×
22.07.2020
220.018.354d

Способ подавления роста опухолей генно-модифицированным вариантом цитокина TRAIL

Вид РИД

Изобретение

Юридическая информация Свернуть Развернуть
Краткое описание РИД Свернуть Развернуть
Аннотация: Изобретение относится к биотехнологии и медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано для подавления роста опухоли у больных колоректальным раком. Предложен способ подавления роста опухолей колоректального рака in vivo путем воздействия генно-модифицированного варианта внеклеточного домена рекомбинантного белка TRAIL DR5-B, имеющего аминокислотную последовательность, как представлено в SEQ ID NO. 1, на животных-опухоленосителях, при этом DR5-B селективно связывается с рецептором смерти DR5 и вызывает гибель опухолевых клеток путем апоптоза. Ингибирование роста опухоли достигает 41-46% и стабильно удерживается на относительно высоком уровне в период от 15-го до 30-го дня после начала воздействия. 5 ил., 3 табл., 3 пр.
Реферат Свернуть Развернуть

Область, к которой относится изобретение

Изобретение относится к медицине, фармацевтике, а именно к онкологии, для подавления роста колоректального рака с помощью рекомбинантного белкового препарата модифицированного варианта цитокина TRAIL DR5-B, мишенью которого является расположенный на клеточной поверхности рецептор смерти TRAIL (обозначенный в описании как DR5). DR5-B при связывании с рецептором DR5 вызывает апоптотическую гибель опухолевых клеток, не повреждая при этом нормальные клетки.

Уровень техники

Цитокин TRAIL (TNF related apoptosis inducing ligand) индуцирует апоптоз в трансформированных клеточных линиях, не оказывая воздействия на нормальные клетки. TRAIL представляет собой полипептид, состоящий из 281 аминокислотного остатка и является трансмембранным белком II типа, С-конец которого находится на внеклеточной поверхности. Установлено, что внеклеточный домен лиганда TRAIL может расщепляться металлопротеиназами и в небольших количествах присутствовать в растворимой форме в крови человека. Как и другие члены семейства фактора некроза опухоли (ФНО), белок TRAIL образует гомотримерную молекулу, которая связывается с соответствующими рецепторами смерти, инициируя каскад сигналов. Способность лиганда TRAIL индуцировать апоптоз главным образом опухолевых клеток, оказывая незначительное воздействие на нормальные клетки, делает его потенциально ценным кандидатом для применения в лечении злокачественных новообразований. Возможный спектр применения противоопухолевой терапии с использованием агонистов рецепторов смерти TRAIL очень широк, так как почти во всех типах опухолей экспрессируются рецепторы смерти TRAIL.

В настоящее время идентифицированы по меньшей мере пять рецепторов TRAIL, из которых два, а именно DR4 (рецептор смерти 4, TRAIL-R1) и DR5 (рецептор смерти 5, TRAIL-R2), обладают способностью трансдуцировать сигнал апоптоза, а три других рецептора (TRAIL-R3, TRAIL-R4 и растворимый OPG) блокируют TRAIL-опосредуемый апоптоз, в связи с чем они получили название «рецепторов -ловушек».

Несмотря на то, что рекомбинантный препарат TRAIL (лекарственное название Dulanermin) продемонстрировал высокую противоопухолевую активность в ряде экспериментальных исследований, его терапевтический эффект в клинических испытаниях ограничивался частичными ответами или стабилизацией заболевания. Таким образом, существует потребность создания специфических агонистов к DR5, которые будут с индуцировать гибель опухолевых клеток и подавлять рост опухолей для лечения соответствующих заболеваний.

К сегодняшнему дню в зарубежных лабораториях было получено несколько DR5-специфических мутантных вариантов TRAIL. Известен способ получения мутантного варианта TRAIL DR5-8 с шестью заменами аминокислотных остатков, который связывается с рецептором смерти DR5, не проявляя аффинности к рецептору смерти DR4 (Kelley F.R. et al. Receptor-selective mutants of Apo2L/TRAIL reveal a greater contribution of DR5 than DR4 to apoptosis signaling. J. Biol. Chem., 2005, Vol. 280, pp. 2205-2212). Известен другой мутантный вариант TRAIL с двумя заменами аминокислотных остатков (D269H/E195R) с пониженной аффинностью к рецептору DR4 (Van der Sloot A.M. et al. Designed tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand variants initiating apoptosis exclusively via the DR5 receptor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2006, V. 103, pp. 8634-8639). Противоопухолевая активность этого варианта, тестированная на модели ксенографта рака яичников человека А2780 у иммунодефицитных мышей, практически не отличалась от препарата TRAIL дикого типа. Тем не менее, препарат мутантного варианта TRAIL D269H/E195R совместно с цисплатином эффективнее ингибировал рост ксенографтов опухолей человека у животных. (Duiker E.W. et al. Enhanced antitumor efficacy ofa DR5specific TRAIL variant over recombinant human TRAIL in a bioluminescent ovarian cancer xenograft model. Clin. Cancer Res., 2009, Vol. 15, pp. 2048-2057).

Недостатком известных мутантных вариантов TRAIL является их высокая аффинность к рецепторам ловушкам TRAIL DcR1 и DcR2, которые не только не проводят сигнал апоптоза, но и ингибируют цитотоксическую активность цитокина. Такие мутантные варианты могут эффективнее тормозить рост только тех опухолей, в которых экспрессия рецепторов ловушек отсутствует. Однако известно, что рецепторы ловушки экспрессируются в большинстве видов опухолевых клеток. Поэтому, для повышения противоопухолевой активности TRAIL необходимо получить такие мутантные варианты TRAIL, которые селективно нацелены только на рецепторы смерти DR4 или DR5. Известен способ получения мутантных вариантов TRAIL с пониженной аффинностью к рецепторам-ловушкам (O'Leary L. et al. Decoy receptors block TRAIL sensitivity at a supracellular level: the role of stromal cells in controlling tumour TRAIL sensitivity. Oncogene. 2016. Vol. 35, pp. 1261-1270), которые эффективнее приводят опухолевые клетки к гибели, по сравнению с TRAIL дикого типа. Противоопухолевая активность этих мутантов in vivo не была исследована.

Известен также способ подавления рака толстой кишки с помощью ситетических поливалентных пептидов, не имеющих гомологию с TRAIL b связывающихся с DR5 рецептором (V. PAVET et al. "Multivalent DR5 Peptides Activate the TRAIL Death Pathway and Exert Tumoricidal Activity". Cancer Research, 2010, v. 70, no. 3, p. 1 101-1110, DOI: 10.1158/0008-5472). Однако цитотоксическая активность этих пептидов уступал TRAIL in vitro. Кроме того, в последующих публикациях (J. Beyrath et al. Synthetic ligands of death receptor 5 display a cell-selective agonistic effect at different oligomerization levels. Oncotarget. 2016 v. 4, no. 7, p. 64942-64956. doi: 10.18632/oncotarget. 10508, Chekkat N et al. Relationship between the agonist activity of synthetic ligands of TRAIL-R2 and their cell surface binding modes. Oncotarget. 2018 v. 17, no. 9, p.15566-15578. doi: 10.18632/oncotarget.24526) авторы получившие указанные пептиды показали, что в то время как TRAIL способен эффективно убивать опухолевые клетки линии Jurkat или НСТ116, поливалентные пептиды не влияют на жизнеспособность данных клеток, так как образуют слабый комплекс с рецептором DR5 на поверхности этих клеток.

Технической проблемой решаемой предлагаемым изобретением, является разработка способа противоопухолевого воздействия, основанного на TRAIL-опосредованной гибели опухолевых клеток, более эффективного, чем с использованием известных агонистов рецепторов смерти.

Техническим результатом заявляемого изобретения является новый способ подавления роста опухолей колоректального рака с помощью генно-модифицированного варианта цитокина TRAIL DR5-B с повышенной противоопухолевой активностью.

Для решения указанной технической проблемой и достижения заявленного техничекого результата предложено использование генно-модифицированного рецептор-специфичного варианта внеклеточного домена рекомбинантного белка DR5-B, содержащего 6 замен аминокислотных остатков (SEQ ID NO 1).

Ранее авторами был получен уникальный вариант TRAIL DR5-B с заменами аминокислотных остатков Y189N/R191K/Q193R/H264R/I266L/D269H в белке TRAIL, который селективно связывается лишь с одним из пяти рецепторов TRAIL, рецептором смерти DR5 (Гаспарян М.Э. и др. Способ получения мутантного белка TRAIL человека. Патент РФ №2405038 от 27.11.2010). Исследования на линиях опухолевых клеток различного происхождения показали, что мутантный вариант DR5-B значительно эффективнее индуцирует апоптоз по сравнению с TRAIL дикого типа как при самостоятельном применении, так и в комбинации с химиопрепаратами (Гаспарян М.Э. и др. Способ индукции гибели опухолевых клеток, Патент РФ №2620165, от 23.05.2017).

Противоопухолевая эффективность DR5-B in vivo показана на модели подкожного ксенографта рака толстой кишки (РТК) человека НТ116 у мышей BALB/c nu/nu. Высокоочищенный рекомбинантный белок DR5-B получен из штамма Е. coli SHuffle В как описано ранее (Яголович А.В. и др. Новый эффективный способ получения рекомбинантного противоопухолевого цитокина TRAIL и его рецептор селективного варианта DR5-B. Биохимия, 2019, том. 84, вып. 6, с. 808-818).

Исследованы два режима воздействия:

режим I - DR5-B или контрольное вещество вводили 10-кратно, в виде двух последовательных циклов ежедневных внутривенных введений, по 5 инъекций в каждом цикле, с интервалом 2 дня, общая продолжительность воздействия 12 дней;

режим II - DR5-B или контрольное вещество вводили 7-кратно, дважды в неделю, с интервалом 2 или 3 дня, общая продолжительность воздействия 12 дней.

Показано, что при многократном внутривенном введении DR5-B в режиме I, в разовой дозе 10 мг/кг (суммарная доза 100 мг/кг), у мышей с ксенографтом НСТ116 наблюдается статистически достоверное ингибирование роста опухоли, по сравнению с контрольной группой животных-опухоленосителей, получавших в том же режиме инъекции физиологического раствора. Величина торможения роста опухолей (ТРО) при этом составляет 41-48%. Воспроизводимость противоопухолевого эффекта установлена в трех независимых опытах. По обобщенным результатам независимых экспериментов, многократное внутривенное введение DR5-B в разовой дозе 10 мг/кг в режиме I приводит к статистически достоверному увеличению продолжительности жизни животных.

Пролонгирование воздействия путем использования DR5-B в режиме II (разовая доза 10 мг/кг; суммарная доза 70 мг/кг) приводит к более глубокому торможению роста ксенографта НСТ116, величина ТРО достигает 50-70%. Однако существенного увеличения продолжительности терапевтического эффекта при этом не наблюдается. В целом, режимы I и II, отличающиеся длительностью интервалов между введениями препарата и продолжительностью воздействия, характеризуются сопоставимым уровнем результирующего противоопухолевого эффекта.

Установлено, что противоопухолевый эффект воздействия зависит от дозы препарата DR5-B. Оптимальная разовая доза при внутривенном введении DR5-B на модели ксенографта РТК человека НСТ116 у мышей линии BALB/c nu/nu составляет 10 мг/кг.

Показано, что DR5-B при системном введении в течении 10-ти дней в разовой дозе 10 мг/кг эффективнее подавляет рост ксенографта НСТ116, чем его немодифицированный аналог, TRAIL дикого типа.

В сравнительном исследовании показано, что ксенографты РТК человека, полученные с использованием разных клеточных линий, отличаются по чувствительности к действию DR5-B. Так, при использовании DR5-B в оптимальной дозе в режиме I наиболее чувствительным к его действию является ксенографт НСТ116, менее чувствительным -ксенографт Сасо-2. Ксенографт НТ-29 может служить моделью опухоли не чувствительной к действию DR5-B.

Изобретение иллюстрируют следующие рисунки:

Фигура 1. Действие DR5-B на рост ксенографтов РТК человека НСТ116 у мышей BALB/c nu/nu при многократном внутривенном введении в разовых дозах 2 мг/кг, 10 мг/кг и 25 мг/кг. Режим I - 10-ти кратное введение; два цикла ежедневных инъекций, продолжительность каждого цикла - 5 дней; интервал между циклами - 2 дня; общая продолжительность воздействия 12 дней. Режим II - 7-ми кратное введение, два раза в неделю, с интервалом между инъекциями 2 или 3 дня; общая продолжительность воздействия 22 дня. Каждая экспериментальная группа состоит из 5 животных. Данные представлены в виде среднего арифметического и стандартной ошибки среднего.

Фигура 2. Продолжительность жизни мышей BALB/c nu/nu с ксенографтами РТК человека НСТ116 при многократном внутривенном введении DR5-B при разовых дозах 2 мг/кг, 10 мг/кг и 25 мг/кг. Режим I - 10-ти кратное введение; два цикла ежедневных инъекций, продолжительность каждого цикла - 5 дней; интервал между циклами - 2 дня; общая продолжительность воздействия 12 дней. Режим II - 7-ми кратное введение, два раза в неделю, с интервалом между инъекциями 2 или 3 дня; общая продолжительность воздействия 22 дня.

Фигура 3. Динамика роста опухоли у ксенографтов РТК человека НСТ116 у мышей BALB/c nu/nu при многократном внутривенном введении DR5-B в разовой дозе 10 мг/кг в режиме I (10-ти кратное введение; два цикла ежедневных инъекций, продолжительность каждого цикла - 5 дней; интервал между циклами - 1 день). Результаты трех независимых экспериментов. Каждая экспериментальная группа состоит из 5-6 животных. Данные представлены в виде среднего арифметического и стандартной ошибки среднего.

Фигура 4. А - Цитотоксическая активность TRAIL и DR5-B на клетки линии НСТ116 при 24 часовой инкубации определенная с помощью МТТ теста; Б - Динамика роста ксенографтов РТК человека НСТ116 у мышей BALB/c nu/nu при многократном внутривенном введении TRAIL и DR5-B в разовых дозах 10 мг/кг в режиме I (10-ти кратное введение; два цикла ежедневных инъекций, продолжительность каждого цикла - 5 дней; интервал между циклами - 2 дня); В - Торможение роста опухолей (ТРО, %) в группах мышей, получавших TRAIL и DR5-B, относительно контрольной группы животных, которым вводили физиологический раствор. В экспериментах in vivo каждая группа состоит из 5 животных. Данные представлены в виде среднего арифметического и стандартной ошибки среднего.

Фигура 5. А - Цитотоксическая активность TRAIL и DR5-B на опухолевых клеточных линиях РТК человека НСТ116, Сасо-2 и НТ-29. Клетки инкубировали с лигандами в указанных концентрациях в течении 24 часов, выживаемость клеток определяли с помощью МТТ теста. Б - Динамика роста опухоли у ксенографтов РТК человека НСТ116, Сасо-2 и НТ-29 у мышей BALB/c nu/nu при многократном внутривенном введении DR5-B в разовой дозе 10 мг/кг в режиме I (10-ти кратное введение; два цикла ежедневных инъекций, продолжительность каждого цикла - 5 дней; интервал между циклами - 2 дня). Данные представлены в виде среднего арифметического и стандартной ошибки среднего.

Осуществление изобретения

Осуществление заявляемого изобретения иллюстрируется приведенными ниже примерами 1-3.

Пример 1.

Влияние DR5-B на рост ксенографтов рака толстой кишки человека НСТ116 у мышей BALB/c nu/nu при многократном внутривенном введении

Для получения ксенографта использовали культивируемые клетки РТК человека линии НСТ116. Клетки культивировали в пластиковых флаконах с площадью поверхности 75 см2 (Costar, США) на среде DMEM с L-глутамином (ПанЭко, Россия) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС; ПанЭко, Россия) в стандартных условиях культивирования (в увлажненной атмосфере при температуре 37°С и 5% атмосферном содержании СО2).

Для прививки животным использовали клетки 8 пассажа. Непосредственно перед прививкой животным клетки снимали с флаконов раствором Версена (ПанЭко, Россия), отмывали в среде, не содержащей ЭТС, и переносили в стерильные пробирки. Осаждение клеток проводили на центрифуге "СМ-6М Elmi" при 1000 об/мин в течение 10 мин. Подсчет количества жизнеспособных клеток выполняли в камере Горяева, с добавлением к клеточной суспензии 0,4% раствора трипанового синего в объемном соотношении 1:1. На основании результатов подсчета готовили клеточную суспензию с концентрацией 8×107 клеток в 1 мл. Клетки инокулировали животным в Матригеле (BD Matrigel™ Basement Membrane Matrix, BD Biosciences). Для введения животным 50 мкл клеточной суспензии (4×106 клеток) переносили в охлажденную пробирку, содержащую 50 мкл Матригеля и после перемешивания клеточный материал (100 мкл) вводили животному подкожно, на правый бок.

Воздействие начинали на 6-й день роста ксенографта опухоли. DR5-B и контрольное вещество вводили мышам внутривенно, в хвостовую вену. Объем введения препарата животным рассчитывали на основании средней массы тела животных в группе, в соответствии с дозой препарата.

Использовали два режима воздействия:

- режим I: введение осуществляют ежедневно, в течение 10 дней (с перерывом 2 дня), в разовых дозах 2 мг/кг, 10 мг/кг и 25 мг/кг. Контрольным животным в том же режиме вводят 0,9% раствор хлористого натрия (физиологический раствор) в объеме, эквивалентном объему введения наибольшей дозы. Общая продолжительность воздействия составляет 12 дней.

- режим II: введение осуществляют два раза в неделю, с интервалами 2 или 3 дня, в разовых дозах 2 мг/кг, 10 мг/кг и 25 мг/кг. Контрольным животным в том же режиме вводят физиологический раствор в объеме, эквивалентном объему введения наибольшей дозы. Общая продолжительность воздействия составляет 22 дня.

В течение времени наблюдения проводили оценку общего состояния мышей (ежедневно), регистрировали объем подкожных образований (три раза в неделю), вес животных (раз в неделю). Размер опухоли измеряли трижды в неделю. Размер опухоли определяли путем чрезкожного измерения опухолевых образований при помощи штангенциркуля в трех взаимно перпендикулярных проекциях. Объем опухоли рассчитывали по формуле: V=d1×d2×d3 мм3, где d1, d2 и d3 - три взаимно перпендикулярных диаметра опухоли. По результатам измерения рассчитывали средний объем опухоли в каждой экспериментальной группе и величину торможения роста опухоли (ТРО):

ТРО=[(Vк-Vоп)/Vк]×100%, где

Vоп - средний объем опухоли у животных в опытной группе; Vк - средний объем опухоли у животных в контрольной группе.

При внутривенном введении животным DR5-B в разовой дозе 10 мг/кг в режиме I (суммарная доза 100 мг/кг) наблюдали статистически достоверное ингибирование роста ксенографта НСТ116. Величина ТРО в период от 8-х до 20-х суток после начала воздействия, по сравнению с группой животных, получавших в том же режиме инъекции физиологического раствора, в среднем составляла 41-48% (Фиг. 1, Режим I). При снижении разовой дозы препарата до 2 мг/кг (суммарная доза 20 мг/кг) выраженность эффекта в режиме I существенно снижалась, а повышение разовой дозы до 25 мг/кг (суммарная доза 250 мг/кг) - не оказывало ингибирующего действия на рост опухолей у животных.

При внутривенном введении DR5-B в разовой дозе 10 мг/кг в режиме II (суммарная доза 70 мг/кг) наблюдали тенденцию к более глубокому торможению роста опухоли. Величина ТРО в период от 6-х до 15-х суток после начала воздействия, по сравнению с группой животных, получавших инъекции физиологического раствора в том же режиме, достигала 50-70%. Однако увеличение общей продолжительности воздействия, по сравнению с режимом I, не приводило к существенному пролонгированию противоопухолевого эффекта (Фиг. 1, Режим II). При использовании данного режима воздействия также наблюдалась зависимость противоопухолевого эффекта от дозы DR5-B.

Многократное внутривенное введение препарата DR5-B удовлетворительно переносилось животными. Реакций на введение препарата не отмечено.

Таким образом, на модели ксенографта РТК человека НСТ116 у иммунодефицитных мышей оптимальная разовая доза DR5-B при его внутривенном введении составляет 10 мг/кг. Режимы I и II, отличающиеся длительностью интервалов между введениями DR5-B и продолжительностью воздействия, характеризуются сопоставимым уровнем результирующего противоопухолевого эффекта.

Продолжительность жизни мышей BALB/c nu/nu с ксенографтами НСТ116 в опытных и контрольных группах прослежена до конечной точки наблюдения, которая определялась состоянием животных-опухоленосителей. Условиями выполнения немедленной эвтаназии являлось: снижение веса животного более чем на 20%; увеличение поперечного размера опухоли до 18 мм; появление выраженного некроза или изъязвления на поверхности опухоли. Результаты наблюдения показывают, что продолжительность жизни мышей, получавших внутривенные инъекции DR5-B в режиме I, превышает продолжительность жизни животных в контрольной группе (Фиг. 2). По обобщенным результатам трех независимых экспериментов, средняя продолжительность жизни мышей, в группах, получавших DR5-B составила 45,2±9,6 дней со времени инокуляции опухолевых клеток, в контрольной группе животных - 34,5±7,3 дней (р=0,0016, t-критерий Стьюдента).

Наличие противоопухолевой активности DR5-B при его внутривенном введении в режиме I в разовой дозе 10 мг/кг на модели ксенографта НСТ116 подтверждено в трех независимых экспериментах, выполненных в разное время (Фиг. 3).

Таким образом, DR5-B при системном многократном введении в разовой дозе 10 мг/кг (суммарная доза 100 мг/кг) воспроизводимо приводит к умеренно выраженному, но статистически достоверному торможению роста подкожного ксенографта РТК человека НСТ116 у иммунодефицитных мышей. Величина ТРО варьирует в диапазоне 42-49% и удерживается на достигнутом уровне на протяжении не менее двух недель после окончания лечения животных.

Пример 2.

Сравнительный анализ действия TRAIL и DR5-B на клетки РТК человека НСТ116 in vitro и рост ксенографтов НСТ116 in vivo у мышей BALB/c nu/nu.

После вывода культуры из криохранения и перехода в режим наращивания клеточной массы клеточная линия НСТ116 проявляет устойчивый рост: время удвоения клеточной массы составляет около 24 часов, периодичность пересева - 2 раза в неделю, количество клеток во флаконе с площадью поверхности 75 см2 при достижении конфлюэнтного монослоя - от 11×106 до 13×106. Для исследования биологической активности препаратов линия клеток колоректальной карциномы НСТ116 культивируют в питательной среде DMEM, содержащей 10% (v/v) бычьей эмбриональной сыворотки при 37°С в атмосфере 5% СО2. Клетки переносят в стерильные 96-луночные планшеты (1×105 клеток на лунку для НСТ116 и инкубируют с препаратами TRAIL (SEQ ID NO 2) и DR5-B (SEQ ID NO 1) в течение 24 ч. Для определения жизнеспособности клеток добавляют МТТ (3-[4,5-диметилтиазол-2]-2,5-дифенил тетразолия бромид) в конечной концентрации 0,5 мг/мл и инкубируют в течение 3 ч при 37°С. Планшеты центрифугируют при 3000 об/мин («ELMI», Латвия) в течение 5 мин, удаляют надосадочную жидкость, в каждую лунку добавляют диметилсульфоксид (ДМСО) и оптическую плотность содержимого лунок измеряют с помощью планшетного спектрофотометра iMark («Bio-Rad», США) при длине волны 450 нм с вычитанием фона при 655 нм. Уровень ингибирования роста культуры (ИР) вычисляют по формуле:

ИР (%)=[(ODк-ODo)/ODк]*100%, где ODo и ODк - средняя оптическая плотность раствора формазана в опытных и контрольных лунках, соответственно.

Для расчета величины ИК50, (концентрации тестируемого вещества, при которой наблюдается 50% ингибирование роста культуры клеток in vitro) строят кривую роста зависимости ингибирования пролиферации клеточной культуры от концентрации препарата.

В результате проведенных исследований установлено, что внесение в культуральную среду DR5-B в концентрациях от 1 нг/мл до 500 нг/мл приводит к биологически значимому торможению роста культуры НСТ116. Величина максимального ингибирования пролиферации для DR5-B составляет 79%, а для TRAIL 72% (Фиг. 4). В указанных условиях величина ИК50, для DR5-B составляет 0,886±0,033 нг/мл, тогда как для TRAIL 23,004±0,3 нг/мл, что в 28,75 раз выше по сравнению с ИК50 рассчитанной для DR5-B. Таким образом, DR5-B более эффективно приводит к гибели клетки линии НСТ116, по сравнению с TRAIL.

Сравнительный анализ противоопухолевой активности TRAIL и DR5-B проводили на модели ксенографта НСТ116 у мышей BALB/c nu/nu. Методика подготовки модели и оценки результатов описаны в примере 1. Исследуемые вещества вводили животным в дозе 10 мг/кг в течении 10 дней, ежедневно с перерывом в 2 дня после пятой инъекции. Показано, что, по сравнению с TRAIL, DR5-B более эффективно подавляет рост ксенографта НСТ116 (Фиг. 4). В группе мышей-опухоленосителей, получавших DR5-B, максимальная величина ТРО варьировала в диапазоне 41-46%, а на завершающий срок наблюдения (33-й день от начала воздействия) составила 33%. В группе мышей, которым в той же дозе и в том же режиме вводили TRAIL, максимальная величина ТРО не превышала 25%, а на завершающий срок наблюдения составила 8%.

Таким образом, совокупность данных, полученных in vitro и in vivo, свидетельствует о том, что противоопухолевая активность цитокина TRAIL существенно увеличивается при внесении аминокислотных замен Y189N/R191K/Q193R/H264R/I266L/D269H, повышающих селективность белка к рецептору DR5.

Пример 3

Сравнительное исследование чувствительности клеток РТК человека НСТ116, НТ-29 и Сасо-2 in vitro и модельных опухолей НСТ116, НТ-29 и Сасо-2 in vivo к действию DR5-B.

Клетки РТК человека НСТ116, НТ-29 и Сасо-2 культивируют в пластиковых флаконах с площадью поверхности 75 см2 (Costar, США) в среде DMEM с L-глутамином (ПанЭко, Россия) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС; ПанЭко, Россия) в стандартных условиях культивирования (в увлажненной атмосфере при температуре 37×С и 5% атмосферном содержании CO2).

Цитотоксическую активность исследуемых веществ определяют с помощью МТТ теста, как описано в Примере 2.

Результаты тестирования in vitro показывают, что клетки НСТ116 чувствительны как к TRAIL, так и к DR5-B, однако эффективные концентрации DR5-B в 30 раз меньше, чем эффективные концентрации TRAIL (Фиг. 5А). Клетки линии Сасо-2, а также НТ-29 практически не погибают под воздействием TRAIL, тогда как DR5-B при концентрациях выше 100 нг/мл тормозит рост клеток Сасо-2 на 60%, клеток НТ-29 - на 27% (Фиг. 5А).

Исследование противоопухолевой активности DR5-B in vivo выполнено на моделях ксенотрансплантатов НСТ116, НТ-29 и Сасо-2 у мышей BALB/c nu/nu. Получение модели НСТ116 описано в Примере 1. Для получения ксенографта Сасо-2 опухолевые клетки инокулировали мышам подкожно, в Матригеле, в количестве 5×106 клеток на мышь, по той же методике. Клетки НТ-29 (3×106 клеток на мышь) инокулировали подкожно, на правый бок, в 100 мкл среды DMEM без эмбриональной телячьей сыворотки.

На моделях НСТ116 и НТ-29 воздействие начинали на 6-й день роста опухоли, на модели Сасо-2 - на 14-й день роста опухоли. DR5-B и контрольное вещество мышам вводили внутривенно, в хвостовую вену. Введение осуществляли в режиме I (см. Пример 1) двумя циклами по 5 дней каждый, с перерывом 2 дня (для НСТ116 и НТ-29) или 1 день (для Сасо-2). Разовая доза DR5-B составляла 10 мг/кг. Контрольным животным в том же режиме вводили 0,9% раствор хлористого натрия (физиологический раствор) в объеме, эквивалентном объему введения DR5-B.

Опухоли НСТ-116 и НТ29 измеряли дважды в неделю, опухоли Сасо-2 - один раз в неделю. Размер опухолей определяли, как описано в Примере 1. В течение времени наблюдения проводили оценку общего состояния мышей (ежедневно), регистрировали объем подкожных образований (два раза в неделю для НСТ116 и НТ-29; раз в 7-10 дней для Сасо-2), вес животных (раз в неделю).

Результаты оценки динамики роста ксенографтов опухолей НСТ116, НТ-29 и Сасо-2 у мышей в опытных группах, получавших курсовое лечение препаратом DR5-B, и у животных в контрольных группах, которым в том же режиме вводили физиологический раствор, представлены на Фигуре 5Б. Продолжительность наблюдения за животными с ксенографтами НСТ116 и НТ-29 от начала воздействия составляла 30 дней (после завершения курса воздействия - 18 дней). Наблюдение за животными с ксенографтами Сасо-2 от начала воздействия составляла 68 дней (после завершения курса воздействия - 57 дней).

На модели ксенографта НСТ116 величина торможения роста опухоли при многократном системном введении DR5-B достигала 35-37% и стабильно удерживалась на относительно высоком уровне в период от 15-го до 30-го дня после начала воздействия (Табл. 1). В группе мышей с ксенографтом Сасо-2, получавших DR5-B, по сравнению с контрольной группой животных, отмечалась слабая тенденция к торможению роста опухоли (Фиг. 5Б). Величина ТРО не превышала 30%, причем эта тенденция на данной модели проявлялась после завершения курса воздействия и удерживалась до конца наблюдения за животными (Табл. 2).

На модели ксенографта НТ-29 наблюдалась незначительная и кратковременная задержка роста опухоли на 8-10 день после начала воздействия (ТРО 20-30%), однако в целом динамика роста опухолей в опытной и контрольной группах мышей отличались несущественно (Табл. 3).

Таким образом, из числа исследованных вариантов моделей РТК человека у иммунодефицитных мышей наиболее чувствительным к действию DR5-B в использованном режиме воздействия является ксенографт НСТ116, менее чувствительным - ксенографт Сасо-2. Ксенографт НТ-29 может служить моделью опухоли, устойчивой к действию DR5-B.

SEQ ID NO 1.

SEQ ID NO 2.

Способ подавления роста опухолей колоректального рака in vivo путем воздействия генно-модифицированного варианта внеклеточного домена рекомбинантного белка TRAIL DR5-B, имеющего аминокислотную последовательность, как представлено в SEQ ID NO. 1, при этом DR5-B селективно связывается с рецептором смерти DR5 и вызывает гибель опухолевых клеток путем апоптоза.
Способ подавления роста опухолей генно-модифицированным вариантом цитокина TRAIL
Способ подавления роста опухолей генно-модифицированным вариантом цитокина TRAIL
Способ подавления роста опухолей генно-модифицированным вариантом цитокина TRAIL
Способ подавления роста опухолей генно-модифицированным вариантом цитокина TRAIL
Способ подавления роста опухолей генно-модифицированным вариантом цитокина TRAIL
Способ подавления роста опухолей генно-модифицированным вариантом цитокина TRAIL
Источник поступления информации: Роспатент

Showing 1-10 of 111 items.
20.02.2013
№216.012.26f9

Полипептид из морской анемоны heteractis crispa, обладающий анальгетическим действием

Изобретение относится к области биохимии, а именно к биологически активным полипептидам, обладающим анальгетическим действием. Предложен полипептид π-AnmTX Her 1b-1, обладающий анальгетическим действием и имеющий следующую аминокислотную последовательность:...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002475497
Дата охранного документа: 20.02.2013
10.09.2013
№216.012.66bf

Лигнан, обладающий анальгетическим действием

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к биологически активному соединению, обладающему анальгетическим действием. Лигнан, обладающий анальгетическим действием, структура которого описывается как...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002491950
Дата охранного документа: 10.09.2013
10.03.2014
№216.012.a94e

Способ включения квантовых точек методом соосаждения в пористые частицы карбоната кальция

Изобретение может быть использовано в биологических и медицинских исследованиях. Пористые частицы карбоната кальция формируют в результате реакции CaCl+2NaHCO→CaCO↓+2NaCl+2H, причем водный раствор квантовых точек, модифицированных избыточным количеством меркаптоуксусной кислоты, имеющей...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002509057
Дата охранного документа: 10.03.2014
27.05.2014
№216.012.cb0c

Флуоресцентный зонд и тест-система для определения активности фосфолипазы а2

Настоящее изобретение относится к области генной инженерии, конкретно к созданию тест-систем на основе флуоресцентных зондов, которые могут быть использованы в качестве субстратов для фосфолипаз А1 и А2. Зонд с наименованием...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002517746
Дата охранного документа: 27.05.2014
10.06.2014
№216.012.ccfe

Способ определения неспецифической устойчивости патогенных микроогранизмов к антибиотикам на основании измерения каталитической активности фосфодиэстераз, расщепляющих циклический дигуанозинмонофосфат

Изобретение относится к области биотехнологии и представляет собой способ определения неспецифической устойчивости патогенных микроорганизмов к антибиотикам и факта присутствия бактериальных биопленок на основании измерения каталитической активности фосфодиэстераз, расщепляющих циклический...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002518249
Дата охранного документа: 10.06.2014
20.07.2014
№216.012.decd

Способ длительного хранения in vitro растений осины

Изобретение относится к области биотехнологии растений. Изобретение представляет собой способ хранения растений осины в условиях in vitro, включающий культивирование микропобегов осины на питательной среде WPM с добавлением сахарозы 10-20 г/л, агар-агара 9 г/л и витаминов MS 1 мл/л, сорбитола...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002522823
Дата охранного документа: 20.07.2014
27.08.2014
№216.012.efa8

Рекомбинантные плазмидные днк, кодирующие гибридные полипептиды со свойствами красного флуоресцентного белка mcherry, для продуцирования гибридных флуоресцентных белков в escherichia coli

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой рекомбинантные плазмидные ДНК, кодирующие гибридные полипептиды со свойствами красного флуоресцентного белка mCherry. Рекомбинантная плазмидная ДНК pChFN3 кодирует гибридный белок ChFN3, который имеет свойства красного флуоресцентного...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002527171
Дата охранного документа: 27.08.2014
10.09.2014
№216.012.f3d8

Способ оценки чувствительности клеток рака легкого к доксорубицину на основании уровней экспрессии маркерных генов и набор для его осуществления

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ оценки чувствительности клеток рака легкого к доксорубицину (IC50), а также набор для осуществления данного способа. Способ основан на сравнении уровней экспрессии маркерных генов АВСС1, ERCC1, FTL, GSTP1, МТ2А, RRM1, TUBB3 в...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002528247
Дата охранного документа: 10.09.2014
10.11.2014
№216.013.0489

Способ формирования многофункциональных микросистем

Изобретение относится к области химии высокомолекулярных соединений, в частности к способам получения полимерных носителей путем химической модификации исходных полимерных микросфер на основе сополимера акролеина-стирола, полученных безэмульгаторной радикальной полимеризацией. Способ включает...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002532559
Дата охранного документа: 10.11.2014
10.04.2015
№216.013.3eea

Способ выявления белков в разных типах клеток млекопитающих и человека с помощью флуоресцеин-5-изотиоцианата на микроскопическом уровне

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для анализа локализации и содержания белкового компонента в клетках млекопитающих с различным уровнем синтетических процессов. Предлагается способ выявления внутриклеточных белков с помощью флуоресцеин-5-изотиоционата (ФИТЦ) в...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002547594
Дата охранного документа: 10.04.2015
Showing 1-10 of 52 items.
10.01.2013
№216.012.1a0d

Способ оценки риска прогрессирования немелкоклеточного рака легкого после хирургического лечения

Изобретение относится к области медицины. Предложен способ оценки риска прогрессирования немелкоклеточного рака легкого (НМРЛ) у больных после хирургического лечения. Определяют количество IgG типа аутологичных антител к нативному секреторному муцину MUC1 (анти-sMUC1 AAT) в сыворотке крови у...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002472161
Дата охранного документа: 10.01.2013
20.01.2013
№216.012.1da5

Способ прогнозирования послеоперационных осложнений у больных с опухолевым поражением легкого

Изобретение относится к области медицины. Способ состоит в том, что за 7-10 дней до операции проводят иммунологический анализ образцов крови, определяют общее количество лейкоцитов и относительное количество лимфоцитов в периферической крови. Дальнейший выбор параметров дополнительного...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002473083
Дата охранного документа: 20.01.2013
10.06.2013
№216.012.4729

Биогибридный материал для сорбции и деградации нефти и нефтепродуктов

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при безотходной очистке от аварийных разливов нефти и нефтепродуктов водных и твердых поверхностей. Предложен биогибридный материал для сорбции и деградации нефти и нефтепродуктов поверхностных и донных отложений. Материал включает...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002483797
Дата охранного документа: 10.06.2013
20.11.2013
№216.012.8260

Способ выделения рекомбинантных белков

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано при получении рекомбинантных форм представляющих практический интерес белков. Предложен способ получения рекомбинантного белка через его гибридный предшественник с природным сайтом расщепления энтеропептидазой, который...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002499052
Дата охранного документа: 20.11.2013
10.12.2013
№216.012.88ba

Способ ренатурации мембранных белков

Изобретение относится к молекулярной биологии и биотехнологии. Предложен способ получения ренатурированных мембранных белков. Способ включает получение гомогенного раствора, содержащего денатурированный мембранный белок, смесь детергентов, фосфолипид или смесь фосфолипидов и аполипопротеин или...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002500684
Дата охранного документа: 10.12.2013
20.02.2014
№216.012.a240

Способ получения биомассы зеленых микроводорослей, обогащенной жирными кислотами

Изобретение относится к фотобиотехнологии и микробиологии. Инокулят миуроводоросли Desmodesmus sp.штамм 2С166Е вносят в минеральную среду BG-11 до конечной концентрации хлорофилла в смеси 4-6 мкг/мл. Культивируют при постоянном освещении и барботировании среды атмосферным воздухом в течение...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002507251
Дата охранного документа: 20.02.2014
27.03.2014
№216.012.ae11

Способ получения клеток для заместительной клеточной терапии патологий печени

Изобретение относится к области клеточной биологии и медицины. Предложен способ получения клеток для заместительной клеточной терапии печени, заключающийся в выделении из подчелюстной слюнной железы популяции стволовых клеток, экспрессирующей маркеры CD49f и EpCAM, инкубировании ее с...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002510276
Дата охранного документа: 27.03.2014
20.08.2014
№216.012.ebf5

Рекомбинантная плазмидная днк pest877, детерминирующая экспрессию полипептида с активностью эстеразы psychrobacter cryohalolentis к5 на поверхности клеток escherichia coli, и штамм бактерий escherichia coli bl21(de3)plyss/pest877-продуцент полипептида с активностью эстеразы psychrobacter cryohalolentis к5 на поверхности клеток

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии и касается рекомбинантной плазмидной ДНК pEst877, детерминирующей экспрессию полипептида с активностью эстеразы P. cryohalolentis К5Т на поверхности клеток, с мол. массой 3,64 Md (5,519 т.п.о.), состоящей из NcoI/XhoI - фрагмента ДНК...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002526213
Дата охранного документа: 20.08.2014
27.08.2014
№216.012.efa8

Рекомбинантные плазмидные днк, кодирующие гибридные полипептиды со свойствами красного флуоресцентного белка mcherry, для продуцирования гибридных флуоресцентных белков в escherichia coli

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой рекомбинантные плазмидные ДНК, кодирующие гибридные полипептиды со свойствами красного флуоресцентного белка mCherry. Рекомбинантная плазмидная ДНК pChFN3 кодирует гибридный белок ChFN3, который имеет свойства красного флуоресцентного...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002527171
Дата охранного документа: 27.08.2014
20.09.2014
№216.012.f636

Биоразлагаемый композиционный сорбент нефти и нефтепродуктов

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен биоразлагаемый композиционный сорбент нефти и нефтепродуктов. Сорбент содержит термопластичный полимер с волокнообразующими свойствами, полученный методом аэродинамического формования, и нестерильные растения рода Сфагнум (Sphagnum),...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002528863
Дата охранного документа: 20.09.2014
+ добавить свой РИД