Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЛЕТАЛЬНОГО ФАКТОРА СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ НА ОСНОВЕ ИММУНОДЕТЕКЦИИ, СОПРЯЖЕННОЙ С ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИЕЙ

Изобретение относится к биотехнологии, конкретно - к областям диагностической медицинской микробиологии, медицинской биохимии, прикладной иммунохимии и разработки диагностических тест-систем, касается разработки нового способа для высокочувствительного определения белка летального фактора сибирской язвы (LF) в инфицированных образцах биологического происхождения и окружающей среде.

Основной областью применения предлагаемого способа определения летального фактора сибирской язвы являются микробиологическая диагностика, биомедицина, микробиологические исследования, разработка средств ранней и высокоэффективной специфической диагностики вирулентного возбудителя сибирской язвы, санитарно-гигиенический контроль за наличием возбудителя сибиреязвенной инфекции в окружающей среде и продуктах животного происхождения, предотвращение угрозы биотерроризма.

Летальный фактор сибирской язвы представляет собой один из трех важнейших белковых компонентов экзотоксина, определяющего патогенность токсигенных штаммов грамм-положительной бактерии Bacillus anthracis, являющейся возбудителем особо опасного инфекционного заболевания сибирской язвы. Изолированный белок LF не приводит к патологическим последствиям, но в комбинации с другим компонентом летального токсина протективным антигеном (РА) он вызывает тяжелые токсические эффекты как у человека и млекопитающих, так и в культуре клеток in vitro. С биохимической точки зрения белок LF представляет собой Zn²⁺-зависимую металлопротеазу, специфически расщепляющую белки семейства митоген-активируемых протеин киназ МАРКК (в частности, МЕК1), приводя к лизису клеток, подвергшихся действию токсина под воздействием макрофагов [Duesbery N.S., Webb C.P., Leppla S.H. с соавт. // Science. - 1998. - V.280, N.5364. - Р.734-737.]. Проведены детальные исследования ферментативной активности LF, его субстратной специфичности, его трехмерной структуры и выявлена его ключевая роль в развитии летального исхода при сибиреязвенной инфекции.

Особенностью сибиреязвенной инфекции является протекающий практически бессимптомно ранний этап синтеза компонентов сибиреязвенного токсина, включая летальный фактор, и последующий быстрый переход инфицированного организма в так называемую "точку невозврата", при которой эффективность традиционно применяемой терапии антибиотиками не способна скомпенсировать развитие токсической патологии. Экспериментально показано, что концентрация летального фактора у резус-макак через 24 часа после аэрозольной инфекции спорами не превышает 6-200 пг на мл крови и достигает нанограммов только через 48 часов, однако летальный исход возможен уже на вторые-третьи сутки после заражения [Boyer А.Е., Quinn C.P., Hoffmaster A.R. с соавт. // Infection and Immunity - 2009. - V.77, N.8. - P.3432-3441.]. Ранняя диагностика накопления LF при сибиреязвенной инфекции и своевременно примененная антибиотикотерапия обеспечивают благоприятный прогноз исхода заболевания. Применение в клинической практике специфичных и высокочувствительных диагностических тест-систем, способных определять крайне низкие (менее 1 нг) концентрации LF на ранних этапах сибиреязвенной инфекции, предотвращает риск летального исхода, а для эффективного предотвращения последствий массовых эпидемий или биотеррористических атак необходима детекция компонентов сибиреязвенного токсина в количестве менее 1 пг.

Высокая специфичность и чувствительность детекции сибиреязвенной инфекции на ранних этапах не достижима способами, традиционно применяемыми на сегодняшний день в медицинской диагностике - иммуноферментным анализом (ИФА) и классической полимеразной цепной реакцией (ПЦР). Чувствительность наиболее эффективных вариантов ИФА, задействующих флюоресцентные и хемилюминесцентные коньюгаты антител, не превышает 100 пг, а большинство систем ИФА применимо лишь при накоплении в тканях значительного количества патогенной бактерии, что происходит лишь через 50-72 часа после инфекции, то есть при приближении инфицированного организма к "точке невозврата" и к гибели [Mabry R., Brasky К., Geiger R с соавт. // Clin. and Vaccine Immunol. - 2006. - V.13, N.6. - P.671-677.]. Специфичность ПЦР-аплификации фрагментов генов B. anthracis и ее потенциал в качестве диагностического инструмента сильно зависимы от качества и количества детектируемой ДНК-матрицы и количества примесей в исследуемых образцах близкородственной ДНК [Janse I., Hamidjaja R.A., Bok J.A., and van Rotterdam BJ. // BMC Microbiology. - 2010. - V.10. - P.314.].

Решение проблемы повышения чувствительности анализа в диагностике сибиреязвенной инфекции на ранних этапах осуществляется при помощи ПЦР, проводимой в режиме реального времени, применения масс-спектрометрических методов, использования технологий аптамеров. Несмотря на значительно более высокую чувствительность по сравнению с традиционными методами ИФА и ПЦР, каждый из этих способов детекции имеет ряд существенных ограничений. В случае работы с образцами окружающей среды и биологическими пробами ПЦР-диагностика B. anthracis в режиме реального времени требует тщательного подбора условий реакции, долгой и сложной процедуры предварительной обработки образцов, постоянного дублирования экспериментов и борьбы с фоновыми загрязнениями [Antwerpen M.H., Zimmermann P., Bewley К. с соавт. // Mol. Cell. Probes. - 2008. - V.22. - Р.313-315.]. Реакция крайне чувствительна к контаминации и легко приводит ложноположительным результатам. Масс-спектрометрическая детекция применяется для детекции компонентов токсина сибирской язвы и обладает высокой чувствительностью (1-5 пг) [Boyer А.Е., Gallegos-Candela M., Lins R.C. с соавт. // Molecules. - 2011. - V.16, N.3. - Р.2391-2413.], но при широкомасштабном применении для разнородных образцов может оказаться неспецифичной и осложняется необходимостью предварительной очистки мишени, что неизбежно приводит к потерям времени и материала, и, таким образом, не может использоваться для ранней диагностики и для количественного определения токсина и его компонентов. Аптамерные системы определения компонентов сибиреязвенного патогена, обладая преимуществом прямого узнавания антигена, и, как следствие, высокой скоростью тестирования, на данный момент недостаточно оптимизированы и не имеют достаточной аффинности и специфичности для обеспечения высокой чувствительности разрабатываемых на их основе способов детекции. Нижний порог чувствительности детекции существующими аптамерами протективного антигена составляет 1 нМ [Cella L.N., Sanchez P., Zhong W. С соавт. // Anal. Chem. - 2010. - V.82, N.5. - Р.2042-2047.]. На данный момент большинство этих методов выявления ранних стадий сибиреязвенной инфекции находится на стадии экспериментальных разработок и не существуют в виде стандартизованных коммерчески доступных диагностических тест-систем.

Известен способ детекции, основанный на флюоресцентном иммуноанализе и примененный в коммерчески доступной диагностической тест-системе, одобренной Научной ассоциацией по качеству аналитических инструментов (АОАС) и ориентированной на определение наличия спор сибирской язвы в окружающей среде и биологических образцах ("RAMP Anthrax Test", Response Biomedical Corporation, США), облающий высокой чувствительностью (предел чувствительности - 4 нг спор). Однако помимо того, что детекция по этому способу требует наличия специфического оборудования от того же производителя (RAMP Reader), данный способ весьма дорогостоящий, применим лишь к споровой форме бактерии B.anthracis и не пригоден для обнаружения бактерий в вегетативной форме или для детекции компонентов летального токсина на достаточно ранних стадиях заражения с целью проведения своевременной терапии.

Известен способ детекции летального фактора сибирской язвы на основе ИФА, примененный в коммерчески доступной системе для ("Anthrax Lethal Factor (LF) Protein ELISA Kit", Alpha Diagnostics International, США), однако, не обладая высокой чувствительностью, он может детектировать лишь не менее 3 нг летального фактора.

Известен способ определения инфекции Bacillus anthracis, разработанный на основе ПЦР (производимая НАРВАК "Тест-система для идентификации бактерий вида Bacillus anthracis методом полимеразной цепной реакции (ПЦР), разработанная в РосНИПЧИ "Микроб", г.Саратов, "Тест-система для выявления ДНК В. anthracis рХ01+ методом полимеразной цепной реакции", набор для определения сибиреязвенной инфекции на основе ПЦР "Anthrax Bacillus PCR Kit DNA PCR Instrument", Gentaur Molecular Products, США). Недостатком способа определения на основе традиционной ПЦР является долгая и сложная схема пробоподготовки, необходимая для получения воспроизводимых результатов и исключения ложноположительных сигналов, сложность количественной оценки результатов анализа, а также невозможность применения этих систем на ранних стадиях инфекции.

Известен способ определения сибиреязвенной инфекции, основанный на ПЦР, проводимой в режиме реального времени (набор "RealArt™ В. anthracis PCR Kit", Qiagen, США). Данный способ обладает высокой чувствительностью к спорам и вегетативным клеткам сибирской язвы (предел чувствительности детекции до 50 вегетативных клеток или спор), однако он не позволяет детектировать летальный токсин и его компоненты и проводить анализ на ранних стадиях развития заболевания.

Известен способ определения протективного антигена сибирской язвы, базирующийся на амплификации фрагментов этого гена при помощи ПЦР, проводимой в режиме реального времени ("LightCycler Bacillus anthracis kit; Roche Applied Science, США), он имеет высокую возпроизводимость и чувствительность, однако не способен детектировать летальный фактор В. anthracis.

Известен способ детекции летального фактора сибирской язвы (патент РФ 2418860). Данный способ основывается на детекции протеолитической активности LF за счет расщепления иммобилизованного на твердой фазе специфического рекомбинантного субстрата, химеризованного с белком щелочной фосфатазы. Каталитическую активность щелочной фосфатазы, перешедшей в раствор при расщеплении субстрата, детектируют с использованием флюоресцентного или хемилюминесцентного метода. Этот способ характеризуется высокой чувствительностью и способен детектировать до 1 пМ летального фактора. Однако поскольку LF является термолабильной протеазой, подверженной ферментативной деградации и быстро теряющей собственную каталитическую активность, данный способ применим для работы только со вновь взятыми и потенциально инфекционно опасными пробами, таким образом, его применение требует специфических условий хранения тестируемых образцов, организации специальных помещений, высокой квалификации персонала и получения административных разрешений на работу с инфекционно опасными материалами.

Известен и активно разрабатывается наиболее технически близкий к заявляемому способ детекции биологических молекул, объединяющий преимущества специфичности иммунологической детекции с высокой чувствительностью полимеразной цепной реакции [US Patent 5665539]. Данный подход, получивший название иммуно-ПЦР, в своем простейшем варианте основан на иммобилизации антигена на твердой фазе с последующей детекцией его при помощи специфического антитела, ковалентно или нековалентно связанного с ДНК-матрицей, позволяющей провести амплификацию сигнала при помощи ПЦР. Оптимизированными вариантами данного способа являются иммобилизация на твердой фазе антитела к одному из эпитопов антигена и последующая детекция антигена антителом к его другому эпитопу [Komatsu M., Kobayashi D., Saito К. с соавт. // Clin. Chem. - 2001. - V.47, N.7. - Р.1297-1301.], повышение чувствительности за счет апмлификации ДНК-матрицы при помощи различных вариантов ПЦР в режиме реального времени с применением флюоресцентной метки [Canto C.L., Sumita L.M., Machado A.F. с соавт. // Rev. Inst. Med. Trop.Sao Paulo. - 2008. - V.50, N.1 - P.61-63], внедрение улучшенных коньюгатов и модификаций матриц ДНК [Niemeyer C.M., Wacker R., and Adier M // Nucleic Acids Res. - 2003. - V.31, N.16. - P.e90.] и др. Способы определения на базе имммуно-ПЦР успешно применялись для детекции различных инфекционных патогенов, в частности, для детекции Шига-токсина патогенных штаммов E.coli [Не X., Qi W., Quinones В. с соавт.// Appl. Environ. Microbiol. - 2011. - V.77, N.ll - Р.3558-3564], вирусов [Barletta J., Bartolome A., and Constantine N.T. // J. Virol. Methods. - 2009. - V.157, N.2 - P.122-132.], стафилококкового энтеротоксина [Fischer A., von Eiff С., Kuczius Т. С соавт. // J. Mol. Med. (Beri). - 2007. - V.85, N.5. - P.461-469.] и др.

Разработка способов детекции сибиреязвенной инфекции или компонентов летального токсина B. anthracis на основе иммуно-ПЦР не проводилась.

Изобретение решает задачу создания высокочувствительного способа идентификации летального фактора сибирской язвы на основе иммунодетекции, сопряженной с ПЦР в режиме реального времени, применимого для его выявления в образцах биологических жидкостей и тканей на ранних и поздних этапах развития сибиреязвенной инфекции, а также в продуктах питания и окружающей среде, и употребимого для работы как к инфекционно опасными, так и с инактивированными пробами.

Поставленная задача решается за счет способа детекции летального фактора сибирской язвы с помощью системы из двух моноклональных антител, специфичных к белку LF, одно из которых иммобилизовано на твердой фазе и служит для связывания LF, находящегося в исследуемой пробе, а второе (биотинилированное) антитело детектирует LF и посредством мостика, образованного тетравалентной молекулой нейтравидина, связывается с биотинилированными фрагментами ДНК, используемыми в качестве субстрата для ПЦР-амплификации с флюоресцентной детекцией сигнала в режиме реального времени.

Также поставленная задача решается за счет применения твердофазного формата анализа, который позволяет провести специфическую иммобилизацию LF из большого количества жидких образцов и избавиться от содержащихся в образцах загрязнений на ранних этапах эксперимента.

Также поставленная задача решается за счет применения высокоаффинных моноклональных антител, специфичных к различным эпитопам белка LF, в силу чего не происходит конкуренции антител за сайт связывания в структуре белка, что способствует повышению чувствительности детекции.

Также поставленная задача решается за счет коньюгата ДНК с нейтравидином, образующего молекулярную "сетку", при использовании которой для детекции возможно увеличить количество матричных молекул ДНК, связанных с единичной молекулой биотинилированного антитела, и, таким образом, амплифицировать сигнал.

Также поставленная задача решается за счет применения в анализе ПЦР-стрипов (TopYield, Nunc, США), обладающих поверхностью, оптимизированной как для адсорбции белка, так и для проведения полимеразной цепной реакции с использованием матрицы ДНК, иммобилизованной на твердой фазе, и разрешающих одновременное проведение иммуносорбции и флюоресцентной детекции сигнала при постановке ПЦР в режиме реального времени в одной пробирке.

Также поставленная задача решается за счет блокировки поверхности стрипов раствором Денхардт-ДНК, которая препятствует неспецифической сорбции коньюгата ДНК-нейтравидин на поверхности стрипов и снижает вероятность ложноположительных результатов эксперимента.

Также поставленная задача решается за счет применения в анализе редко встречающейся в окружающей среде ДНК-матрицы, оптимизированной для проведения ПЦР-амплификации с флюоресцентной детекцией сигнала в режиме реального времени, что снижает вероятность возникновения ложноположительного сигнала при детекции, позволяет существенно повысить чувствительность метода и провести количественное определение содержания LF в исследуемых образцах.

Техническим результатом изобретения является создание эффективного высокочувствительного способа детекции летального фактора сибирской язвы.

Отличаем предлагаемого способа является использование двух специфических моноклональных антител к различным эпитопам белка LF, одно из которых посредством биотин-нейтравидинового взаимодействия связывается с ДНК, служащей матрицей для проведения ПЦР-амплификации с флюоресцентной детекцией сигнала в режиме реального времени, применимого для нужд клинической диагностики и мониторинга окружающей среды и качества продуктов питания. С использованием разработанного способа можно детектировать летальный фактор сибирской язвы в концентрации до 0,1 пМ.

В предлагаемом техническом решении специфичность узнавания LF обеспечивается за счет пары моноклональных антител, взаимодействующих с различными эпитопами молекулы LF. Это позволяет повысить чувствительность метода и избежать конкуренции антител за один эпитоп на молекуле белка LF. Одно из антител подвергается биотинилированию для последующего присоединения коньюгата ДНК с нейтравидином.

Предлагаемое техническое решение предусматривает использование нековалентного коньюгата ДНК с нейтравидином, который представляет собой молекулярную "сетку", образованную за счет взаимодействия биотина, находящегося на 5'-концах двухцепочечного фрагмента ДНК с тетравалетной молекулой нейтравидина. Наиболее эффективным является формирование таких комплексов в эквимолярном соотношении биотинилированной ДНК к белку нейтравидина. Нейтравидин является производным белка авидина, характеризующимся высокой специфичностью и эффективностью взаимодействия с биотином. Применение молекулярной "сетки" вместо несвязанных фрагментов биотинилированной ДНК повышает количество ДНК-матрицы, удерживаемой единичной молекулой антитела, и более чем в 10 раз увеличивает чувствительность метода.

Существенным условием успешного использования заявленного способа является блокировка свободных валентностей связывания твердой фазы, которая осуществляется пятикратным раствором Денхардт, содержащим 1% ДНК спермы лосося для предотвращения неспецифического связывания с поверхностью коньюгата ДНК-нейтравидин, применяемого в качестве матрицы для амплификации.

Важным достоинством предлагаемого способа определения LF является твердофазный формат анализа, который допускает проведение автоматизации этого метода детекции и минимизирует контакт оператора с потенциально инфицированным материалом. Для проведения тестирования по данному способу рекомендуется использовать стрипы TopYield (Nunc, США), оптимизированные одновременно для адсорбции белка и для проведения реакции амплификации ДНК, иммобилизованной на твердой фазе, с флюоресцентной детекцией сигнала. Кроме данных стрипов предпочтительными матрицами для иммобилизации антитела к LF являются: 1) парамагнитные микросферы или микрочастицы; 2) немагнитные пористые и непористые полимерные микросферы и микрочастицы; 3) микрочастицы, образуемые коллоидным золотом; 4) квантовые точки; 5) пористые и непористые полимерные поверхности; 6) рабочие поверхности биосенсоров.

К преимуществам заявленного способа определения летального фактора сибирской язвы относятся: 1) высокая чувствительность метода, позволяющая провести диагностику накопления белка летального фактора на ранних стадиях заражения сибирской язвой, своевременно начать антибиотикотерапию инфицированного, предотвратить возможность возникновения эпидемии или нейтрализовать последствия биотеррористической атаки; 2) гомологичность заявленного метода в части реагентов, материалов и оборудования стандартному иммуноферментному анализу и технологиям ПЦР-диагностики, применяемым в клинической практике; 3) высокая специфичность детекции LF, обеспечивающаяся примененным принципом иммунодетекции, и низкая вероятность получения ложноположительных сигналов по сравнению со стандартными методами ПЦР-диагностики; 4) возможность проведения быстрого анализа большого количества образцов; 5) дешевизна большинства используемых в анализе материалов; 6) возможность экстраполяции разработанного способа для детекции любых других патогенных и непатогенных молекул при подборе соответствующей пары специфических моноклональных детектирующих антител.

Изобретение осуществляют следующим образом:

Моноклональное антитело, специфичное к белку летального фактора сибирской язвы, иммобилизуют на микрострипах TopYield (Nunc, США) или на микропланшетах. Блокируют свободные валентности поверхности стрипа или планшета пятикратным раствором Денхардт, содержащим 1% ДНК спермы лосося. Троекратно промывают планшет раствором, содержащим 20 мМ трис-HCl рН 7,5, 100 мМ хлорида натрия и 5 мМ ЭДТА.

Проводят подготовку проб инфицированного биологического материала или образцов окружающей среды и продуктов питания. Для этого биологические жидкости центрифугируют для освобождения от клеточного дебриса и добавляют к супернатанту 1/10 раствора, содержащего 200 мМ трис-HCl, 1 М хлорида натрия и 50 мМ ЭДТА. Твердые образцы продуктов питания и почвы гомогенизируют с раствором, содержащим 40 мМ трис-HCl рН 7,5, 200 мМ хлорида натрия и 10 мМ ЭДТА, и инкубируют при встряхивании на шейкере в течение 10 минут, после чего удаляют твердые частицы центрифугированием.

Подготовленные пробы инкубируют с антителом, иммобилизованным на твердой фазе в течение 1 часа. После трехкратной промывки планшета раствором, содержащим 20 мМ трис-HCl рН 7,5, 100 мМ хлорида натрия и 5 мМ ЭДТА, на поверхность планшета или стрипа наносят биотинилированное антитело и инкубируют планшет при комнатной температуре со встряхиванием в течение 30 минут, после чего повторяют промывку поверхности планшета или стрипа.

К иммобилизованному на твердой фазе сэндвичу "антитело-летальный фактор-биотинилированное антитело" добавляют раствор нековалентного коньюгата ДНК с нейтравидином (молекулярная "сетка") и инкубируют коньюгат на планшете или стрипе в течение 30 минут. Промывку поверхности от несвязавшегося коньюгата с ДНК проводят раствором, содержащим 20 мМ трис-HCl рН 7,5, 300 мМ хлорида натрия, 5 мМ ЭДТА.

После полного удаления промывочного раствора в лунки планшета или пробирки стрипа добавляют смесь, содержащую буфер для ПЦР-амплификации, праймеры, рекомбинантную Taq-полимеразу и пробу TaqMan для проведения реакции ПЦР в режиме реального времени. Детекция флюоресцентного сигнала проводится при температуре отжига праймеров 56°С и времени элонгации 30 секунд с использованием прибора для ПЦР в режиме реального времени в течение 45 циклов амплификации. Присутствие летального фактора в исследуемых образцах определяют по изменению уровня флюоресценции в соответствующих лунках планшета или пробирках стрипа против контрольных.

Отрицательные контрольные значения флюоресцении фиксируются в лунках планшета или пробирках в составе стрипа, не содержащих тестируемых образцов. Положительные контрольные значения флюоресцении регистрируются в лунках или пробирках, содержащих фиксированные количества белка летального фактора сибирской язвы, взятого в известной концентрации. Принципиальная схема осуществления изобретения приведена на фиг.1. Изобретение иллюстрируют следующие графические материалы:

Фиг.1. Схема постановки эксперимента при определении летального фактора сибирской язвы способом иммунодетекции, сопряженной с ПЦР-амплификацией.

Фиг.2. Последовательность ДНК, используемая при определении летального фактора сибирской язвы способом иммунодетекции, сопряженной с ПЦР-амплификацией. Последовательности ДНК, соответствующие олигонуклеотидам, использованным для амплификации фрагмента и пробе TaqMan, примененной для проведения ПЦР-амплификации в режиме реального времени, выделены подчеркиванием.

Фиг.3. Последовательности олигонуклеотидов, используемых для приготовления коньюгата ДНК-матрицы с нейтравидином и проведения ПЦР-амплификации в режиме реального времени.

Биотинилированные праймеры, использованные для наработки ДНК-матрицы, примененной для коньюгирования с нейтравидином. Небиотинилированные варианты данных праймеров используют для проведения реакции ПЦР в режиме реального времени с пробой TaqMan. Проба TaqMan содержит на 5'-конце карбоксифлюоресцеин (FAM), а на 3'-конце гаситель флюоресценции RTQ1 (разработка компании Syntol, Россия).

Фиг.4. Получение коньюгата биотинилированной ДНК с нейтравидином для определения летального фактора сибирской язвы способом иммунодетекции, сопряженной с ПЦР-амплификацией. Результаты электрофореза в полиакриламидном геле комплексов биотинилированной ДНК с нейтравидином, сформированных при различном молярном соотношении ДНК к нейтравидину. Дорожка 1 - маркер молекулярной массы #SM1163 (Fermentas), 2 - молярное соотношение ДНК к нейтравидину 1:2, 3 - молярное соотношение ДНК к нейтравидину 1:1, 4 - молярное соотношение ДНК к нейтравидину 2:1.

Фиг.5. Типичные результаты определения летального фактора сибирской язвы способом иммунодетекции, сопряженной с ПЦР-амплификацией в режиме реального времени. Результаты измерения флюоресценции по методу TaqMan в реакции ПЦР-амплификации в режиме реального времени при определении летального фактора по способу иммунодетекции, сопряженной с ПЦР-амплификацией. По вертикальной оси изложены значения флюоресценции в единицах, по горизонтальной оси представлено количество циклов ПЦР-амплификации. Кривая 1 - положительный контроль (образец с концентрацией LF 10 рМ), кривая 2 - отрицательный контроль (образец не содержащий LF), кривая 3 - отрицательный контроль (ПЦР-реакция проведена без эксперименального образца), кривые 4-49 - экспериментальные образцы с различным содержание LF.

Для лучшего понимания сущности изобретения ниже следуют примеры его конкретного выполнения.

Пример 1. Приготовление проб для определения летального фактора сибирской язвы способом иммунодетекции, сопряженной с ПЦР-амплификацией

Подготовку проб инфицированного биологического материала проводят следующим образом. Отобранные образцы биологических жидкостей (кровь, моча, слюна) центрифугируют при 5000 об/мин и температуре +4°С для освобождения от клеточного дебриса, отбирают супернатант и повторно центрифугируют его при 10000 об/мин в течение 15 минут. К супернатанту добавляют 1/10 стерильного раствора, содержащего 200 мМ трис-HCl, 1 М хлорида натрия и 50 мМ ЭДТА.

К образцам биологических тканей, почвы и продуктов питания добавляют раствор, содержащий 40 мМ трис-HCl рН 7,5, 200 мМ хлорида натрия и 10 мМ ЭДТА из расчета один объем раствора (в мл) на одну единицу массы твердого образца (в г), и растирают в гомогенизаторе Дунса (20 ударов плотно прилегающего пестика) во льду. Полученный однородный гомогенат встряхивают на шейкере при температуре +4°С в течение 10 минут и удаляют твердые частицы центрифугированием при 10000 об/мин в течение 15 минут.

В случае необходимости проводят уничтожение в образцах жизнеспособных клеток и спор возбудителя сибирской язвы прогревом при 95°С в течение 1 часа.

Подготовленные образцы хранят при температуре +4°С в течение 4 часов до проведения анализа или замораживают при -70°С для длительного хранения.

Пример 2. Получение биотинилированного антитела для определения летального фактора сибирской язвы способом иммунодетекции, сопряженной с ПЦР-амплификацией

Выделение антител для детекции летального фактора сибирской язвы проводят из асцитной жидкости. Отобранную асцитную жидкость подвергают центрифугированию при 10000 об/мин в течение 15 минут для удаления клеточного дебриса. К полученному супернатанту добавляют равный объем буфера, содержащего 40 мМ трис-HCl рН 7,5, 200 мМ хлорида натрия, и проводят высаливание антитела из раствора добавлением насыщенного сульфата аммония до концентрации 50%, а затем выдерживают сульфатный раствор в течение 1 часа при температуре +4°С для формирования осадка. Полученный сульфатный осадок собирают центрифугированием при 12000 об/мин в течение 15 минут и растворяют в буфере, содержащем 50 мМ трис-HCl рН 7,5, 100 мМ хлорида натрия. Полученный белковый раствор центрифугируют при 12000 об/мин в течение 15 минут для удаления нерастворенных примесей и наносят на колонку Protein G (GE Healthcare, США), уравновешенную 10 объемами буфера, использованного для растворения белка. Колонку промывают 10 объемами того же буфера для удаления несвязавшегося белка и элюируют белок антитела раствором, содержащим 100 мМ глицин-HCl рН 2,6 и 100 мМ хлорида натрия. Приводят значение рН раствора к 8.0 добавлением раствора 1 М триса-основание с использованием рН-бумаги. Определяют концентрацию полученного белка антитела спектрофотометрически и анализируют его чистоту электрофорезом в денатурирующем полиакриламидном геле по методике Laemmli.

Полученный белок антитела троекратно диализуют против 100 объемов фосфатного буфера, содержащего 20 мМ Na₂HPO₄ и 100 мМ хлорида натрия, для удаления аминогрупп. Готовят раствор NHS-биотина в DMSO из расчета 1 мг/мл и добавляют полученный раствор к раствору антитела в объемном соотношении 1:8. Проводят реакцию биотинилирования при +4°С в течение ночи со встряхиванием и троекратно диализуют против 100 объемов фосфатного буфера, содержащего 20 мМ Na₂HPO₄ и 100 мМ хлорида натрия, для удаления несвязавшегося биотина.

Полноту биотинилирования контролируют постановкой иммуноблота с детекцией биотинилированного антитела коньюгатом нейтравидин-пероксидаза (Pierce, США).

Пример 3. Приготовление коньюгата биотинилированной ДНК с нейтравидином для определения летального фактора сибирской язвы способом иммунодетекции, сопряженной с ПЦР-амплификацией

В качестве ДНК для получения коньюгата с нейтравидином и матрицы для последующей ПЦР-амплификации в режиме реального времени используют фрагмент геномной ДНК Fusarium avenaceum длиной 397 пар оснований (фиг.2). Праймеры для амплификации фрагмента на 5'-концах модифицируют биотином (фиг.3). Наработку биотинилированного фрагмента ДНК проводят ПЦР амплификацией при помощи Taq-полимеразы при температуре отжига праймеров 56°С и времени элонгации фрагмента 30 секунд. Продукты ПЦР-реакции осаждают 3 объемами этанола с добавлением 1/10 объема ацетата натрия рН 5,2 и растворяют в 0,5 мл буфера, содержащего 20 мМ трис-HCl рН 7,5 и 300 мМ хлорида натрия, 5 мМ ЭДТА. Раствор ДНК центрифугируют для удаления нерастворенных примесей и наносят на гель-фильтрационную колонку Superdex-200 (GE-Healthcare, Великобритания), уравновешенную тем же буфером, для удаления побочных продуктов синтеза и не задействованных в синтезе олигонуклеотидов. Гель-фильтрацию проводят при скорости потока 0,5 мл/мин, выход разделяемых продуктов контролируют спектрофотометрически. Определяют содержание целевого фрагмента ДНК во фракциях гель-фильтрации электрофорезом в агарозном геле. Фракции, содержащие синтезированный фрагмент, осаждают 3 объемами этанола с добавлением 1/10 объема ацетата натрия рН 5,2 и растворяют в буфере, содержащем 20 мМ трис-HCl, 100 мМ хлорида натрия и 5 мМ ЭДТА. Количество ДНК в полученном растворе определяют спектрофотометрически.

Готовят раствор нейтравидина (Pierce, США) из расчета 1 мг/мл и смешивают его в эквимолярном соотношении с раствором ДНК. Смесь инкубируют при +4°С в течение ночи. Образование молекулярной "сетки" биотинилированной ДНК с нейтравидином контролируют электрофорезом ДНК в полиакриламидном геле по замедлению скорости миграции продуктов разделения против исходного фрагмента ДНК (фиг.4). Полученный коньюгат биотинилированной ДНК с нейтравидином очищают от несвязанной ДНК и нейтравидина гель-фильтрацией на колонке Superdex-200 (GE-Healthcare, Великобритания), уравновешенной буфером, содержащим 20 мМ трис-HCl рН 7,5, 300 мМ хлорида натрия и 5 мМ ЭДТА. Содержание коньюгата во фракциях гель-фильтрации контролируют электрофорезом в агарозном геле. Очищенный коньюгат концентрируют с использованием Microcon YM-50 (Millipore, США). Спектрофотометрически определяют концентрацию коньюгата по ДНК и белку и на основании этих данных рассчитывают соотношение ДНК к белку в полученной молекулярной "сетке". К коньюгату добавляют глицерин до 50% и хранят по аликвотам при температуре -70°С.

Пример 4. Постановка иммунодетекции летального фактора и связывание его с ДНК-матрицей для последующей ПЦР-амплификации в режиме реального времени

В пробирки стрипа TopYield (Nunc, США) по 50 мкл разносят буферный раствор, содержащий 20 мМ трис-HCl рН 7,5, 100 мМ хлорида натрия и антитело к летальному фактору сибирской язвы в концентрации 20 мкг/мл. Инкубируют стрип в течение 1 часа при 37°С. Проводят блокировку свободных валентностей поверхности пробирок стрипа приготовленным на том же буфере раствором Денхардт (1% Ficoll 400, 1% поливинилпирролидон, 1% бычий сывороточный альбумин), содержащим 1% ДНК спермы лосося. Для этого в пробирки стрипа добавляют 300 мкл раствора Денхардт-ДНК и инкубируют при встряхивании в течение 1 часа при 37°С. Троекратно промывают пробирки стрипа раствором, содержащим 20 мМ трис-HCl рН 7,5, 100 мМ хлорида натрия, 5 мМ ЭДТА. В пробирки стрипа разносят по 100 мкл подготовленные образцы, содержащие летальный фактор сибирской язвы в различных концентрациях. В пробирки, служащие отрицательным контролем, добавляют буферный раствор, содержащий 20 мМ трис-HCl рН 7,5, 100 мМ хлорида натрия, 5 мМ ЭДТА либо экспериментальные образцы, заведомо не содержащие белка летального фактора. Инкубируют пробирки при встряхивании в течение 1 часа при комнатной температуре. Троекратно промывают пробирки стрипа раствором, содержащим 20 мМ трис-HCl рН 7,5, 100 мМ хлорида натрия, 5 мМ ЭДТА. В пробирки стрипа добавляют по 100 мкл раствора, содержащего биотинилированное антитело, узнающее другой эпитоп белка сибирской язвы, и инкубируют пробирки при встряхивании в течение 30 минут при комнатной температуре. Троекратно промывают пробирки стрипа раствором, содержащим 20 мМ трис-HCl рН 7,5,100 мМ хлорида натрия, 5 мМ ЭДТА. В пробирки стрипа добавляют по 100 мкл раствора 20 мМ трис-HCl рН 7,5, 300 мМ хлорида натрия, 5 мМ ЭДТА, содержащего коньюгат биотинилированной ДНК с нейтравидином в количестве 0,1 мкг ДНК на пробирку, и инкубируют пробирки при встряхивании в течение 30 минут при комнатной температуре, после чего троекратно промывают пробирки стрипа раствором, содержащим 20 мМ трис-HCl рН 7,5, 300 мМ хлорида натрия, 5 мМ ЭДТА. После удаления промывочного раствора в пробирки стрипа разносят смесь для ПЦР-амплификации в режиме реального времени.

Пример 5. Проведение ПЦР-амплификации с флюоресцентной детекцией сигнала в режиме реального времени для определения летального фактора сибирской язвы способом иммунодетекции, сопряженной с ПЦР-амплификацией

Для проведения ПЦР-амплификации в режиме реального времени в пробирки стрипа разносят по 50 мкл 1х реакционную смесь для амплификации (Реакционная смесь 2,5х для проведения ПЦР-РВ, "Синтол", Россия), содержащую по 300 нМ каждого из праймеров для амплификации, идентичных таковым, использованным для наработки ДНК-матрицы, но не модифицированных биотином, и 200 нМ зонда TaqMan (фиг.3). Реакцию амплификации проводят на приборе для ПЦР амплификации в режиме реального времени MiniOpticon Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad, США) с использованием следующего протокола:

Регистрацию нарастания флюоресценции ведут при длине волны 520 нм. Пробы, содержащие летальный фактор сибирской язвы, показывают нарастание флюоресценции с 7 по 30 цикл реакции амплификации (фиг.5). Нарастания флюоресценции в контрольных пробах в этом диапазоне циклов реакции не обнаруживают. Применив калибровочную кривую, построенную на основании зависимости номера цикла, на котором начинает регистрироваться изменение флюоресцении, от значений концентрации белка летального фактора в контрольных образцах, определяют концентрацию белка летального фактора в исследуемых пробах.