Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ СЕРОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ ЙЕРСИНИОЗА ЛОСОСЕВЫХ РЫБ, ВЫЗЫВАЕМОГО Yersinia ruckeri, МЕТОДОМ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА И ДИАГНОСТИЧЕСКИЙ НАБОР ДЛЯ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ СПОСОБА

Предлагаемое изобретение относится к области ветеринарной биотехнологии, микробиологии и может быть использовано для выявления антигена возбудителя йерсиниоза лососевых - Yersinia ruckeri в биологическом материале как для диагностики болезней рыб в ветеринарии, так и для научных исследований методом иммуноферментного анализа.

Рыбоводство, как основное направление современной аквакультуры России - важнейшая отрасль сельского хозяйства. Рыбы при интенсивном выращивании постоянно контактируют с огромным количеством микроорганизмов как непатогенных, так и патогенных, представляющих опасность в развитии эпизоотий. Одна из таких - Yersinia ruckeri, бактерия семейства Enterobacteriaceae, которая вызывает кишечную болезнь йерсиниоз - Enteric Red Month (ERM), известную также под названием «красный рот», хроническую системную инфекцию радужной форели, выращиваемой в пресной воде. За рубежом, в регионах, активно занимающихся форелеводством, йерсиниоз считается опасной инфекцией. Болезнь наносит существенный урон рыбоводческим хозяйствам, приводит к высокому уровню гибели рыбы и к порче ее товарного вида.

В первую очередь заболеванию подвержены разные виды лососевых и сиговых рыб, также известны случаи выявления возбудителя у других пресноводных гидробионтов, что служит вектором передачи бактерий в окружающей среде культивируемой рыбе. Y. ruckeri передается горизонтально, через воду и экскременты зараженной рыбы. У заболевших особей отмечают геморрагии различных тканей и органов, особенно около рта, в мускулатуре, жабрах, брюшной стенке, полостном жире, а также в переднем и заднем отделах кишечника. Наиболее остро болезнь проявляется у мальков, у более крупных рыб протекает хронически.

На территории Российской Федерации йерсиниоз выявлен в 2010 году, количество случаев с каждым годом увеличивается, однако в список карантинных это заболевание не включено, что в виду массовой, но часто бесконтрольной перевозки рыбопосадочного материала способствует его распространению. Следовательно, с развитием контактов между странами, ростом и увеличением интенсивности аквакультуры внутри регионов данное заболевание имеет тенденцию повсеместного распространения в мире, поэтому возникает необходимость своевременной диагностики, а также точной идентификации возбудителя.

Сейчас диагностика йерсиниоза в лаборатории основана на выявлении бактерий в посевах на питательных средах с последующим изучением их культурально-биохимических свойств. Этот метод долгий, а результат анализа часто зависит от таких факторов, как опыт и компетенция специалиста, проводящего работу, качества используемой питательной среды и т.п., поэтому использование современных методов будет, несомненно, востребовано при диагностике [1].

В связи с вышеизложенным проблема диагностики и борьбы с йерсиниозом очень актуальна. Эффективно решить проблему своевременной и точной диагностики заболевания позволит высокочувствительный и строгоспецифичный метод иммуноферментного анализа, широко распространенный для выявления болезней человека и животных, но недостаточно используемый в ихтиопатологии.

Единственным известным набором для проведения серологической диагностики болезней рыб является ТФ ИФА для выявления противогерпетических антител в сыворотке осетровых рыб, разработанный во ВНИИВВиМ в 2012 году, который предлагается использовать в научно-исследовательских и ветеринарных лабораториях для ретроспективной диагностики герпесвирусной болезни сибирского осетра (SbSHV) у различных видов осетровых. Однако ретроспективная диагностика актуальна только для вирусных болезней, т.к. позволяет проводить мониторинговые исследования при подозрении на герпесвирусную инфекцию осетровых рыб в межэпизоотический период, и не пригодна для диагностики бактериальных болезней за счет длительного времени образования антител в живом организме [2] (прототип).

При диагностике бактериальных инфекций важна оперативная информация, на ранних этапах развития заболевания и для быстрого подтверждения диагноза во время эпизоотии, поэтому необходимо анализировать наличие в организме рыб антигена.

Высокая контагиозность и смертность рыб при йерсиниозе обуславливают необходимость разработки экспресс-методов диагностики с целью быстрого и своевременного принятия карантинных мер и профилактических мероприятий. Одним из таких методов является иммуноферментный анализ (ИФА), главными достоинствами которого являются высокая чувствительность и специфичность, коррелирующие с результатами, полученными при использовании других серологических методов, а также широкое распространение специального оборудования, позволяющего почти полностью автоматизировать процесс выявления антигенов.

Задача настоящего изобретения - разработка чувствительного и эффективного способа серодиагностики йерсиниоза рыб, вызываемого Yersinia ruckeri, на ранних этапах развития болезни и создание на его основе диагностического набора. Сведения по использованию ИФА-теста и существованию аналогичных диагностических наборов для выявления йерсиниоза рыб в современной литературе отсутствуют.

Сущность изобретения состоит в использовании диагностического набора, включающего все необходимые компоненты для проведения иммуноферментного анализа, позволяющего выявлять антиген Yersinia ruckeri в образцах биологического материала от рыб на ранней стадии развития болезни с высокой специфичностью и чувствительностью. Принцип способа заключается в следующем: специфические иммуноглобулины, иммобилизованные на поверхности лунок полистиролового микропланшета, связываются с гомологичными антигенами, присутствующими в исследуемом материале, образуя комплекс антиген-антитело. Полученный иммунный комплекс выявляется путем взаимодействия с иммуноферментным конъюгатом, фермент которого, после добавления субстрата, вызывает разложение субстрат-индикаторного раствора и образование окрашенного продукта. Интенсивность окраски в лунке микропланшета пропорциональна содержанию специфического антигена в испытуемом образце, результаты учитывают по общепринятой формуле.

Диагностический набор для выявления возбудителя йерсиниоза содержит: планшет полистироловый 96-луночный, сенсибилизированный иммуноглобулинами к ERM; положительный контрольный образец, инактивированный (K⁺); отрицательный контрольный образец, инактивированный (K^-); конъюгат, представляющий собой анти-ERM антитела, меченные пероксидазой хрена; раствор для разведения конъюгата (РК); промыватель - концентрат фосфатно-солевого буферного раствора с твином-80 (ФСБ-Т×25); субстрат - раствор тетраметилбензидина (ТМБ); стоп-реагент; ванночка для реагентов. Компоненты набора расфасованы в пластиковые флаконы разного объема с завинчивающимися крышками и упакованы в коробки.

ПРИМЕР 1

1. Подготовка исследуемого материала

Для обнаружения антигена Yersinia ruckeri в качестве испытуемого используют биопсийный материал внутренних органов (почка, печень, селезенка), экссудат и бактериальные культуры в концентрации не более 10^5.0-10^6.0 м.т. Для получения 10%-ной суспензии биоматериал гомогенизируют до получения однородной массы на ФСБ (pH 7,2-7,4). Полученную суспензию сливают в стерильную посуду и используют для исследования.

2. Подготовка компонентов для постановки реакции

Для промывания планшетов, при постановке реакции, готовят содержащий твин-80 фосфатно-солевой буфер: размешивают содержимое флакона с ФСБ-Т*25, при выпадении в концентрате осадка прогревают его до полного растворения солей, и разводят дистиллированной водой до 700 мл. Хранят при 4°C до 5 суток.

Раствор конъюгата в рабочем разведении готовят непосредственно перед использованием, к 0,05 мл концентрированного раствора добавляют 15 мл раствора для разведения конъюгата (РК), тщательно перемешивают.

Раствор ТМБ готов к применению, непосредственно перед использованием отбирают в пластиковую ванночку 12 мл. Остатки раствора ТМБ из ванночки нельзя сливать во флакон с исходным раствором ТМБ. Хранят при 4°C в течение всего срока годности набора.

3. Постановка реакции

Перед началом анализа лунки планшета промывают один раз промывочным раствором. В каждую лунку вносят по 300 мкл раствора, через пять минут после заполнения лунок раствор аккуратно удаляют. Остатки влаги из лунок тщательно удаляют, постукивая перевернутым планшетом по фильтровальной бумаге.

В первую лунку первого ряда планшета вносят 100 мкл специфического положительного антигена (K⁺). Во вторую лунку первого ряда вносят 100 мкл отрицательного антигена. Во все остальные лунки по 100 мкл исследуемых образцов (желательно делать 2-3 повторности). Внесение материала в плашку сопровождают тщательным перемешиванием пипетированием в течение 5-7 секунд. Планшет инкубируют при комнатной температуре (21-25°C) 60 минут.

Раствор конъюгата в рабочем разведении готовят за пять-десять минут до окончания инкубации.

По окончании инкубации планшет отмывают четыре раза ФСБ-Т от несвязавшихся антигенов, после чего удаляют влагу, постукивая перевернутым планшетом по фильтровальной бумаге.

Во все лунки планшета вносят по 100 мкл раствора конъюгата в рабочем разведении. Планшет инкубируют при комнатной температуре (21-25°C) 60 минут. По окончании инкубации планшет отмывают четыре раза ФСБ-Т, после чего удаляют влагу постукиванием.

Во все лунки вносят по 100 мкл раствора ТМБ. Для внесения раствора ТМБ используют пластиковую ванночку, входящую в состав набора. Планшет инкубируют при комнатной температуре, в защищенном от света месте, 25-30 минут.

Реакцию заканчивают добавлением во все лунки 100 мкл стоп-реагента.

4. Учет результатов

Результаты реакции учитывают через 2-3 минуты после добавления стоп-реагента, проводя измерение оптической плотности (ОП) в каждой лунке на спектрофотометре с вертикальным лучом света при длине волны 450 нм или визуально. Результаты исследований учитывают только при соблюдении следующих условий:

- значение ОП в лунке с отрицательным контролем не более 0,30 о.е.

- значение ОП в лунке с положительным контролем не менее 0,62 о.е.

Реакцию оценивают по формуле и выражают в виде процента реактивности:

процент реактивности (%)=(ОП-ОПК^-)/(ОПК⁺-ОПК^-)Х100%,

где ОП - оптическая плотность образца, ОПК⁺ - оптическая плотность положительного контроля, ОПК^- - оптическая плотность отрицательного контроля.

Границы пороговых значений: при величине %>22% реакция считается положительной, значение %<10% - реакция отрицательная, а диапазон % от 10% до 22% - сомнительные результаты реакции.

ПРИМЕР 2

Подготовку исследуемого материала, подготовку компонентов для постановки реакции, постановку реакции осуществляют аналогично описанному в примере 1, но инкубацию планшета после внесения положительных, отрицательных и исследуемых образцов проводят в течение 4-6 часов при температуре 4°C (в холодильнике), после чего работу и учет результатов продолжают по стандартной схеме. Получают результаты, аналогичные таковым в примере 1.

Предложенный способ и набор не имеют отечественных и зарубежных аналогов. Позволяет в течение трех часов с достоверностью 98% определять в образцах биологического материала наличие Y. ruckeri, возбудителя йерсиниоза лососевых рыб. Использование «холодной инкубации» (в течение 4-6 часов при температуре 4°C, в холодильнике) позволяет получать достоверные, аналогичные результаты в течение одного дня, с перерывом для оператора в ходе работы, что по разным причинам также может быть удобно.

Диагностикум разработан и апробирован с положительным результатом в лаборатории ихтиопатологии ФГБНУ ВИЭВ имени Я.Р. Коваленко в период октябрь 2013 - декабрь 2014 года.

Предложенный способ найдет применение в системе мониторинга, проводимого органами ветеринарной службы страны, что позволит контролировать заболеваемость йерсиниозом и сохранять здоровье культивируемых рыб, а также в научных исследованиях для получения информации о закономерностях циркуляции йерсиний вида Yersinia ruckeri в аквакультуре. Высокая чувствительность, специфичность, простота постановки реакции и возможность автоматизации процессов, за счет использования приборов, таких как промыватель, планшет и спектрофотометр с вертикальным лучом (ИФА-ридер), позволят в короткие сроки проводить массовые обследования в рыбоводческих хозяйствах с целью определения распространения заболевания. Оперативность анализа при данной инфекции имеет принципиальное значение, так как ускоренная диагностика позволяет максимально быстро приступить к лечению, тем самым оздоравливая и сохраняя поголовье.

Источники информации

1. Временные методические указания по диагностике йерсиниоза лососевых рыб // Сборник инструкций по борьбе с болезнями рыб (часть 2). Москва, отдел маркетинга АМБ-агро, 1999, с. 66-68.

2. Further virus characterization, diagnostics and prevention of Siberian sturgeon herpesvirus disease / Igor Shchelkunov, Andor Doszpoly, Tatiana Shchelkunova, Inna Prokaeva, Fatima Kalabekova, Ismail Kalabekov, Dmitry Kurenkov // USA-Russia Bilateral Workshop On Aquaculture and FishHealth USGS Western Fisheries Research Center, Seattle, WA, USA October, 2012, pp. 1-5 (прототип).