×
20.05.2020
220.018.1e16

ПРИМЕНЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНОГО АНАЛОГА ВОДОРАСТВОРИМОГО ДОМЕНА БЕЛКА LYNX1 ДЛЯ ТОРМОЖЕНИЯ РОСТА КЛЕТОК КАРЦИНОМ

Вид РИД

Изобретение

Юридическая информация Свернуть Развернуть
Краткое описание РИД Свернуть Развернуть
Аннотация: Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к применению рекомбинантного водорастворимого домена Lynx1 с SEQ ID NO:1 для торможения роста карцином, и может быть использовано в медицине. Применение водорастворимого домена Lynx1 в концентрациях от 10 нМ до 10 мкМ позволяет добиться торможения роста клеток карцином легкого. 2 н. и 1 з.п. ф-лы, 4 ил., 2 пр.
Реферат Свернуть Развернуть

Изобретение относится к медицине и биологии, к области экспериментальной онкологии. Способ может быть использован для торможения роста и терапии опухолей, в том числе в клинике.

Онкологические заболевания являются второй по распространенности причиной смерти населения после заболеваний сердечно-сосудистой системы, как в России, так и в мире, поэтому поиск новых эффективных стратегий терапии опухолей входит в список приоритетных проблем современной медицины. В настоящее время для торможения роста опухолей используют как классические химиотерапевтические препараты, так и препараты, целенаправленно воздействующие на молекулярную мишень, контролирующую рост опухоли.

Известно, что с употреблением никотина (табака) связано развитие рака головы, шеи, груди, легкого, поджелудочной железы, толстой кишки, желудка и мочевого пузыря. Активация никотинового ацетилхолинового рецептора альфа7 типа (а7-nAChR) никотином стимулирует пролиферацию раковых клеток, запуская, в свою очередь, различные внутриклеточные сигнальные пути, способствующие пролиферации опухолевых клеток [Egleton RD, Brown KC, Dasgupta P. (2008). Trends Pharmacol Sci. 29:151-8]. Таким образом, модуляторы nAChR могут выступать в качестве прототипов новых эффективных таргетных противоопухолевых препаратов.

Известен способ торможения роста опухолей с использованием антагонистов (нейротоксинов), действующих на а7-nAChR [Grozio A, Paleari L, Catassi A, Servent D, Cilli M, Piccardi F, Paganuzzi M, Cesario A, Granone P, Mourier G, Russo P. (2008) Int. J. Cancer. 122(8):1911-5; Zhang H. (2016) Drug Design, Development and Therapy. 10:3867-72; Trombino S, Cesario A, Margaritora S, Granone P, Motta G, Falugi C, Russo P. (2004) Cancer Res. 64(1):135-45]. Недостатком этого способа является необратимость связывания нейротоксинов с рецептором, их низкая специфичность и высокая системная токсичность.

В организме человека обнаружен ряд трехпетельных пептидов, гомологичных по пространственной структуре токсинам змей, и воздействующих на никотиновые ацетилхолиновые рецепторы. Примером таких пептидов может быть мембранозаякоренный белок Lynx1 [Miwa JM, Ibanez-Tallon I, Crabtree GW, Sánchez R, Sali A, Role LW, Heintz N. (1999) Neuron. 23:105-114]. Известно, что нокдаун белка Lynx1 способствует увеличению скорости роста клеток карциномы легкого А549, в то время как гиперэкспрессия мембранозаякоренного белка Lynx1 в клетках А549, наоборот тормозит пролиферацию клеток А549 [Fu XW, Song PF, Spindel ER. (2015) Int Immunopharmacol. 29:93-98]. Показано, что рекомбинантный аналог водорастворимого домена Lynx1 человека (SEQ №1) является модулятором α7-nAChR [Lyukmanova EN, Shenkarev ZO, Shulepko MA, Mineev KS, D'Hoedt D, Kasheverov IE, Filkin SY, Krivolapova AP, Janickova H, Dolezal V, Dolgikh DA, Arseniev AS, Bertrand D, Tsetlin VI, Kirpichnikov MP. (2011) J Biol Chem. 286:10618-10627]. Однако применение рекомбинантного аналога водорастворимого домена Lynx1 (SEQ №1) для торможения роста клеток опухолей никем ранее не предлагалось.

Наиболее близким к заявленному является способ торможения роста опухолевых клеток А549 при гиперэкспрессии в них мембранозаякоренного белка Lynx1 с помощью лентивирусной трансфекции [Fu XW, Song PF, Spindel ER. (2015) Int Immunopharmacol. 29:93-98]. Однако данный способ подразумевает применение для торможения роста клеток с помощью полноразмерного мембранозаякоренного Lynx1, что делает практически невозможным его применение в терапевтических целях.

Таким образом, технической проблемой, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является создание нового способа торможения роста опухолей с использованием рекомбинантного белка водорастворимого домена Lynx1 (SEQ №1). Поставленная техническая проблема достигается за счет применения рекомбинантного аналога водорастворимого домена Lynx1 (SEQ №1) для торможения роста клеток опухоли, при этом остановка роста опухолей достигается за счет действия рекомбинантного аналога водорастворимого домена Lynx1 на nAChR α7 типа.

Рекомбинантный аналог водорастворимого домена Lynx1 (SEQ №1) получают в бактериальной системе экспрессии, при которой белок ренатурируют из цитоплазматических телец включения E. coli [М.А. Шулепко, Е.Н. Люкманова, И.Е. Кашеверов, Д.А. Долгих, В.И. Цетлин, М.П. Кирпичников. (2011) Биоорг. хим., 37(5): 609-615].

Изобретение иллюстрируют графические материалы:

На фиг. 1 представлены данные по влиянию рекомбинантного аналога водорастворимого домена Lynx1 на жизнеспособность клеток карциномы легкого А549. Клетки высевают за 24 часа до эксперимента на 96-луночный культуральный планшет, затем инкубируют с рекомбинантным аналогом водорастворимого домена Lynx1 в течение 72 часов с заменой среды каждые сутки. Жизнеспособность опухолей определяют с помощью WST-1-теста.

На фиг. 2, 3, 4 представлены данные по антипролиферативной активности рекомбинантного аналога водорастворимого домена Lynx1 на клетках карциномы легкого А549 после нокдауна в них экспрессии α7-nAChR при помощи интерферирующей РНК. Клетки высевают в 6-луночный культуральный планшет, трансфицируют интерферирующими РНК (siRNA), либо интерферирующими РНК и плазмидой, кодирующей ген полноразмерного α7-nAChR (pVAX1/α7-nAChR), после чего анализируют экспрессию α7-nAChR на проточном цитометре (А – репрезентативное распределение экспрессии α7-nAChR в популяции клеток, Б – подсчет медианы флуоресценции (MFI) α-бунгаротоксина) и инкубируют с рекомбинантным аналогом водорастворимого домена Lynx1 (вд-Lynx1) в течение 72 часов с заменой среды каждые сутки. Жизнеспособность опухолей определяют с помощью WST-1-теста (В). * (p<0.05) достоверное отличие между группами данных согласно одностороннему тесту ANOVA с последующим Dunnet's/hoc тестом. #### (p<0.05) означает разницу между контрольными и обработанными вд-Lynx1 клетками согласно двухстороннему t-тесту, количество жизнеспособных контрольных клеток показано пунктирной линией (100 %).

Изобретение иллюстрируют примеры.

Пример 1. Изобретение раскрывается на примере клеток карциномы легкого А549. Клетки культивируются в питательной среде DMEM c добавлением 10% (по объему) эмбриональной бычьей сыворотки и 2мМ глутамина и 25 мМ HEPES. Клетки А549 культивируют в культуральных флаконах объемом 75 мл и пересаживают минимум 2 раза в неделю. Клетки высевают в лунки культурального 96-луночного планшета (5000 клеток на лунку), через сутки добавляют различные концентрации рекомбинантного аналога водорастворимого домена Lynx1 (SEQ №1) и инкубируют 72 часа с заменой среды каждые сутки. Затем определяют жизнеспособность клеток А549 при помощи теста на активность митохондриальной сукцинатдегидрогеназы (WST-1-тест). Для этого, к клеткам добавляют субстрат митохондриальной сукцинатдегидрогеназы WST-1 и переносчик электронов 1-метокси-5-метилфеназин метилсульфат (конечная концентрация составляет 1 мМ WST-1 и 20 мкМ 1-метокси-5-метилфеназин метилсульфата) и инкубируют в течение 4 часов. WST-1 в митохондриях с неповрежденной мембраной при этом восстанавливается сукцинатдегидрогеназой до растворимого формазана. После инкубации определяют поглощение в лунках при 450 нМ с выравниванием на фон при 655 нМ. Пример показывает, что рекомбинантный аналог водорастворимого домена Lynx1 эффективно ингибирует рост клеток А549 до 65,3±1,1 % от контроля при 72-часовой инкубации с полумаксимальной эффективной концентрацией в 2,3±0,4 нМ (фиг. 1).

Пример 2. Изобретение раскрывается на примере клеток А549. Клетки высевают в 6-луночный культуральный планшет и через 24 часа трансфицируют 1 мкг интерферирующих РНК к nAChR α7 типа (GGAAGCUUUACAAGGAGCUGGUCAA и UUGACCAGCUCCUUGUAAAGCUUCC), либо 1 мкг интерфирирующих РНК к α7-nAChR и 10 мкг плазмиды pVAX1/α7-nAChR, которая содержит ген полноразмерного α7-nAChR. Клетки после трансфекции инкубируют 48 часов, затем часть клеток высевают на лунки 96-луночного культурального планшета (5000 клеток на лунку) и инкубируют в течении 72 часов с рекомбинантным аналогом водорастворимого домена Lynx1 (SEQ №1), а другую часть клеток инкубируют с флуоресцентно-меченным α-бунгаротоксином и анализируют на проточном цитометре FACSCalibur для определения уровня экспрессии функциональных α7-nAChR на поверхности клеток. Трансфекция клеток интерферирующими РНК приводит к значительному снижению уровня экспрессии в клетках А549 α7-nAChR, а ко-трансфекция клеток с интерферирующими РНК и плазмидой pVAX1/α7-nAChR полностью восстанавливает уровень экспрессии α7-nAChR в клетках практически до контрольного уровня (фиг. 2). Нокдаун экспрессии α7-nAChR в клетках А549 приводит к полной отмене антипролиферативного эффекта рекомбинантного аналога водорастворимого домена Lynx1 (SEQ №1), в то время как восстановление экспрессии α7-nAChR в клетках сопровождается восстановлением антипролиферативного эффекта рекомбинантного аналога водорастворимого домена Lynx1 (SEQ №1) (фиг. 3). Пример показывает, что антипролиферативный эффект рекомбинантного аналога водорастворимого домена Lynx1 (SEQ №1) в клетках А549 осуществляется посредством взаимодействия с nAChR α7 типа.

--->

SEQ № 1

Met Leu Asp Cys His Val Cys Ala Tyr Asn Gly Asp Asn Cys Phe Asn Pro Met Arg Cys Pro Ala

1 5 10 15 20

Met Val Ala Tyr Cys Met Thr Thr Arg Thr Tyr Tyr Thr Pro Thr Arg Met Lys Val Ser Lys Ser Cys

25 30 35 40 45

Val Pro Arg Cys Phe Glu Thr Val Tyr Asp Gly Tyr Ser Lys His Ala Ser Thr Thr Ser Cys Cys Gln

50 55 60 65

Tyr Asp Leu Cys Asn Gly

70

<---


ПРИМЕНЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНОГО АНАЛОГА ВОДОРАСТВОРИМОГО ДОМЕНА БЕЛКА LYNX1 ДЛЯ ТОРМОЖЕНИЯ РОСТА КЛЕТОК КАРЦИНОМ
ПРИМЕНЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНОГО АНАЛОГА ВОДОРАСТВОРИМОГО ДОМЕНА БЕЛКА LYNX1 ДЛЯ ТОРМОЖЕНИЯ РОСТА КЛЕТОК КАРЦИНОМ
Источник поступления информации: Роспатент

Showing 1-10 of 111 items.
20.02.2013
№216.012.26f9

Полипептид из морской анемоны heteractis crispa, обладающий анальгетическим действием

Изобретение относится к области биохимии, а именно к биологически активным полипептидам, обладающим анальгетическим действием. Предложен полипептид π-AnmTX Her 1b-1, обладающий анальгетическим действием и имеющий следующую аминокислотную последовательность:...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002475497
Дата охранного документа: 20.02.2013
10.09.2013
№216.012.66bf

Лигнан, обладающий анальгетическим действием

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к биологически активному соединению, обладающему анальгетическим действием. Лигнан, обладающий анальгетическим действием, структура которого описывается как...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002491950
Дата охранного документа: 10.09.2013
10.03.2014
№216.012.a94e

Способ включения квантовых точек методом соосаждения в пористые частицы карбоната кальция

Изобретение может быть использовано в биологических и медицинских исследованиях. Пористые частицы карбоната кальция формируют в результате реакции CaCl+2NaHCO→CaCO↓+2NaCl+2H, причем водный раствор квантовых точек, модифицированных избыточным количеством меркаптоуксусной кислоты, имеющей...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002509057
Дата охранного документа: 10.03.2014
27.05.2014
№216.012.cb0c

Флуоресцентный зонд и тест-система для определения активности фосфолипазы а2

Настоящее изобретение относится к области генной инженерии, конкретно к созданию тест-систем на основе флуоресцентных зондов, которые могут быть использованы в качестве субстратов для фосфолипаз А1 и А2. Зонд с наименованием...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002517746
Дата охранного документа: 27.05.2014
10.06.2014
№216.012.ccfe

Способ определения неспецифической устойчивости патогенных микроогранизмов к антибиотикам на основании измерения каталитической активности фосфодиэстераз, расщепляющих циклический дигуанозинмонофосфат

Изобретение относится к области биотехнологии и представляет собой способ определения неспецифической устойчивости патогенных микроорганизмов к антибиотикам и факта присутствия бактериальных биопленок на основании измерения каталитической активности фосфодиэстераз, расщепляющих циклический...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002518249
Дата охранного документа: 10.06.2014
20.07.2014
№216.012.decd

Способ длительного хранения in vitro растений осины

Изобретение относится к области биотехнологии растений. Изобретение представляет собой способ хранения растений осины в условиях in vitro, включающий культивирование микропобегов осины на питательной среде WPM с добавлением сахарозы 10-20 г/л, агар-агара 9 г/л и витаминов MS 1 мл/л, сорбитола...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002522823
Дата охранного документа: 20.07.2014
27.08.2014
№216.012.efa8

Рекомбинантные плазмидные днк, кодирующие гибридные полипептиды со свойствами красного флуоресцентного белка mcherry, для продуцирования гибридных флуоресцентных белков в escherichia coli

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой рекомбинантные плазмидные ДНК, кодирующие гибридные полипептиды со свойствами красного флуоресцентного белка mCherry. Рекомбинантная плазмидная ДНК pChFN3 кодирует гибридный белок ChFN3, который имеет свойства красного флуоресцентного...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002527171
Дата охранного документа: 27.08.2014
10.09.2014
№216.012.f3d8

Способ оценки чувствительности клеток рака легкого к доксорубицину на основании уровней экспрессии маркерных генов и набор для его осуществления

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ оценки чувствительности клеток рака легкого к доксорубицину (IC50), а также набор для осуществления данного способа. Способ основан на сравнении уровней экспрессии маркерных генов АВСС1, ERCC1, FTL, GSTP1, МТ2А, RRM1, TUBB3 в...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002528247
Дата охранного документа: 10.09.2014
10.11.2014
№216.013.0489

Способ формирования многофункциональных микросистем

Изобретение относится к области химии высокомолекулярных соединений, в частности к способам получения полимерных носителей путем химической модификации исходных полимерных микросфер на основе сополимера акролеина-стирола, полученных безэмульгаторной радикальной полимеризацией. Способ включает...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002532559
Дата охранного документа: 10.11.2014
10.04.2015
№216.013.3eea

Способ выявления белков в разных типах клеток млекопитающих и человека с помощью флуоресцеин-5-изотиоцианата на микроскопическом уровне

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для анализа локализации и содержания белкового компонента в клетках млекопитающих с различным уровнем синтетических процессов. Предлагается способ выявления внутриклеточных белков с помощью флуоресцеин-5-изотиоционата (ФИТЦ) в...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002547594
Дата охранного документа: 10.04.2015
Showing 1-10 of 47 items.
10.06.2013
№216.012.4729

Биогибридный материал для сорбции и деградации нефти и нефтепродуктов

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при безотходной очистке от аварийных разливов нефти и нефтепродуктов водных и твердых поверхностей. Предложен биогибридный материал для сорбции и деградации нефти и нефтепродуктов поверхностных и донных отложений. Материал включает...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002483797
Дата охранного документа: 10.06.2013
20.11.2013
№216.012.8260

Способ выделения рекомбинантных белков

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано при получении рекомбинантных форм представляющих практический интерес белков. Предложен способ получения рекомбинантного белка через его гибридный предшественник с природным сайтом расщепления энтеропептидазой, который...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002499052
Дата охранного документа: 20.11.2013
10.12.2013
№216.012.88ba

Способ ренатурации мембранных белков

Изобретение относится к молекулярной биологии и биотехнологии. Предложен способ получения ренатурированных мембранных белков. Способ включает получение гомогенного раствора, содержащего денатурированный мембранный белок, смесь детергентов, фосфолипид или смесь фосфолипидов и аполипопротеин или...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002500684
Дата охранного документа: 10.12.2013
20.02.2014
№216.012.a240

Способ получения биомассы зеленых микроводорослей, обогащенной жирными кислотами

Изобретение относится к фотобиотехнологии и микробиологии. Инокулят миуроводоросли Desmodesmus sp.штамм 2С166Е вносят в минеральную среду BG-11 до конечной концентрации хлорофилла в смеси 4-6 мкг/мл. Культивируют при постоянном освещении и барботировании среды атмосферным воздухом в течение...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002507251
Дата охранного документа: 20.02.2014
27.03.2014
№216.012.ae11

Способ получения клеток для заместительной клеточной терапии патологий печени

Изобретение относится к области клеточной биологии и медицины. Предложен способ получения клеток для заместительной клеточной терапии печени, заключающийся в выделении из подчелюстной слюнной железы популяции стволовых клеток, экспрессирующей маркеры CD49f и EpCAM, инкубировании ее с...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002510276
Дата охранного документа: 27.03.2014
20.08.2014
№216.012.ebf5

Рекомбинантная плазмидная днк pest877, детерминирующая экспрессию полипептида с активностью эстеразы psychrobacter cryohalolentis к5 на поверхности клеток escherichia coli, и штамм бактерий escherichia coli bl21(de3)plyss/pest877-продуцент полипептида с активностью эстеразы psychrobacter cryohalolentis к5 на поверхности клеток

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии и касается рекомбинантной плазмидной ДНК pEst877, детерминирующей экспрессию полипептида с активностью эстеразы P. cryohalolentis К5Т на поверхности клеток, с мол. массой 3,64 Md (5,519 т.п.о.), состоящей из NcoI/XhoI - фрагмента ДНК...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002526213
Дата охранного документа: 20.08.2014
27.08.2014
№216.012.efa8

Рекомбинантные плазмидные днк, кодирующие гибридные полипептиды со свойствами красного флуоресцентного белка mcherry, для продуцирования гибридных флуоресцентных белков в escherichia coli

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой рекомбинантные плазмидные ДНК, кодирующие гибридные полипептиды со свойствами красного флуоресцентного белка mCherry. Рекомбинантная плазмидная ДНК pChFN3 кодирует гибридный белок ChFN3, который имеет свойства красного флуоресцентного...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002527171
Дата охранного документа: 27.08.2014
20.09.2014
№216.012.f636

Биоразлагаемый композиционный сорбент нефти и нефтепродуктов

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен биоразлагаемый композиционный сорбент нефти и нефтепродуктов. Сорбент содержит термопластичный полимер с волокнообразующими свойствами, полученный методом аэродинамического формования, и нестерильные растения рода Сфагнум (Sphagnum),...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002528863
Дата охранного документа: 20.09.2014
20.10.2014
№216.013.009b

Рекомбинантная плазмидная днк рет3.54, кодирующая полипептид fn3.54, взаимодействующий с фактором некроза опухолей человека, и штамм бактерий escherichia coli - продуцент полипептида fn3.54, взаимодействующего с фактором некроза опухолей человека

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой рекомбинантную плазмидную ДНК pET3.54, кодирующую полипептид FN3.54, взаимодействующий с фактором некроза опухолей человека. Настоящее изобретение раскрывает также рекомбинантный штамм бактерий Escherichia coli BL21(DE3)/pET3.54 -...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002531547
Дата охранного документа: 20.10.2014
10.12.2014
№216.013.0ee2

Биогибридный композиционный материал

Изобретение относится к безотходной очистке от аварийных разливов нефти и нефтепродуктов природных и искусственных водоемов, сточных вод, жидких отходов производств, твердых поверхностей, а также в качестве превентивной меры. Сорбент включает термопластичный полимер с волокнообразующими...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002535227
Дата охранного документа: 10.12.2014
+ добавить свой РИД