Способ приготовления питательной среды для выращивания пробиотических культур

Предлагаемое изобретение относится к ветеринарной микробиологии, в частности к способам получения ростовой среды для молочнокислых бактерий, и может быть использовано в производстве лечебно-профилактических и лечебных препаратов.

В настоящее время в России идет активная разработка и внедрение безопасных, эффективных пробиотических препаратов при выращивании сельскохозяйственных животных и получении продукции животноводства. Пробиотики назначают для восстановления облигатной микрофлоры после длительного лечения антибиотиками и сульфаниламидными препаратами, терапии при гастритах, энтеритах, колитах. Пробиотики, нормализуя микрофлору кишечника животных, подавляют развитие кишечной палочки и гнилостных бактерий. Продукты жизнедеятельности молочнокислых бактерий благотворно влияют на секреторную деятельность желудочно-кишечного тракта, возбуждают аппетит, повышают усвояемость корма. Важное значение имеет также среда, на которой культивируют бактерии.

На данном этапе питательная среда должна быть достаточно бюджетной для производства, иметь низкую стоимость, включать все основные компоненты, соответствующие потребностям бактерий. Культивирование в такой среде должно способствовать, как минимум, сохранению пробиотических свойств микроорганизмов, обеспечивать достаточно длительное хранение при поддержании определенной массы жизнеспособных микроорганизмов, не требовать особенных условий хранения.

Известен способ получения питательной среды на основе печеночного настоя. Для ее приготовления к 1000 мл дистиллированной воды добавляют пептон, хлористый натрий, глюкозу, дрожжевой экстракт и печеночный настой. Смесь нагревают до кипения. После охлаждения фильтруют через ватно-марлевый фильтр и устанавливают рН-6,8. Среду стерилизуют автоклавированием при 1 атм. 30 минут. Среда имеет соломенный цвет с серо-белым осадком, легко разбивающимся при встряхивании. Количество жизнеспособных микробных клеток не менее 1⋅10⁷(КОЕ), млн/см³.

Известен способ приготовления гидролизатной среды на основе гидролизата белкового компонента, включающий ферментативный гидролиз, смешивание с уксусной кислотой, кипячение, фильтрацию, разведение, введение в гидролизат стабилизирующих добавок, стерилизацию полученной гидролизатной среды, введение суточной культуры микроорганизмов, их культивирование. При этом ферментативный гидролиз проводят в два этапа, один в кислой среде с использованием пепсина, другой - в щелочной среде с использованием панкреатина с концентрацией 5-10 г/л. Выход гидролизата, из которого готовят гидролизатную среду, составляет не менее 82 об. %, а содержание аминокислот 2,2-2,5 г/л. В качестве стабилизирующих добавок, количество которых составляет не менее 0,59 об.%, используют агар-агар в количестве 0,8-2,0 г/л, NaCl - 2,0-5,0 г/л, лактулозу или лактозу - 0,15-15,0 г/л, пептон - 2,5-15,0 г/л, цистин или цистеин солянокислый - 0,15-0,5 г/л, аскорбиновую кислоту - 0,3-0,5 г/л. В качестве белкового компонента для приготовления гидролизатной среды может быть использована смесь компонентов животного и растительного происхождения (1).

За прототип мы взяли наиболее близкий к заявляемому техническому решению по совокупности существенных признаков и достигаемому результату способ, предусматривающий приготовление питательной среды на основе ферментативного гидролизата белкового компонента с использованием соевоевого молока, а в качестве фермента для гидролиза - пепсин(2).

Соевое молоко готовят путем разведения сухого соевого порошка в воде согласно рецептуре, обычная концентрация составляет 7,5% (75 грамм на 1 литр воды) с последующим отстаиванием, процеживанием и кипячением. После охлаждения до 38-40°C доводят pH молока до 1,3-4,5, после вышеуказанной коррекции pH в соевое молоко вносят пепсин, проводят термостатирование молока при 37 град. С в течение 4 часов, при этом в процессе гидролиза происходит сдвиг pH в щелочную сторону на 0,2. При проведении гидролиза при pH ниже 4,5 после его окончания pH корректируют раствором NaOH (20%) до 4,5. Получаемый гидролизат представляет собой однородную мутную жидкость с небольшим количеством осаждающихся на дне белесоватых хлопьев и со специфическим запахом и вкусом соевого молока. Отстоявшийся гидролизат сливают с осадка, разводят дистиллированной водой 1:1, добавляют агар-агар, расплавляют, вносят хлористый натрий, пептон, нагревают до 80 град. С. Далее устанавливают pH питательной среды 7,5-7,6, кипятят в течение 15 мин, отстаивают, сливают с осадка, доводят горячей дистиллированной водой до исходного объема, добавляют лактозу, аскорбиновую кислоту в количестве 0,5 г/л. В среду вносят 5% маточной культуры бифидобактерий, и/или лактобактерий, и/или молочнокислых стрептококков и проводят культивирование бактерий путем термостатирования в течение 18 час. Исследования проб полученной маточной бактериальной культуры показали полное отсутствие посторонней микрофлоры как сразу после окончания культивирования, так и спустя 30 суток, при этом титр на гидролизатно-соевоей среде составил до 10×10⁷ микробных клеток в 1 мл среды и не менялся в течение всего периода хранения закваски (30 суток). Не менялась также и морфология клеток.

Недостатком данного способа является сложность приготовления, длительность приготовления, ограниченный срок хранения.

В задачу наших исследований входило открытие нового способа создания питательной среды для выращивания пробиотических культур, обеспечивающей длительное сохранение микробной массы в жизнеспособном состоянии, дешевой в производстве.

Наша задача решается тем, что количество сухого соевого порошка вносимого сокращается до 24,0-28,0 грамм против обычной концентрации 75 грамм на 1 литр воды. Термостатирование под воздействием фермента пепсина длится в течении 48 часов, обеспечивая более полный гидролиз белков.

Через 48 часов гидролизат фильтруют через ватно-марлевый фильтр и автоклавируют при 1 атмосфере в течение часа. Готовый гидролизат используют для приготовления ростовой среды. Для ее приготовления к фильтрованной воде добавляют пептон, глюкозу и соевый гидролизат. Смесь нагревают до кипения. После охлаждения фильтруют через бумажный фильтр и устанавливают pH-метром 6,8-7,0. Среду стерилизуют автоклавированием при 1 атм. 30 минут. Культуры пробиотических микроорганизмов высевают в ростовую среду из расчета соотношения культуры и ростовой среды 1:20. Культивируют 24 часа. КОЕ/г после культивирования составляет не менее 1×10⁹ед. Данный способ обеспечивает более полный гидролиз белков, срок хранения среды увеличивается до 6 месяцев в закрытом флаконе.

Изобретение иллюстрируют следующие примеры.

Пример 1: приготовление питательной среды в оптимальных параметрах.

Сухое соевое молоко 24 г разводят в 1 литре фильтрованной воды. Воду подогревают до 45-50°C и постоянно помешивают, до получения однородной жидкости. После охлаждения смеси до 37°C в нее вносят пепсин и помещают в термостат. Через 48 часов полученный гидролизат фильтруют через ватно-марлевый фильтр и автоклавируют при 1 атмосфере в течение часа. Далее готовят гидролизно-соевую среду. Для этого к 1000 мл фильтрованной воды добавляют 1 г пептона, 10 г глюкозы и 120,0 мл соевого гидролизата. Смесь нагревают до кипячения. После охлаждения фильтруют через бумажный фильтр и устанавливают pH 6,8-7,0. Среду стерилизуют при 1 атм. 30 мин. Среда готова для использования.

Пример 2: приготовление питательной среды в оптимальных параметрах.

Сухое соевое молоко 28 г разводят в 1 литре фильтрованной воды. Воду подогревают до 45-50°C и постоянно помешивают, до получения однородной жидкости. Охлаждают смесь до 37°C, вносят пепсин и термостатируют. Через 48 часов полученный гидролизат фильтруют и автоклавируют при 1 атмосфере в течение часа. Готовят гидролизно-соевую среду. Для этого к 1000 мл фильтрованной воды добавляют 1 г пептона, 10 г глюкозы и 120,0 мл соевого гидролизата. Смесь доводят до кипения. После охлаждения фильтруют через бумажный фильтр и устанавливают pH 6,8-7,0. Среду стерилизуют при 1 атм. 30 мин. Среда готова для использования.

Пример 3: приготовление питательной среды с экспозицией гидролиза сои менее 48 часов.

Сухое соевое молоко 25 г разводят в 1 литре фильтрованной воды. Воду подогревают до 45-50°C и постоянно помешивают, до получения однородной жидкости. После охлаждения смеси до 37 в нее вносят пепсин и помещают в термостат. Через 40 часов полученный гидролизат фильтруют через ватно-марлевый фильтр и автоклавируют при 1 атмосфере в течение часа. Далее готовят гидролизно-соевую среду. Для этого к 1000 мл фильтрованной воды добавляют 1 г пептона, 10 г глюкозы и 120,0 мл соевого гидролизата. Смесь нагревают до кипячения. После охлаждения фильтруют через бумажный фильтр и устанавливают pH 6,8-7,0. Среду стерилизуют при 1 атм. 30 мин. В среду, готовую для использования, засевают посевной материал, состоящий из производственных штаммов: Bifidobacterium thermophilum тп-87, Lactobacillus acidofilus, Lactobacillus plantarum, Lactococcus lactissubsp.diacetilactis, Bacillus subtillus из расчета 1:20 (посевной материал \ гидролизно-соевая среда). Получена конечная концентрация: 0,4×10⁹ м.клеток в мл, меньшая, чем с оптимальными параметрами.

Пример 4: приготовление питательной среды со снижением pH до 6,7.

Сухое соевое молоко 25 г разводят в 1 литре фильтрованной воды. Воду подогревают до 45-50°C и постоянно помешивают, до получения однородной жидкости. После охлаждения смеси до 37°C в нее вносят пепсин и помещают в термостат. Через 48 часов полученный гидролизат фильтруют через ватно-марлевый фильтр и автоклавируют при 1 атмосфере в течение часа. Далее готовят гидролизно-соевую среду. Для этого к 1000 мл фильтрованной воды добавляют 1 г пептона, 10 г глюкозы и 120,0 мл соевого гидролизата. Смесь нагревают до кипячения. После охлаждения фильтруют через бумажный фильтр и устанавливают pH 6,7. Среду стерилизуют при 1 атм. 30 мин. В среду, готовую для использования засевают посевной материал, состоящий из производственных штаммов: Bifidobacterium thermophilum тп-87, Lactobacillus acidofilus, Lactobacillus plantarum, Lactococcus lactissubsp.diacetilactis, Bacillus subtillus из расчета 1:20 (посевной материал \ гидролизно-соевая среда). В серии посевов получены конечные концентрации: от 1×10⁶ до 1,4×10⁷ м.клеток в мл, меньшие, чем при использовании оптимальных параметров.

Для проверки количества жизнеспособных микробных клеток после 7 месяцев хранения культуры были высеяны на элективные питательные среды методом серийных разведений. Рост отмечен до 9 разведений:

Bifidobacterium thermophilum тп-87 - 7×10⁹ КОЕ/г

Lactobacillus acidofilus - 1×10⁹ КОЕ/г

Lactobacillus plantarum - 4×10⁹ КОЕ/г

Lactococcus lactis subsp.diacetilactis - 2×10⁹ КОЕ/г

Bacillussubtillus - 1×10⁸ КОЕ/г

Через 12 месяцев хранения образцы были повторно высеяны на элективные питательные среды, методом серийных разведений, количество их снизилось:

Bifidobacterium thermophilum тп-87 - 4×10⁷ КОЕ/г

Lactobacillus acidofilus - 1×10⁵ КОЕ/г

Lactobacillus plantarum - 1×10⁹ КОЕ/г

Lactococcuslactissubsp.diacetilactis - 1×10⁷ КОЕ/г

Bacillussubtillus - 1×10⁵ КОЕ/г

При определении pH установлено значительное его снижение и превышение допустимой нормы - до 4,2. В результате проведенных исследований было принято решение установить срок годности среды 6 месяцев со дня изготовления.

Список литературы

1. Патент РФ №2207019. «Биологически активная добавка к пище и способ ее приготовления», МПК A23L 1/30, A23J 3/04, A23J 3/14, A23J 3/34, C12N 1/20, A23C 9/12, опубл. 27.06.2003 г.

2. Патент РФ №2087532 «Питательная среда для накопления биомассы бифидобактерий», МПК C12N 1/20, A61K 35/74, A23C 9/12 опубл. 20.08.97 г.