СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МОДЕЛЬНОЙ ИММОРТАЛИЗОВАННОЙ ЛИНИИ КЛЕТОК, СОДЕРЖАЩЕЙ РЕКОНСТРУИРОВАННЫЙ В-КЛЕТОЧНЫЙ РЕЦЕПТОР НЕХОДЖКИНСКИХ ЛИМФОМ ЧЕЛОВЕКА

Область техники

Изобретение относится к биотехнологии, а именно: к способу получения модельной иммортализованной линии клеток, содержащей поверхностно-экспонированную трансмемранно-заякоренную форму В-клеточного рецептора (BCR) патологических лимфоцитов неходжкинских лимфом (НХЛ) человека в формате одноцепочечного антитела (scFv), слитного с константным доменом иммуноглобулина человека класса IgG1 (Fc) и трансмемранным якорем, для разработки персонифицированных подходов к терапии лимфопролиферативных заболеваний человека.

Уровень техники

Терапия лимфопролиферативных заболеваний, в частности неходжкинских лимфом и аутоиммунных заболеваний, в частности PC, несмотря на успехи, достигнутые в последние годы с помощью рекомбинантных антител и других молекул, специфически действующих на компоненты иммунной системы, не позволяет добиться полного выздоровления пациента. Уровни инвалидизации не дают основания для позитивного прогноза в плане социальной реабилитации. Имеющиеся подходы крайне затратны для бюджетов развитых стран и с учетом длительности лечения ставят под угрозу всю систему реабилитации этих пациентов. Существующие на сегодняшний момент методики лечения лимфопролиферативных заболеваний включают в себя в основном иммуносупрессирующие и цитотоксические препараты ненаправленного действия, приводящие в большом количестве случаев к системным осложнениям. К сожалению, основная масса лекарственных средств, применяемых в России для лечения приведенных патологий, производится за пределами Российской Федерации.

Терапия, направленная на определенную популяцию лимфоцитов, в перспективе является универсальным средством для лечения целого ряда В-клеточных заболеваний. На сегодняшний день элиминацию аутореактивных В-клеток осуществляют с помощью введения моноклонального анти-CD19/20 антитела Ритуксимаб (Rituximab, Rituxan, MabThera), которое активно используется в терапии лимфом и аутоиммунных заболеваний [Arkfeld, D.G. Rheumatol Int, 2008; Wang, M., et al. Leukemia, 2013; Ransohoff, R.M. et al. Neurotherapeutics, 2007; Cross, A.H. et al. J Neuroimmunol, 2006]. Клиническое применение данного препарата в значительной степени ограничено и осуществляется в исключительных случаях, так как приводит к элиминации большинства В-лимфоцитов организма и, как следствие, широкому спектру побочных эффектов [Castillo-Trivino, Т., et al. PLoS One, 2013]. Поверхностный иммуноглобулин аутореактивных В-лимфоцитов (В-клеточный рецептор, BCR) - уникальный рецептор, отличающий определенную клонально гомогенную популяцию В-клеток от всех других клеток организма. Для того, чтобы изучить функциональные особенности каждого индивидуального патологического BCR необходимо получение стабильной линии клеток, несущих данный рецептор. Создание иммортализованной линии клеток на основе биоптического материала пациентов с НХЛ крайне затратная и трудновоспроизводимая методика. Более того, для многих типов НХЛ опухолевое микроокружение играет ключевую роль в развитии заболевания. Зачастую воссоздать такие условия in vitro практически невозможно. Одной из наиболее изученных иммортализованных линий НХЛ человека является линия В-клеток Raji. Клетки Raji обладают высокопролиферативной активностью в культуре, а также туморогенны для различных линий иммунокомпетентных мышей. Таким образом, клетки Raji являются удобной линией клеток, для создания модельной иммортализованной лимфомной линии, содержащей поверхостно-экспонированный аналог В-клеточного рецептора НХЛ. Для интеграции последовательности опухолевого BCR необходимо модифицировать клетки Raji генами тяжелой и легкой цепи иммуноглобулина. Однако, данная задача несет в себе множество сложностей, связанных с необходимостью ко-трансфекции (или ко-трансдукции) клеток и дополнительным этапом подверждения экспрессии на мембране клетки обеих цепей иммноглобулина. Еще одним недостатком можно считать наличие собственного BCR клеток Raji, что повлечет за собой некорректную сборку комплекса BCR, а, возможно, и образование химерных пар легких и тяжелых цепей Ig пациента и клеток Raji. Гораздо более удобным подходом является получение трансмембранной-заякоренной формы опухолевого BCR в формате одноцепочечного антитела scFv, слитного с константным доменом иммуноглобулина человека класса IgG1 Fc и трансмембранным якорем. Преимущества данного способа заключаются в корректности сборки распознающего домена опухолевого BCR (соотношение VH и VL на мембране клетки 1:1, отсутствие нежелательных пар легких и тяжелых цепей Ig пациента и клеток Raji), а также в легкости детекции опухолевого BCR флуоресцетно меченными антителами, специфичными к IgG1.

Объектом изобретения является генетическая конструкция, кодирующая реконструированный В-клеточный рецептор патологических лимфоцитов неходжкинских лимфом, содержащий трансмембранный домен PDGFR для заякоревания на мембране клетки. Генетическая конструкция находится в составе лентивирусного вектора pLV2, что позволяет получать соответсвующие вирусные частицы, трансдуцировать эукариотические клетки и получать линии клеток, несущие поверхностно-экспонированную трансмемранно-заякоренную форму В-клеточного рецептора.

Известны способы получения линий клеток, несущих реконструированную поверхностно-экспонированную трансмемранно-заякоренную форму В-клеточного рецептора. Однако, стоит отметить, что основной акцент данного направления сделан на получение поверхностно-экспонированных аналогов В-клеточного рецептора в составе химерных антигенных рецепторов Т-клеток CAR для терапии лимфопролиферативных заболеваний.

Лидером разработок в данной области в настоящее время является фирма NOVARTIS. Известны способы получения лимфоцитов, модифицированных поверхностно-экспонированным аналогом В-клеточного рецептора, специфического к определенными антигенным детерминантам, слитного с костимулирующими доменами Т-клеточного рецептора (AU 20150292811 20150721, AU 20150292744 20150721 и AU 20150292755 20150721).

Извесен способ получения Т-лимфоцитов модифированных химерными рецепторами, а также их вариантами (TW 20150144073 20151228).

Извесен способ получения лимфоцитов, модифицированных химерными поверхностными иммуноглобулинами, специфичными к антигенам CD19, CD20, CD22, CD34, CD123, FLT-3, ROR1, CD79b, CD179b или CD79a (TW 201639963).

Известна генетическая конструкция, кодирующая мембранно-заякоренное одноцепочечное антитело, специфичное к ТАА антигену в составе CAR (US 2016361360 A1).

Раскрытие изобретения

Изобретение решает задачу получения удобной в исследовании иммортализованной лимфомной линии клеток, несущей паталогический В-клеточный рецептор НХЛ.

Поставленная задача решается за счет способа получения генетической конструкции - рекомбинантной плазмидной ДНК pLV2-EF1a-scFv-Fc-MTA, кодирующей трансмембранно-заякоренный одноцепочечный BCR НХЛ человека, состоящей из плазмиды pLV2-EF1a и нуклеотидной последовательности синтетического гена трансмембранно-заякоренного одноцепочечного иммуноглобулина (SEQ ID NO 12, SEQ ID NO 13). Также плазмидный вектор содержит нуклеотидную последовательность конститутивного промотора гена фактора элонгации 1-альфа, ответственные за формирование псевдовируса и интеграцию гена в геном клетки фланкирующие последовательности 3'LTRs, HIV-1ψ, RRE, WPRE, 5'LTR, и нуклеотидную последовательность сигнального пептида интерлейкина-2, необходимую для секреции экспрессируемых продуктов на мембране клетки. Нуклеотидную последовательность одноцепочечного BCR НХЛ человека фланкируют сайты рестрикции эндонуклеазы рестрикции SfiI (GGCCNNNN^∧ NGGCC), позволяющие в одну стадию интегрировать в плазмидный вектор pLV2-EF1a-scFv-Fc-MTA (SEQ ID NO 1) последовательности любого В-клеточного рецептора в формате одноцепочечного иммуноглобулина. Таким образом, в плазмидном векторе нуклеотидные последовательности расположены в следующем порядке: 3'LTR (181 п.о.) (SEQ ID NO 2), HIV-1ψ (126 п.о.) (SEQ ID NO 3), RRE (234 п.о.) (SEQ ID NO 4), EF1a (1136 п.o.) (SEQ ID NO 5), IL-2 (60 п.o.) (SEQ ID NO 6), scFv (756 п.o.) (SEQ ID NO 7), Fc (696 п.o.) (SEQ ID NO 8), PDGFR (MTA) (210 п.o.) (SEQ ID NO 9) WPRE (589 п.o.) (SEQ ID NO 10), 5'LTR (181 п.o.) (SEQ ID NO 11). Для каждого пациента с диагнозом НХЛ необходимо производить реконструкцию BCR опухолевых клеток конкретного пациента. Данное изобретение позволяет валидировать персонифицированные препараты, направленно действующие на опухолевые клетки больного лимфомой за счет специфического распознавания терапевтических агентов поверхностными иммуноглобулинами раковых клеток пациента.

Получение лентивирусных частиц, несущих ген BCR патологических лимфоцитов неходжкинских лимфом (НХЛ), происходит с использованием коммерческого набора Lenti-X™ Packaging Single Shots VSV-G (#631275, TaKaRa) и клеток линии Lenti-X™ 293T Cell Line (#632180, TaKaRa) согласно инструкции производителя. Далее полученные лентивирусные частицы могут быть использованы для трансдукции клеток Raji или лобой другой эукариотической линии человека. Через 72 часа модифицированные клетки могут быть легко детектированы с помошью флуоресцетно меченных антител, специфичных к Fc домену антитела человека класса IgG1 (2048-09, SouthernBiotech). Для получения гомогенной популяции клеток экспрессирующих реконструированный В-клеточный рецептор BCR патологических лимфоцитов неходжкинских лимфом может быть использован метод проточной цитофлуориметрии с последующей сортировкой клеток, содержащих scFv-Fc-MTA.

Данное изобретение позволяет получить иммортализованную линию клеток, несущих В-клеточный рецептор патологических лимфоцитов неходжкинских лимфом НХЛ. В качестве иммортализованной линии клеток, несущей реконтсруированный BCR НХЛ выступают линии клеток человека как суспензионные так и адгезионные. Неоспоримым преимуществом изобретения язвляется возможность получения лентивирусных частиц, несущих ген BCR патологических лимфоцитов неходжкинских лимфом НХЛ, что позволяет модифицировать рецептором труднотрансфецируемые линии лимфомных или иных эукариотических клеток.

Изобретение иллюстрируют следующие графические материалы:

Фиг. 1 - Схема генетической конструкции рекомбинантной плазмидной ДНК pLV2-EF1a-scFv-Fc-MTA

Фиг. 2 - Анализ экспрессии трансмембранного рецептора BCR лимфомы модифицированными клетками Raji методом флуоресцентной микроскопии: флуоресценция клеток Raji-scFv-Fc-MTA, окрашенных антителами, специфичными к константному домену иммуноглобулина человека (А); клетки в видимом свете (Б)

Фиг. 3 - Взаимодействие химерного рецептора, содержащего циклопептид CILDLPKFC, с трансмембранно-заякоренным BCR приводит к активации Т-клеток (ILDLPKF-CAR)

Фиг. 4 - Анализ цитотоксического действия CILDLPKFC-CAR Т-клеток по отношению к клеткам-мишеням Raji scFv-Fc-MTA и контрольным клеткам Raji

Таблица. Динамика роста опухолевых клеток в экспериментальных группах Осуществление изобретения.

ПРИМЕР 1. Получение линии клеток человека содержащей реконструированный В-клеточный рецептор лимфомных клеток пациента.

Чтобы воссоздать трансмембранно-заякоренный BCR раковых клеток изолируют биоптат лимфоузла пациента с диагнозом НХЛ. Полученный биоптат используют для изоляции суммарной мРНК и синтеза кДНК методом обратной транскрипции. Синтезированную кДНК методом гетеродуплексного анализа используют для идентификации вариабельных доменов легких VL и тяжелых цепей VH В-клеточного рецептора. Идентифицированные последовательности генов VH и VL лимфомных клеток интегрируют в плазмидный вектор, содержащий ген константного домена иммуноглобулина человека, слитного с мембранным якорем pLV2-EF1a-scFv-Fc-MTA. Для этого гены VH амплифицируют ПЦР, обрабатывают эндонуклеазами рестрикции XbaI и HindIII (New England Biolabs), а затем лигируют с обработанными аналогичным образом вектором pCOMB 3XL. Гены VL амплифицируют ПЦР, обрабатывают эндонуклеазами рестрикции SalI и BssHII (New England Biolabs), а затем лигируют с обработанным аналогичным образом вектором pCOMB 3XL VH, полученным ранее. Далее плазмидный вектор pCOMB 3XL VH VL, содержащий гены вариабельных доменов антитела, обрабатывают эндонуклеазой рестрикции SfiI, а затем лигируют с, обработанным аналогичным образом, вектором pLV2-EF1a-scFv-Fc-MTA (фиг. 1).

Для получения лентивирусных частиц, несущих гены трансмембранного BCR лимфомы, производят трансфекцию эукариотических клеток линии Lenti-X™ 293Т Cell Line методом липофекции. Спустя 72 часа культуральную среду собирают, центрифугирую™ и фильтруют с помощью 0.22 нм фильтров (Millipore). Концентрацию вирусов в собранном супернатанте определяют набором Lenti-X™ р24 Rapid Titer Kit (Clontech).

Наработанные лентивирусные частицы scFv-Fc-MTA используют для трансдукции лимфомных линий клеток человека Raji. Через 48 часов после трансдукции методом проточной цитофлуориметрии на приборе BD FACSAria III сортируют клетки, содержащие scFv-Fc-MTA. Далее методом флуоресцентной микроскопии подтверждают экспрессию трансмембранного рецептора BCR лимфомы модифицированными клетками Raji (фиг. 2). Из данных, представленных на фиг. 2 видно, что модифицированные клетки Raij несут на своей поверхности реконструированный В-клеточный рецептор лимфомных клеток, в то время как не модифицированные Raji не окрашиваются специфическими антителами.

ПРИМЕР 2.. Получение линии клеток человека содержащей реконструированный В-клеточный рецептор лимфомных клеток пациента для анализа мембранных взаимодействий рецепторов.

Способ получения модельных клеток, содержащих реконструированный В-клеточный рецептор используют для анализа взаимодействия поверхностного иммуноглобулина с другими рецепторными молекулами.

Лейкозную линию клеток человека Jurkat модифицируют BCR патологических лимфоцитов неходжкинских лимфом НХЛ человека. Через 48 часов после трансдукции методом проточной цитофлуориметрии на приборе BD FACSAria III сортируют клетки, содержащие BCR. Далее методом флуоресцентной микроскопии подтверждают экспрессию трансмембранного рецептора BCR лимфомы модифицированными клетками Jurkat. Полученные клетки трансдуцируют химерным рецоптором, содержащим специфический лиганд данного BCR (пептид CILDLPKFC) и костимуляторные домены химерного антигенного рецептора. При взаимодействии реконструированного BCR с химерным антигенным рецептором экспонированных на клетке происходит инициация сигнального пути активации лимфоцита. Наиболее удобным мпетодом визуализации активации является детекция экспресии маркера ранней активации Т клеток CD69.

После трансдукции, клетки анализируют на наличие экспресии маркера активации Т клеток CD69 с помощью флуоресцентно меченных антител (anti-CD69-FITC, Biolegend). В качестве отрицательного котнроля активации используют нетрансдуцированные клетки. В качестве положительного контроля используют клетки инкубированные с РМА (phorbol 12-myristate 13-acetate), который активирует все Т клетки.

На модельной системе in vitro было показано, что специфический лиганд CILDLPKFC связывается с трансмембранной формой BCR лимфомных клеток, а также способен активировать Т-клетки человека в составе химерного антигенного рецептора III поколения (фиг. 3).

ПРИМЕР 3. Получение линии клеток человека содержащей реконструированный В-клеточный рецептор лимфомных клеток пациента для анализа терапевтической эффективности иммунотерапии.

Способ может быть использован для анализа терапевтического потенциала разрабатываемых подходов антиген-специфической терапии лимфопролиферативных заболеваний. Для анализа антиген-специфической терапии лимфопролиферативных заболеваний на основе химерных антигенных рецепторов используют иммортализованную линию клеток Raji, несущую на своей поверхности трансмембранно-заякоренный BCR раковых клеток пациента с диагнозом НХЛ. Реконструированный В-клеточный рецептор патологических лимфоцитов неходжкинских лимфом человека на основе модельных иммортализованных линий клеток позволяет подтвердить применимость предлагаемого способа, направленного на элиминацию патологических лимфоцитов in vitro и in vivo. Чтобы воссоздать трансмембранно-заякоренный BCR раковых клеток пациента последовательности генов VH и VL лимфомных клеток интегрируют в плазмидный вектор pLV2-EF1a-scFv-Fc-MTA. В свою очередь, пептидный лиганд лимфомных клеток CILDLPKFC интегрируют в состав химерного антигенного рецептора Т-лимфоцитов III поколения CARIII.

Изолированные CD8 Т-лимфоциты разбавляют до концентрации 1 млн/мл в среде RPMI (Панэко) с добавлением 10% сыворотки (HyClone). К клеткам добавляют Ил-2 (Панэко) и магнитные шары с иммобилизованными анти-CD3 и анти-CD28 антителами Dynabeads® Human T-Activator CD3/CD28 for T Cell Expansion and Activation (Gibco). Через 4 дня клетки трансдуцируют лентивирусными частицами, содержащими ген химерного рецептора CILDLPKFC-CAR. Далее, полученные CILDLPKFC-CAR Т-клетки добавляют к клеткам-мишеням Raji scFv-Fc-MTA и контрольным клеткам Raji в соотношении 2.5/1, 5/1, 10/1, 20/1, 40/1 и 80/1. Через 6 часов инкубации с помощью набора LDH Cytotoxicity Assay Kit определяют уровень специфической цитотоксичности. Полученные результаты представлены на фиг. 4.

Как видно из данных, представленных на фиг. 4, Т-клетки, модифицированные CILDLPKFC-CAR, эффективно лизируют клетки-мишени в отличие от контрольных клеток, не имеющих рецептор лимфомных клеток in vitro.

Для подтверждения терапевтической эффективности in vivo мышей линии NOD.SCID CB17Prkdcscid/NcrCrl разделяют на 4 группы по 10 голов в каждой (табл. 1). Животным подкожно вводят 10 млн клеток Raji scFv-Fc-MTA или Raji. На 3 день животным внутривенно вводят 5 млн Т-клеток (группа 1 и 3) или CILDLPKFC-CAR Т-клеток (группа 2 и 4). Далее наблюдают за развитием опухолей у модельных животных из разных групп. Полученные результаты представлены в таблице.

Из данных, представленных в таблице 1, видно, что введение терапевтических Т-клеток значительно снижает развитие опухолей у иммунодефицитных животных (группа 4). В свою очередь, введение Т-клеток никак не влияет на туморогенность контрольных клеток Raji без целевого рецептора, что дополнительно подтверждает избирательность отобранного пептида (группа 2). Дополнительным подтверждением направленности действия химерного рецептора является отсутствие терапевтического эффекта в группе 3, в которой животным с клетками-мишенями Raji scFv-Fc-MTA вводили Т-клетки без рецептора.