Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ С ПОМОЩЬЮ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИНДИВИДУАЛЬНОЙ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ К ХИМИОТЕРАПИИ КУЛЬТУРАЛЬНЫМ МЕТОДОМ И ПРИМЕНЕНИЯ КОМБИНАЦИИ РАСТИТЕЛЬНЫХ ЦИТОСТАТИКОВ

Изобретение относится к области медицины и касается определения индивидуальной чувствительности к химиотерапии клеток рака яичника и подбора стратегии лечения пациентов, страдающих этим заболеванием. Сущность способа заключается в том, что удаленный хирургическим путем фрагмент опухоли диссоциируют, переводят в монослойную культуру и подвергают воздействию онкоантибиотиков в различных дозах и комбинациях. Затем, на основании данных о цитотоксическом и цитостатическом действии таких препаратов принимают решение о стратегии химиотерапии. Использование способа позволяет повысить точность подбора препаратов для химиотерапии, повысить ее эффективность, понизить их токсическое действие.

Описание изобретения

Важнейшей проблемой современной химиотерапии злокачественных новообразований является разработка методов индивидуального лечения и прогнозирования течения заболевания. Важным моментом является получение данных об экспрессии в опухолях разных видов лекарственной устойчивости. Множественная лекарственная устойчивость опухолей - это врожденная или приобретенная невосприимчивость опухолевых клеток к противоопухолевым препаратам, различным по структуре и механизмам действия (так называемыми МЛУ-цитостатикам).

Известен способ определения индивидуальной чувствительности к химиотерапии солидных опухолей методом обратной полимеразной цепной реакции (Goldstein U at all., J Nath. Cancer Inst., 1989, Jan 18, 81 (2), p. 116-24).

К существенным недостаткам этого метода относится то, что выявляет активность генов, ответственных за лекарственную устойчивость на уровне РНК и не позволяет судить о функциональной активности этой системы.

Известен способ определения индивидуальной чувствительности к химиотерапии солидных опухолей человека, отличающийся тем, что операционный материал опухоли инкубируют в растворе Хенса, в растворе с глюкозой, раствор отбрасывают, из опухолевой ткани готовят суспензию опухолевых клеток, помещают в пробирки, добавляют в опытные пробирки веропомил, гинистиин, иозит натрия, затем во все пробирки добавляют доксорубицин в различных концентрациях, инкубируют, а затем во все пробирки добавляют формалин и определяют значение флюоресценции на проточном флюориметре.

Заключение о чувствительности опухолевых клеток к различным видам химиотерапии делают по соотношению значения флюоресценции в различных вариантах (патент 2315997RU). Недостатком этого метода являются сложность, а зачастую невозможность отделения клеток солидной опухоли от нормальных тканей, что, ввиду различного содержания клеток прилежащих тканей и инфильтрирующих опухоль клеток иммунной системы, оказывает неоднозначное влияние на чувствительность и специфичность данного теста. Кроме того, в подавляющем числе солидных опухолей происходят апоптотические и некротические процессы. Это приводит к практически неизбежному наличию в образцах гибнущих и погибших клеток, которые также могут искажать картину опухолевой резистентности.

Рак молочной железы является одним из наиболее значимых онкологических заболеваний у женщин. Каждый год в мире регистрируется более миллиона новых случаев этого семейства заболевания, а в России более 50000. Число погибающих от этих заболеваний составляет около 50%.

Обычно, лечение опухолей молочной железы проводят по стандартной схеме - в зависимости от стадии применяется либо химиотерапевтическое, либо комбинированное лечение, включающее в себя хирургическое удаление опухолей и метастазов, радио - и химиотерапию.

Однако ни в случаях монохимиотерапии, ни при комплексной терапии практически не исследуется индивидуальная чувствительность пациентов к химиопрепаратам. Это ведет к высокой смертности пациенток, особенно на 3-4 стадии заболеваний.

Ввиду недостаточной эффективности применяемых методов лечения рака молочной железы нами предложен способ лечения, включающий определение индивидуальной чувствительности опухолевых клеток больного раком молочной железы к онкоантибиотикам и химиотерапии на основе полученных данных с помощью препаратов и их комбинаций, обладающих максимальной цитотоксической и цитостатической активностью по отношению к исследуемой опухоли.

Решение поставленной задачи достигается тем, что применяют способ лечения рака молочной железы с помощью определения индивидуальной чувствительности к химиотерапии культуральным методом и применения комбинации растительных цитостатиков на основании такого определения.

Способ осуществляют следующим образом. Полученный хирургическим путем фрагмент опухоли помещают в сосуд, содержащий стерильную среду RPMI-1640 с добавлением глютамина, гентамицина и стрептомицина, а также 5% фетальной бычьей сыворотки (транспортная среда), причем объем транспортной среды должен в 20 или более раз превосходить объем помещенной ткани. Культуральный сосуд с образцом помещается в лед и транспортируется в лабораторию, оснащенную ламинарным боксом для стерильной работы, центрифугой и CO₂ инкубатором. В течение часа после получения опухолевой ткани ее диссоциируют 0,5-4% раствором клостридиальной коллагеназы в условиях CO₂ инкубатора при содержании CO₂, равном 6%. Предварительно фрагменты опухолевой ткани очищают от остатков прилежащих тканей при помощи глазных ножниц в чашке Петри с транспортной средой. Для стерилизации фрагментов их пятикратно отмывают на центрифуге стократным объемом транспортной среды. После диссоциации ткани под действием коллагеназы суспензию избавляют от недиссоциировавших фрагментов фильтрацией через мелкую стерильную сетку. Фильтрат центрифунгируют и ресуспендируют в среде следующего состава: среда RPMI-1640 - 40%, среда F12 40%, фетальная бычья сыворотка 20%, с добавкой суплемента (Sigma), гентамицина, глютамина. Полученные клетки рассевают в концентрации 500000 в мл на плоскодонные культуральные сосуды и культивируют до образования монослоя клеток в атмосфере 6% CO₂, при смене среды один раз в два дня. При таких условиях образуется монослой опухолевых клеток, практически лишенный погибших клеток, а также клеток нормальных тканей пациента. После достижения монослоя клетки переводят в суспензию и рассевают на 96-луночные плоскодонные плашки из расчета 10⁴ на лунку. Затем в лунки добавляют онкоантибиотики в различных комбинациях и концентрациях. После инкубации культур в течение ночи при 37°C и 6% CO₂ в лунки плашек добавляют витальный краситель, содержащий акридиновый оранжевый. Под люминисцентным микроскопом оценивают процентное соотношение живых и мертвых клеток в каждой лунке. В дальнейшем для терапии использовали сочетание препаратов, вызвавшее максимальный процент гибели опухолевых клеток. При неэффективности стандартной химиотерапии (доксорубицин, винкристин и их аналоги) применяют растительные малотоксичные цитостатики, в частности экстракты аконита джунгарского и барвинка розового.

Технический результат при использовании изобретения заключается в том, что заявленный способ позволяет эффективно лечить рак молочной железы путем выявления комбинации препаратов, к которым опухолевые клетки конкретного пациента наиболее чувствительны, а также подбирать соотношения и дозировки таких препаратов и использование этих препаратов как традиционных, так и растительных цитостатиков для лечения пациентов с раком молочной железы.

Пример

Пациентка О.Т., диагноз - среднедифференцированная аденокарцинома молочной железы, 3 стадия. Несмотря на проведенное хирургическое, радиологическое и стандартное химиотерапевтическое лечение прогрессия опухолевого процесса продолжалась на фоне гипофункции щитовидной железы, лейкопении, явлений интоксикации, нарушений сердечно-сосудистой деятельности и поражения желудочно-кишечного тракта.

Был получен хирургическим путем фрагмент опухоли размером 1 см³. Его поместили в транспортную пробирку, содержащую 50 мл стерильной транспортной среды, траспортировали во льду в оборудованную лабораторию. Через 45 минут после получения опухолевой ткани ее диссоциировали 2% раствором клостридиальной коллагеназы при 37°C и 6% CO₂. Предварительно фрагменты опухолевой ткани очистили от остатков прилежащих тканей при помощи глазных ножниц в чашке Петри с транспортной средой. Для стерилизации фрагментов их пятикратно отмыли на центрифуге стократным объемом транспортной среды. После диссоциации ткани под действием коллагеназы суспензию избавили от недиссоциировавших фрагментов фильтрацией через мелкую стерильную сетку. Фильтрат центрифунгировали и ресуспендировали в среде следующего состава: среда RPMI-1640 - 40%, среда F12 40%, фетальная бычья сыворотка 20%, с добавкой суплемента (Sigma), гентамицина, глютамина. Полученные клетки рассевали, в концентрации 500000 в мл на плоскодонные культуральные флаконы (Nunc) и культивировали до образования монослоя клеток в атмосфере 6% CO₂, при смене среды один раз в два дня. При таких условиях на 10 день сформировался монослой опухолевых клеток, практически лишенный погибших клеток, а также клеток нормальных тканей пациента. После достижения монослоя клетки переводили в суспензию и рассевали на 96-луночные плоскодонные плашки из расчета 10⁴ на лунку. Затем в лунки добавляли онкоантибиотики в различных комбинациях и концентрациях. После инкубации культур в течение ночи при 37°C и 6% CO₂ в лунки плашек внесли витальный краситель, содержащий акридиновый оранжевый. Под люминисцентным микроскопом оценивали процентное соотношение живых и мертвых клеток в каждой лунке. В дальнейшем для терапии использовали сочетание препаратов, вызвавшее максимальный процент гибели опухолевых клеток. Было показано, что клетки опухоли пациентки резистентны к использовавшимся для ее лечения винкристину и доксорубицину. Однако они оказались чувствительными к экстрактам аконита джунгарского и барвинка розового, причем наиболее сильный цитостатический эффект наблюдали при использовании этих препаратов в соотношении 1/1. Терапия комбинированным препаратом экстрактов аконита джунгарского и барвинка розового дали следующие эффекты: прекратилась прогрессия опухоли, нормализовался гормональный статус гормонов щитовидной железы, исчезли симптомы интоксикации, боли в желудке, улучшилось общее самочувствие, нормализовалась работа сердечно-сосудистой системы. Эффект наблюдался в течение 2 лет.