. Повышение влажности до 80% ППВ привело к небольшому (около 10%) увеличению скорости разложения листьев и стеблей как трансгенных, так и нетрансгенных растений.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1. Скорость разложения стеблей березы при различной величине C/N.

Фиг. 2. Зависимость скорости разложения стеблей березы от величины C/N.

Фиг. 3. Кумулятивная эмиссия CO₂ при разложении различных органов трансгенной осины с геном Xeg.

Фиг. 4. Влияние температуры на скорость разложения различных органов осины (а - листья; б - стебли).

Фиг. 5. Влияние влажности на скорость разложения различных органов осины (а - листья; б - стебли).