Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ОТБОРА КИСЛОТОУСТОЙЧИВЫХ ШТАММОВ Lactobacillus helveticus

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к медицинской микробиологии, а также к производству заквасок для кисломолочных продуктов питания, и касается способа отбора штаммов молочно-кислых бактерий Lactobacillus helveticus, обладающих повышенной кислотоустойчивостью.

Уровень техники

Лактобактерии являются одним из основных компонентов нормофлоры человека. Они обитают в ротовой полости, во всех биотопах желудочно-кишечного и урогенитального трактов. От общего количества всех обитателей желудочно-кишечного тракта они составляют приблизительно 0,01-0,6%, но роль их в жизни организма очень велика (Jones B.V., Sun F., Marchesi J.R. Comparative metagenomic analysis of plasmid encoded functions in the human gut microbiome BMC Genomics 2010, 11:46; Saulnier DM, Kolida S, Gibson GR. Microbiology of the human intestinal tract and approaches for its dietary modulation. Curr Pharm Des. 2009, 15 (13), 1403-1414; Ботина С.Г., Коробан Н.В., Климина К.М., Глазова А.А., Захарович Н.В., Зинченко В.В., Даниленко В.Н. Генетическое разнообразие бактерий рода Lactobacillus из гастроинтестинальной микробиомы людей. Генетика, 2010, том 46, №12, с.1-9).

Лактобациллы длительное время привлекают внимание биотехнологов ввиду их потенциального значения для сохранения здоровья, профилактики и лечения многих заболеваний. К настоящему времени известно большое количество экспериментальных данных и клинических наблюдений о выраженной профилактической и терапевтической эффективности пробиотиков и продуктов функционального питания, приготовленных на основе специально отобранных штаммов лактобацилл (Патент Россия RU №2003136785. 2005.08.10; Заявка (страна): Россия RU №2244744, 2005.01.20; Заявка (страна): Россия RU №2002113809, 2004.01.27; Заявка (страна): Россия RU №2176668, 2001.12.10; Заявка (страна): Россия RU №2004105535, 2005.08.10; Заявка (страна): Россия RU №2247148, 2005.02.27; Заявка (страна): Россия RU №2223774, 2004.02.20; Заявка (страна): Россия RU №2154102. 2000.08.10; Заявка (страна): Россия RU №2000118223. 2002.10.20; Заявка (страна): США. 6,468,525. 29.05.2005. Заявитель (страна): Финляндия. Renew Life, Inc.; Заявка (страна): Швейцария РСТ/ЕР2008/052029, 20.02.2008. Заявитель (страна): Швейцария. NESTEC S.A. [СН/СН]; Заявка (страна): Болгария PCT/BG2007/000004, 14.03.2007; Заявка (страна): США PCT/US2007/014584, 22.06.2007; Заявка (страна): США PCT/GB2006/002440. 30.06.2006).

Важным свойством лактобацилл является устойчивость к низким значениям pH окружающей среды. Многие лактобактерии, являясь кислотообразующими бактериями, не способны, однако, выживать при экстремально низких значениях pH (2,0-3,0), существующих в верхнем отделе желудочно-кишечного тракта (ЖКТ), в частности в желудке. Поэтому приобретение пробиотиками такого свойства, как выживание при значениях pH 2,0-3,0 (при временном пребывании в желудке), является жизненно необходимым качеством пробиотиков, обеспечивающим сохранение, по крайней мере, части популяции их в ЖКТ, а следовательно, и проявление их полезной жизнедеятельности в нижних отделах ЖКТ.

В настоящее время для получения кислотоустойчивых штаммов лактобактерии применяется метод адаптации культур к низким значениям pH в течение различных периодов времени, в том числе и путем ступенчатого отбора (Cotter P.D. and Colin H. Microbiology Molecular Biology Reviews, 2003, 67: 429-453; Патент KR 1020080096383, 2008; Патент EP 1424075, 2004; Патент KR 100435168, 2004; Патент KR 1020040038656, 2004; Corcoran BM, Stanton С, Fitzgerald GF, Ross RP. Appl Environ Microbiol., 2005, Jun; 71(6):3060-7). Наиболее часто используют метод инкубации лактобактерии в жидкой среде с pH 2,0 (значение pH устанавливают с помощью раствора HCl) в течение 2 часов при температуре 37°C с последующим определением степени выживаемости клеток (Perea V. et al. Appl. Env. Microbiol., 73:3595-3604, 2007; Патент KR 100837856, 2008).

К недостаткам указанных методов можно отнести: 1) отсутствие селективного маркера, позволяющего достоверно отбирать кислотоустойчивые мутанты после рассева обработанной культуры на питательную среду, позволяющую расти бактериям; 2) относительно невысокая стабильность признака кислотоустойчивости.

Известно, что повышение кислоточувствительности лактобактерии проявляется у мутантов лактобактерии по генам оперона dlt, кодирующим белки, ответственные за присоединение D-аланина к липотейхоевым кислотам клеточной стенки. Эта корреляция наблюдается у dlt-мутантов Streptococcus mutans (Boyd D.A. et al. J. Bacteriol., 182: 6055-6065,2000), Lactobacillus rhamnosus (Perea V. et al. Appl. Env. Microbiol., 73:3595-3604, 2007), Lactobacillus reutery (Walter J. and Loach D.M. Env. Microbiol., 9: 1750-1760,2007). У этих мутантов повышается также чувствительность к антимикробным пептидам, в частности, к ингибитору синтеза клеточной стенки низину А у Lactobacillus reuteri. Известно, что одним из механизмов устойчивости к низину А штамма Lactococcus lactis (продуцент низина А) является увеличение D-аланилирования липотейхоевой кислоты (Kramer N.E. et al. Microbiology, 154: 1755-1762, 2008).

Вышеперечисленные сведения указывают на корреляцию признаков чувствительности к низину А и кислоточувствительности различных видов лактобактерий. Изобретений, основанных на отборе лактобактерий-пробиотиков по признаку устойчивости к низину А, в патентной литературе не обнаружено. В научной литературе описано получение низинустойчивого штамма Streptococcus bovis (не является пробиотиком и продуцентом низина А), у которого в числе прочих характеристик отмечено повышение D-аланилирования липотейхоевой кислоты (Mantovani H.C. and Russel J.B. Appl. Env. Microbiol., 67: 808-813, 2001).

Раскрытие изобретения

Задачей настоящего изобретения является разработка нового способа отбора кислотоустойчивых штаммов Lactobacillus helveticus с целью получения штаммов Lactobacillus helveticus с повышенной кислотоустойчивостью.

Способ отбора кислотоустойчивых штаммов Lactobacillus helveticus основан на отборе мутантов лактобактерий, устойчивых к низину А и включает следующие стадии: предварительный отбор мутантов Lactobacillus helveticus, устойчивых к низину А в концентрации от 25 до 100 мг/мл после культивирования их на среде MRS-бульон и MRS-агар с низином А, после чего отобранные низинустойчивые мутанты повторно культивируют в MRS-бульоне при pH 2, затем высевают на MRS-агар с pH 5,7, инкубируют в течение 48 ч, определяют степень их выживаемости и отбирают кислотоустойчивые штаммы Lactobacillus helveticus, степень выживаемости у которых повышается более чем на 1,58 порядок по сравнению с исходной культурой Lactobacillus helveticus.

Осуществление изобретения

Способ отбора и получения кислотоустойчивого штамма Lactobacillus helveticus состоит из следующих этапов:

1. Отбор низинустойчивых мутантов

Способ отбора низинустойчивых мутантов основан на отборе спонтанных мутантов, выросших на агаризованной питательной среде, содержащей низин А.

Предварительно готовят чашки Петри с MRS-агаром, содержащие 0,5 мг низина на 20 мл среды. Для этого в стерильную чашку Петри вносят 1 мл стерильного раствора, содержащего 0,5 мг низина в дистиллированной воде, заливают 20 мл расплавленного и остуженного до 40-50°C MRS-агара, круговыми движениями по поверхности стола размешивают низин в агаре, ставят чашки в наклонное положение и оставляют застывать для получения скошенной поверхности агара на чашке. Чашки с застывшим агаром ставят на горизонтальную поверхность, заливают по 20 мл на чашку расплавленным и остуженным до 40-50°C MRS-агаром и оставляют застывать. В качестве исходной культуры для отбора низинустойчивых мутантов используют культуру лактобактерий Lactobacillus helveticus NK-1, известную ранее как Lactobacillus acidophilus NK-1 и депонированную в Государственной коллекции микроорганизмов нормальной микрофлоры ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского под номером ГКНМ №111, a также в коллекции ВНИМИ ЦЛМ под номером №22/10. Генотипирование штамма Lactobacillus acidophilus NK-1 путем анализа нуклеотидной последовательности 16S рибосомной РНК показало, что данный штамм относится к виду Lactobacillus helveticus (Ботина С.Г., Климина К.М., Коробан Н.В., А.М.Амерханова, В.В.Зинченко, В.Н.Даниленко. Реклассификация отечественных пробиотических культур бактерий рода Lactobacillus // Генетика, 2010. Т.46, №11 С.1485-1492).

Культуру лактобактерий Lactobacillus helveticus NK-1 с агаризованной MRS среды (pH=6,5) засевают петлей в пробирку с 5 мл MRS-бульона (pH=6,5) и инкубируют в термостате при (37±1)°C в течение 18 часов.

Через 18 ч пробирку интенсивно встряхивают или барботируют, отбирают из нее 0,20 мл суспензии, вносят суспензию в чашки Петри с MRS-агаром, содержащим 0,5 мг низина в 20 мл среды, и растирают суспензию шпателем по поверхности агара. Чашки ставят в анаэростат и инкубируют в течение 48 часов в термостате при температуре (37±1)°C. Из выросших колоний низинустойчивых мутантов (мутанты Lactobacillus helveticus NR-1) отбирают наиболее крупные, отдельно стоящие колонии, пересевая их микробиологической петлей в пробирки с 5 мл MRS-бульона. Пробирки инкубируют в течение 18-20 часов в термостате при (37±1)°C.

Выросшие культуры мутантов Lactobacillus helveticus NR-], устойчивых к 25 мкг/мл (0,5 мг низина в 20 мл среды), высевают на MRS-агар с низином, концентрация которого в отдельных чашках составляет 1,0, 1,5 и 2,0 мг в 20 мл среды и повторяют процедуру отбора.

В итоге отбирают мутанты, устойчивые к 100 мкг/мл низина в среде (2 мг в 20 мл среды) и из их числа, после повторной проверки на устойчивость к 100 мкг/мл низина, отбирают мутанты NR-2.

2. Отбор кислотоустойчивых штаммов

Культуры мутантов Lactobacillus helveticus NR-1 и NR-2 с агаризованной MRS среды (pH=6,5) засевают микробиологической петлей в пробирку с 5 мл MRS-бульона (pH=6,5) и инкубируют в термостате при (37±1)°C в течение 18 часов.

Через 18 ч пробирки интенсивно встряхивают или барботируют, отбирают из них 0,25 мл суспензии и вносят в пробирки с 5 мл бульона MRS с pH=2. По истечении каждых 30 минут делают высевы культуры на чашки Петри с агаризованной питательной средой MRS с pH 5,7, растирая 0,20 мл суспензии шпателем по MRS-агару. Засеянные чашки Петри помещают в анаэростат и инкубируют в термостате в течение 48 часов при температуре (37±1)°C. Отбирают наиболее крупные, отдельно стоящие колонии, пересевают их петлей в пробирки с 5 мл MRS-бульона и инкубируют в течение 18-20 часов в термостате при (37±1)°C.

Кислотоустойчивые штаммы Lactobacillus helveticus AR-1 и AR-2 были отобраны из числа низинустойчивых мутантов NR-1 и NR-2, инкубированных повторно при pH 2 в течение 120 минут.

Полученные штаммы AR-1 и AR-2 проявили значительно большую кислотоустойчивость, чем исходный штамм (см. табл.1). В отличие от исходного штамма, выживаемость которого (после инкубации при pH 2 в течение 2 часов) снизилась, в среднем, на 3,7 порядка, выживаемость штамма AR-1 снизилась на 2,12 порядка, а штамма AR-2 - на 1,12 порядка.

Таким образом, штаммы Lactobacillus helveticus AR-1 и AR-2, полученные с использованием нового способа отбора по признаку устойчивости к низину А, приобрели повышенную кислотоустойчивость и способны, следовательно, более эффективно функционировать в ЖКТ, чем исходный штамм Lactobacillus helveticus NK-1.

3. Характеристика кислотоустойчивых штаммов

3.1. Утилизация углеводов

У полученных штаммов AR-1 и AR-2 спектр сбраживаемых углеводов не изменился по сравнению с исходным штаммом, а сбраживание некоторых углеводов (ксилоза, сорбит, дульцит) усилилось (см. табл.2). Оценка степени сбраживания углеводов проводилась визуально по интенсивности окраски жидких сред Гисса с различными углеводами и индикатором бромкрезоловым пурпурным.

3.2. Сквашивание молока

Сквашивание молока оценивали путем определения изменения величины pH, концентрации жизнеспособных клеток и скорости образования сгустка при росте лактобактерий на стерильном молоке (см. в табл.3 и 4).

При сквашивании молока такие показатели, как концентрация жизнеспособных клеток (табл.4) и изменение величины pH (табл.3), у низинустойчивых штаммов AR-1 и AR-2 сохранились на уровне исходного штамма. Образование сгустка молочнокислого продукта в культурах штаммов AR-1 и AR-2 наблюдалось, как и в культуре исходного штамма после 6 часов инкубации.

Таким образом, такие важные функциональные показатели, как спектр сбраживаемых углеводов и интенсивность сквашивания молока у штаммов AR-1 и AR-2 сохранились на уровне этих показателей у исходного штамма. Однако у новых штаммов AR-1 и AR-2 усилился по сравнению с исходным штаммом такой важный функциональный показатель, как кислотоустойчивость, что обеспечивает пробиотикам большую выживаемость в ЖКТ.

3.3. Устойчивость к антибиотикам

Спектр чувствительности к антибиотикам (стрептомицин, неомицин, канамицин, гентамицин, тетрациклин, эритромицин, азитромицин, рокситромицин, линкомицин, клиндамицин, хлорамфеникол, рифампицин, полимиксин Б) у новых штаммов AR-1 и AR-2 не изменился по сравнению с исходным штаммом. По отношению к антибиотикам - ингибиторам синтеза клеточной стенки новые штаммы AR-1 и AR-2 приобрели устойчивость к низину А (в отличие от низинчувствительного исходного штамма). Устойчивость к таким ингибиторам, как производные пенициллина (бензилпенициллин и ампициллин) у новых штаммов AR-1 и AR-2 повысилась. Устойчивость к ингибитору ванкомицину у новых штаммов осталась на том же уровне, что и у исходного штамма.

Таким образом:

1) новый способ получения кислотоустойчивых штаммов основан на отборе мутантов, устойчивых к низину А. По сравнению с методом отбора кислотоустойчивых штаммов путем ступенчатой адаптации к низким значениям pH новый способ получения штаммов обеспечивает упрощение процедуры отбора и повышает селективность отбора.

2) Полученные с помощью нового способа отбора кислотоустойчивые штаммы приобретают устойчивость к низину А (в пределах от 25 до 100 мкг/мл низина) и повышенную кислотоустойчивость (повышение продолжительности выживания при pH 2) без изменения таких жизненно важных функциональных показателей, как спектр и интенсивность сбраживания углеводов и без снижения интенсивности сквашивания молока и образования сгустка молочнокислого продукта.

Вышеизложенное иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1.

Отбор низинустойчивых мутантов

Культуру лактобактерий Lactobacillus helveticus NK-1 с агаризованной MRS среды (pH=6,5) засевают петлей в пробирку с 5 мл MRS-бульона (pH=6,5) и инкубируют в термостате при (37±1)°C в течение 18 часов.

Через 18 ч пробирку интенсивно встряхивают или барботируют, отбирают из нее 0,20 мл суспензии, вносят суспензию в чашки Петри с MRS-агаром, содержащим 25 мкг/мл низина А, и растирают суспензию шпателем по поверхности агара. Чашки ставят в анаэростат и инкубируют в течение 48 часов в термостате при температуре (37±1)°С. Из выросших колоний низинустойчивых мутантов (мутанты Lactobacillus helveticus NR-1) отбирают наиболее крупные, отдельно стоящие колонии, пересевая их петлей в пробирки с 5 мл MRS-бульона. Пробирки инкубируют в течение 18-20 часов в термостате при (37±1)°C.

Мутанты NR-1 служат исходной культурой для получения мутантов, устойчивых к низину А в более высоких концентрациях.

Культуры мутантов Lactobacillus helveticus NR-1 высевают на MRS-агар с низином, концентрация которого в отдельных чашках составляет 50, 75 и 100 мкг/мл и повторяют процедуру отбора.

В итоге, после повторной проверки на устойчивость к низину отбирают мутанты, устойчивые к 25 мкг/мл (мутанты NR-1) и к 100 мкг/мл низина в среде (мутанты NR-2).

Пример 2.

Отбор кислотоустойчивого штамма AR-1

Культуру Lactobacillus helveticus NR-I с агаризованной MRS среды (pH=6,5) засевают петлей в пробирки с 5 мл MRS-бульона (pH=6,5) и инкубируют в термостате при (37±1)°C в течение 18 часов.

Через 18 ч пробирки интенсивно встряхивают или барботируют, отбирают из них 0,25 мл суспензии и вносят в пробирки с 5 мл бульона MRS с pH=2. По истечении 120 минут делают высевы культуры на чашки Петри с агаризованной питательной средой MRS с pH 5,7, растирая 0,2 мл суспензии шпателем по MRS-агару. Засеянные чашки Петри помещают в анаэростат и инкубируют в термостате в течение 48 часов при температуре (37±1)°C. Отбирают 50 наиболее крупных кислотоустойчивых колоний, пересевают их в пробирки с 5 мл MRS-бульона и инкубируют в течение 18-20 часов в термостате при (37±1)°C.

Выросшие культуры кислотоустойчивого штамма Lactobacillus helveticus AR-1 повторно инкубируют при pH 2 в течение 120 минут, затем высевают на MRS-агар с pH 5,7 и определяют степень их выживаемости после 48 часов инкубации.

Аналогичную процедуру проводят с исходным штаммом (контрольная культура).

Средняя выживаемость клеток культуры штамма AR-1 была выше на 1.58 порядка, чем выживаемость клеток культуры исходного штамма NK-1.

Пример 3.

Отбор кислотоустойчивого штамма AR-2

Культуру Lactobacillus helveticus NR-2 с агаризованной MRS среды (pH=6,5) засевают петлей в пробирки с 5 мл MRS-бульона (pH=6,5) и инкубируют в термостате при (37±1)°C в течение 18 часов.

Через 18 ч пробирки интенсивно встряхивают или барботируют, отбирают из них 0,25 мл суспензии и вносят в пробирки с 5 мл бульона MRS с pH=2. По истечении 120 минут делают высевы культуры на чашки Петри с агаризованной питательной средой MRS с pH 5,7, растирая 0,2 мл суспензии шпателем по MRS-агару. Засеянные чашки Петри помещают в анаэростат и инкубируют в термостате в течение 48 часов при температуре (37±1)°C. Отбирают 50 наиболее крупных кислотоустойчивых колоний, пересевают их в пробирки с 5 мл MRS-бульона и инкубируют в течение 18-20 часов в термостате при (37±1)°C.

Культуры кистотоустойчивого штамма AR-2 повторно инкубируют при pH 2 в течение 120 минут, затем высевают на MRS-агар с pH 5,7 и определяют степень их выживаемости после 48 часов инкубации.

Аналогичную процедуру проводят с исходным штаммом (контрольная культура). Средняя выживаемость клеток культуры штамма AR-2 была выше на 2,58 порядка, чем выживаемость клеток культуры исходного штамма.