СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БЕЛКОВОЙ ДОБАВКИ ДЛЯ ОБОГАЩЕНИЯ СЕЛЕНОМ ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ

Изобретение относится к пищевой промышленности, а именно к биотехнологии получения белковых добавок - носителей селена для производства пищевых продуктов.

Известны способы получения белковых селенсодержащих добавок, предусматривающие культивирование биомассы спирулины на питательной среде, содержащей неорганический источник селена.

Известен способ получения селенсодержащей биомассы спирулины, при котором в культуральную жидкость в качестве источника селена вводят селенит натрия двумя порциями - в логарифмической и в стационарной фазах роста (описание к патенту RU №2146287 МПК C12N 1/12, A61K 35/80, A61K 33/04, C12N 1/12, C12R 1:89, 10.03.2000, опубл. 10.03.2000).

Недостатками способа являются значительная (7 суток) продолжительность процесса культивирования спирулины, неравномерное распределение селена по массе добавки в результате смешивания полученного концентрата с содержанием биодоступного селена 6,15-6,5 г/кг с сухой биомассой спирулины для доведения содержания селена до разрешенных фармакопейных норм.

Известен способ получения селенсодержащего препарата биомассы спирулины, который получают путем культивирования спирулины на щелочной водно-солевой среде Заруха, который готовят по частям, при этом в первую часть питательной среды дополнительно вносят селенистую кислоту (H₂SeO₃) в качестве источника селена (описание к патенту RU 2209077 C2, A61K 35/80, A61K 30/04, опубл. 27.07.2003).

Общим недостатком данных известных способов является специфическая окраска препаратов за счет содержания сине-зеленых пигментов, участвующих в процессах фотосинтеза с образованием сложных органических веществ из углекислого газа и воды, что ограничивает его применение при производстве продуктов питания.

Известен способ получения селенсодержащей биологически активной добавки на основе молочного сырья и селена, предусматривающий приготовление питательной среды, в качестве которой используют осветленную творожную сыворотку, внесение селенита натрия в количестве 15-20 мкг/мл и инокулята, в качестве которого используют активизированные культуры бифидобактерий или пропионовокислых бактерий (описание к патенту RU №2333655 C2, A23C 9/12, A23L 1/304, C12N 1/18, опубл. 20.09.2008).

Недостатком данного способа является нестабильность селенсодержащей добавки при хранении и необходимость стерильного хранения в асептических условиях, возможность остаточного содержания селена в добавке в неорганической форме.

Известно иммунокоррегирующее протеоселеновое средство в виде комплекса из низкомолекулярного компонента, ионизированной органической соли селена и органических структур (углеводов, фосфолипидов, фосфолипоуглеводов, каротиноуглеводов и цианоуглеводов), при этом низкомолекулярный компонент получают из протеинсодержащего сырья путем экстракции органическими растворителями с последующим высушиванием субстанции и растворением в 60-90%-ном спирте, а для получения комплекса смесь из низкомолекулярного компонента, ионизированной органической соли селена и органических структур выдерживают в электромагнитном синусоидальном высокочастотном поле 20-30 МГц в течение 5 мин (описание к патенту RU 2161034 С1 МПК A61K 33/04, A61P 37/00).

Недостатками способа являются сложность аппаратурного оформления и высокая стоимость продукта, что ограничивает область его применения медициной и фармакологией.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому эффекту является способ получения селенсодержащей добавки для домашних животных, предусматривающий выделение белка эластина, модификацию гидролизата эластина селеном с последующей сорбцией полученного комплекса на цеолите (описание к патенту RU, см. RU 2321269 C1 A23K 1/16, опубл. 14.04.2008).

Недостатками данного технического решения являются ограничение применения добавки областью кормопроизводства, многостадийность процесса, ограниченность источников эластина выйной связкой крупного рогатого скота, высокая токсичность используемого в качестве источника селена селенита натрия.

Задача изобретения - расширение сырьевых источников белковых добавок, расширение ассортимента белковых добавок, обогащенных селеном, снижение токсичности источника селена при получении добавки и ее использовании.

Технический результат - повышение выхода, расширение функциональных свойств добавки путем повышения влагосвязывающей, водоудерживающей способностей белковой добавки.

Технический результат достигается тем, что в способе получения белковой добавки для обогащения селеном пищевых продуктов, предусматривающем выделение белка из соединительных тканей, получение гидролизата белка, модификацию его препаратом селена, в качестве соединительной ткани используют жилки, сухожилия, фасции, из которых в качестве белка выделяют коллаген путем пероксидно-щелочного гидролиза соединительных тканей, гидролизат коллагена получают выдержкой в течение 2,5-3,0 ч при 36-38°C с препаратом коллагеназа пищевая в количестве 0,02% к массе коллагена, а модификацию коллагена селеном осуществляют путем выдержки с 4,4-ди[3(5-метилпиразолил)] (ДМДПС) при pH 8,0-8,5 в течение 2-4 ч при 18-24°C.

Использование жилок и сухожилий позволит увеличить массовый выход источника белка (9,7-12,4%) для получения добавки при жиловке говядины по сравнению с выйной связкой крупного рогатого скота (КРС) (0,8%). Организация коллагеновых структур в составе сухожилий, связок, фасций характерна как параллельным расположением волокон и пучков, так и их переплетением под различным углом с развитым межклеточным матриксом. При этом массовая доля водо-, соле- и щелочерастворимой белковых фракций в отходах жиловки говядины составляет соответственно 5,6; 7,4; 20%, в том числе 19,9% коллагена. Специфическая пространственная организация молекул коллагена с образованием трехжильной левозакрученной альфа-спирали обусловлена специфическим аминокислотным составом этого белка с большим количеством реакционноспособных групп. Однако наличие внутри- и межмолекулярных поперечных связей ограничивают сорбционную емкость коллагена в структуре соединительных тканей.

Для повышения сорбционной емкости коллагена его выделяют из соединительных тканей, для чего проводят их пероксидно-щелочной гидролиз, а затем получают гидролизат коллагена выдержкой его с ферментным препаратом «коллагеназа пищевая» при условиях, оптимальных для действия этого препарата (температура 36-38°C, естественный pH среды для соединительных тканей КРС.

Для пероксидно-щелочного гидролиза соединительных тканей применяют пероксидно-щелочную композицию, состоящую из раствора гидроксида натрия с массовой долей 10% и раствора пероксида водорода 3% в соотношении 10:1. Механизм действия гидроксида натрия заключается в нарушении и ослаблении некоторых водородных мостиков, частичном разрыве белково-углеводных мембран, окружающих пучки коллагеновых фибрилл. При обработке соединительных тканей в растворе, содержащем гидроксид натрия и пероксид водорода, в результате взаимодействия этих двух компонентов происходит экзотермическая реакция, которая интенсифицирует процесс разрыва водородных связей, что приводит к разрыхлению структуры ткани и деструкции балластных веществ (водо- и солерастворимые белковые и липидные фракции).

Для получения гидролизата коллагена используют ферментный препарат протеолитического действия - «коллагеназа пищевая» (ТУ 2639-001-4554109-98, производитель ЗАО «Биопрогресс», г. Щелково Московской области).

Источником ферментного препарата «коллагеназа пищевая» является гепатопанкреас камчатского краба - орган, совмещающий функции печени и поджелудочной железы в их пищеварительном тракте, и представляет собой комплекс коллагенолитических протеиназ, молекулярная масса которых находится в пределах 23-36 кД. Преобладающими компонентами в питании крабов являются кожа рыб и соединительная ткань моллюсков, червей, содержащие значительные количества коллагена. Это свидетельствует о том, что пищеварительные ферменты крабов адаптированы к деградации нативного коллагена - белка, устойчивого к действию протеиназ других источников. Электрофоретическое изучение продуктов гидролиза коллагена показало, что исчезают тримеры и димеры α-цепей. При этом происходит значительное возрастание количества свободных α-цепей, а также β- и γ-компонентов и повышается количество реакционноспособных групп [Руденко Г.Н. // Биоорганическая химия. - 2003. - том 29. - С.117-128].

Экспериментально установлено, что целесообразная продолжительность ферментативной обработки составляет 2,5-3,0 ч (вместо 20 ч по сравнению с прототипом). При продолжительности обработки менее 2,5 ч происходит недостаточный гидролиз коллагена, в связи с чем не обеспечивается достаточная сорбционная емкость и высокий уровень функциональных свойств (влагосвязывающая, водоудерживающая, гелеобразующая, жироудерживающая способности). Увеличение продолжительности обработки свыше 3 ч приводит к возрастанию потерь коллагеновой фракции и ухудшению микробиологических показателей продукта. Максимальная коллагенолитическая активность коллагеназы проявляется при pH 6,5-8,5. Отклонения от данного диапазона приведут к увеличению времени выдержки препарата с гидролизатом коллагена.

При температуре ниже 36°C активность ферментного препарата уменьшается, что приводит к увеличению продолжительности процесса. Нагрев реакционной смеси до температуры выше 38°C приводит к ухудшению функциональных свойств добавки и нерациональному использованию энергоносителей.

При дозировке препарата «коллагеназа пищевая» менее 0,02% не достигается деструкция нативного коллагена, сопровождающаяся возрастанием количества свободных α-цепей, которые обеспечивают высокую сорбционную емкость.

Дозировка препарата «коллагеназа пищевая» свыше 0,02% не приводит к дальнейшему возрастанию сорбционной емкости гидролизата коллагена и является экономически не целесообразной.

В качестве источника селена использовали раствор ДМДПС с содержанием в 1 мл 1000 мкг селена. Это препарат антиоксидантного действия, содержащий органическую форму селена [Саноцкий И.В. // Незаменимый селен. Предупреждение и лечение заболеваний. - М., 2001. - С.18-21].

ДМДПС - препарат 4 класса токсичности (малоопасные), менее токсичен, чем селенит натрия, относящийся к 1 классу токсичности (чрезвычайно опасные) по ГОСТ 12.1.007-76. Препарат относится к соединениям, где валентность селена равна 2. Препарат, кроме антиоксидантных свойств, через пиразолиловое кольцо (в своей структуре) обладает выраженным действием на ферментные системы человека и животных, отвечающие за формирование иммунитета.

На фиг.1 изображена диаграмма влияния продолжительности выдержки гидролизата коллагена с ДМДПС на концентрацию связанного селена; на фиг.2 - влияние pH гидролизата коллагена на концентрацию связанного селена при выдержке ДМДПС с гидролизатом коллагена в течение 3 ч. Из экспериментальных данных по сорбции ДМДПС на гидролизате коллагена следует, что модификацию коллагена с селеном целесообразно осуществлять путем выдержки гидролизата коллагена с 4,4-ди[3(5-метилпиразолил)] (ДМДПС) из расчета 1,2 мкг селена на 1 г белка при pH 8,0-8,5 в течение 2-4 ч.

Способ получения белковой добавки для обогащения селеном пищевых продуктов осуществляется следующим образом.

Исходное сырье - жилки, сухожилия, фасции, выделяемые на стадии жиловки говядины в колбасном или консервном производстве, промывают проточной водой, помещают в пероксидно-щелочной раствор, содержащий гидроксид натрия концентрацией 10% и пероксид водорода - 3%. Продолжительность обработки составляет 6-10 ч при гидромодуле 1:2-2,5, что обеспечивает равномерное взаимодействие пероксидно-щелочного раствора с исходным сырьем. Далее жидкую фракцию отделяют декантацией или центрифугированием, а твердый остаток колллагена промывают водой и нейтрализуют до pH 8,0-8,5, что входит в границы области pH, благоприятной для проявления коллагенолитической активности препарата «коллагеназа пищевая».

Для получения гидролизата коллагена твердый остаток нагревают до 36-38°C, вносят раствор препарата «коллагеназа пищевая» в количестве 0,02% к массе коллагена, гидромодуль 1:2-2,5, и выдерживают при периодическом перемешивании в течение 2,5-3,0 ч. После этого жидкую фракцию гидролизата отделяют декантацией или центрифугированием, промывкой водой удаляют остатки ферментного препарата и проводят модификацию коллагена селеном, для чего выдерживают полученную массу с 4,4-ди[3(5-метилпиразолил)] (ДМДПС) из расчета 1,2 мкг селена на 1 г коллагена при pH 8,0-8,5 в течение 2-4 ч. Полученную массу нейтрализуют до pH 7,0, используя пищевую органическую кислоту, например уксусную или аскорбиновую. В случае использования для нейтрализации аскорбиновой кислоты получаемый продукт дополнительно обогащен аскорбинатом натрия.

Пример 1.

10 кг говяжьих жилок, сухожилий, фасций промывают проточной водой в течение 10 мин. Затем проводят пероксидно-щелочную обработку, для чего готовят 20 литров раствора гидроксида натрия с массовой долей 10% и 2 литра 3% раствора пероксида водорода, растворы смешивают, вносят в емкость с измельченными жилками, сухожилиями, фасциями и выдерживают в течение 6 часов, при этом массу перемешивают каждый час в течение 5 мин. Жидкую фракцию отделяют центрифугированием при 45 с^-1 в течение 5 мин, к твердому остатку приливают 15 л воды, перемешивают и повторно центрифугируют для отделения жидкой фракции. Твердый остаток коллагена нейтрализуют уксусной кислотой до pH=8,0, приливают 20 л воды и нагревают до 37°C. Препарат «коллагеназа пищевая» массой 2 г растворяют в 200 см³ воды с температурой 37°C. Полученный раствор вносят в емкость с коллагеном и выдерживают при 37°C в течение 3 ч, перемешивая каждый час в течение 5 мин. Жидкую фракцию отделяют центрифугированием при 45 с^-1 в течение 5 мин, к твердому остатку приливают 12 л воды, перемешивают и повторно центрифугируют для отделения жидкой фракции. Далее в емкость вносят 33 см³ раствора ДМДПС с концентрацией 1000 мкг/см³, что соответствует концентрации селена 1,1 мкг на 1 г коллагена, выдерживают 3 ч при 18°C и проводят нейтрализацию 5% раствором аскорбиновой кислоты до pH=7.

Пример 2.

Говяжьи жилки, сухожилия, фасции массой 20 кг промывают проточной водой в течение 15 мин. Затем проводят пероксидно-щелочную обработку, для чего готовят 40 литров раствора гидроксида натрия с массовой долей 10% и 4 литра 3% раствора пероксида водорода, растворы смешивают, вносят в емкость с измельченными жилками, сухожилиями, фасциями и выдерживают в течение 10 часов, при этом массу перемешивают каждый час в течение 5 мин. Жидкую фракцию отделяют центрифугированием при 60 с^-1 в течение 5 мин, к твердому остатку приливают 30 л воды, перемешивают и повторно центрифугируют для отделения жидкой фракции. Твердый остаток коллагена нейтрализуют уксусной кислотой до pH=8,5, приливают 30 л воды и нагревают до 38°C. Препарат «коллагеназа пищевая» массой 4 г растворяют в 400 см³ воды с температурой 38°C. Полученный раствор вносят в емкость с коллагеном и выдерживают при 38°C в течение 2,5 ч, перемешивая каждый час в течение 5 мин. Жидкую фракцию отделяют центрифугированием при 60 с^-1 в течение 5 мин, к твердому остатку приливают 30 л воды, перемешивают и повторно центрифугируют для отделения жидкой фракции. Далее в емкость вносят 74 см³ раствора ДМДПС с концентрацией селена 1000 мкг/см³, что соответствует концентрации селена 1,2 мкг на 1 г коллагена, выдерживают 3 ч при 18°C и проводят нейтрализацию 5% раствором аскорбиновой кислоты до pH=7.

Пример 3.

Условия получения добавки соответствуют примеру 1, отличаясь тем, что после центрифугирования и отделения жидкой фракции вносят 40 см³ раствора ДМДПС с концентрацией 1000 мкг/см³, что соответствует концентрации селена 1,3 мкг на 1 г коллагена.

Пример 4.

Условия получения добавки соответствуют примеру 1, отличаясь тем, что после центрифугирования и отделения жидкой фракции вносят 30,6 см³ раствора ДМДПС с концентрацией 1000 мкг/см³, что соответствует концентрации селена 1 мкг на 1 г коллагена.

Пример 5.

Условия получения добавки соответствуют примеру 1, отличаясь тем, что на заключительных этапах добавку обезвоживают сублимационной сушкой.

Добавка, полученная по примерам №№1-5, характеризуется показателями, представленными в таблице 1, и может быть использована в в рецептурах продуктов на мясной, рыбной, молочной основе в качестве структурообразователя и стабилизатора в количестве 3-20% к массе основного сырья.

Преимущества предлагаемого технического решения по сравнению с прототипом представлены в таблице 2.