Способ моделирования туберкулезного перитонита

Изобретение относится к области медицины, а именно к экспериментальной фтизиатрии, и может быть использовано для моделирования туберкулезного перитонита у лабораторных животных.

Туберкулез брюшины, по данным различных источников литературы, составляет от 0,7 до 2% всех выявленных случаев туберкулеза и 25-50% абдоминального туберкулеза [1-9], чаще всего страдают лица в возрасте от 20 до 45 лет (то есть основное работоспособное население) с примерно одинаковыми тендерными показателями, причем прослеживается отчетливая корреляция с низким социально-экономическим статусом, неудовлетворительной гигиеной и городской перенаселенностью. Считается, что рост заболеваемости перитонеальным туберкулезом является вторичным по отношению к растущей распространенности иммуносупрессивных состояний, включая ВИЧ - инфекцию и алкогольные заболевания печени, а также увеличению миграционных потоков из эндемичных регионов мира [4, 6, 8]. Отсутствие патогмоничных симптомов, трудная инструментальная диагностика и «коварное» подострое течение туберкулезного перитонита приводят к поздней диагностике и преобладанию тяжелых форм заболевания, что в свою очередь зачастую является причиной инвалидизации или даже смерти пациентов.

Понимание принципов распространения Mycobacterium tuberculosis (М. tuberculosis) в серозных листках могло бы быть достигнуто на животных моделях, максимально близких по своим проявлениям к клиническому течению заболевания. Однако имеющиеся с описанием воспроизведения туберкулезного перитонита на лабораторных животных, относящихся к XIX и первой половине XX веков [9-11], не приемлемы к использованию в современных условиях, поскольку авторы применяли для интраперитонеального инфицирования чаще всего мокроту больных легочным туберкулезом с неизвестным качественным и количественным составом микроорганизмов, что приводило к летальности животных в первые дни после заражения.

Задачей предлагаемого изобретения является разработка способа моделирования туберкулезного перитонита, который обеспечивает высокую воспроизводимость модели и ее максимальную приближенность к клиническому течению заболевания.

Поставленная задача решается тем, что лабораторным животным (кроликам) в краевую ушную вену вводят иммунодепрессант инфликсимаб в дозе 16 мг/кг, затем через сутки в брюшную полость инокулируют суспензию, содержащую взвесь стандартизированного штамма М. tuberculosis H37Rv в концентрации 10⁶ микробных клеток, в 0,5 мл физиологического раствора.

Предлагаемый способ позволяет создать модель туберкулезного перитонита с его характерными клинико-морфологическими признаками: развитие специфического воспаления брюшины (бугорковых образований на брюшине) и спаечного процесса в брюшной полости, а также сопоставимыми результатами клинического течения и сроков развития заболевания.

В организме модельного животного с помощью фармакопейного препарата инфликсимаба (ЗАО "БИОКАД" Россия) ингибируют функциональную активность ФНО-альфа (фактора некроза опухоли-альфа) - высокоэффективного провоспалительного цитокина с широким спектром активности как в воспалительных, так и в иммунных реакциях, необходимых для устойчивости к инфекции М. tuberculosis и другим микобактериям. Способ моделирования туберкулезного перитонита доступен к воспроизводству за счет обеспечения благоприятных условий для жизнедеятельности микобактерий туберкулеза на фоне иммуносупрессии, а также выбора зоны инокуляции с оптимальным кровоснабжением (илеоцекальная область), и открывает возможности для изучения патогенетических, диагностических, лечебных и прогностических аспектов заболевания.

Сущность изобретения поясняется чертежами.

Фиг. 1 - гиперергическая реакция (эритема) в ответ на внутрикожное введение препарата Диаскинтест® через 1 месяц после инокуляции взвеси М. tuberculosis H37Rv (в дозе 106 микробных клеток в 0,5 мл физиологического раствора). А - интактный, Б - подопытный кролик №6.

Фиг. 2 - изменение уровня общего белка и активности аденозиндезаминазы в сыворотке крови кроликов исходно и через 7 недель после инфицирования стандартизированным штаммом М. tuberculosis H37Rv (в дозе 106 микробных клеток в 0,5 мл физиологического раствора).

Фиг. 3 - брюшная полость кролика через 7 недель после интраперитонеальной инокуляции суспензии стандартизированного штамма Mycobacterium tuberculosis H37Rv (в дозе 106 микробных клеток в 0,5 мл физиологического раствора). Множественные бугорки-диссеминаты на серозной оболочке толстой кишки, брыжейки тонкой кишки и большом сальнике (до 4 мм).

Фиг. 4 - картина специфического воспалительного процесса в брюшной полости через 7 недель после интраперитонеального инфицирования кролика взвесью стандартизированного штамма М. tuberculosis H37Rv (в дозе 106 микробных клеток в 0,5 мл физиологического раствора). Множественные бугорки-диссеминаты (продуктивная форма туберкулезного перитонита) на париетальной брюшине (до 4-5 мм), плоскостные спайки и штранги как результат организации экссудата.

Фиг. 5 - микропрепарат тканей брюшины кролика: формирующаяся макрофагальная гранулема в брюшине. Окраска гематоксилином и эозином. В - Х100; Г - Х400.

Фиг. 6 - микропрепарат тканей брюшины кролика: туберкулезный казеозный перитонит. Единичные мелкие макрофагальные гранулемы (обведены круглыми рамками). Брюшина указана стрелкой. Окраска гематоксилином и эозином. XI00.

Фиг. 7 - микропрепарат тканей брюшины кролика: в брюшине казеозно-некротический очажок с перифокальной макрофагальной реакцией; лейкоцитарная инфильтрация в некротических массах (туберкулезный перитонит в фазе прогрессирования). Окраска гематоксилином и эозином. Х100.

Фиг. 8 - микропрепарат тканей брюшины кролика: скопления кислотоустойчивых микобактерий. Окраска по методу Циля-Нельсена. X 400

При разработке способа использовались кролики породы «Шиншилла», выведенные в Федеральном государственном унитарном предприятии «Питомник лабораторных животных «Рапполово» НИЦ «Курчатовский институт», которые до начала исследования содержались в условиях сертифицированного вивария федерального государственного бюджетного учреждения «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт фтизиопульмонологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Способ осуществляется следующим образом.

После успешного прохождения животными карантинного периода (14 дней), подтвержденное отсутствием внешних признаков патологии, изменений в общеповеденческих реакциях, а также отклонений от нормы в лабораторных анализах крови и мочи, производилось моделирование туберкулезного перитонита.

Модельным животным за одни сутки до инфицирования в краевую ушную вену медленно вводили раствор инфликсимаба (в дозе 16 мг/кг) в объеме 10 мл, приготовленного ex tempore на физиологическом растворе.

Моделирование туберкулезного перитонита проводилось в условиях операционной. Кроликов фиксировали на специальном станке в положении на спине, краниальным концом максимально вниз для смещения внутренних органов и максимальной безопасности повреждения их иглой. Шерсть на передней брюшной стене удаляли, кожные покровы обрабатывали дважды 5% раствором йода.

Культивирование стандартизованного вирулентного тест-штамма М. tuberculosis H37Rv (из коллекции федерального государственного бюджетного учреждения «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Министерства здравоохранения Российской Федерации) проводили на среде Левенштейна-Иенсена (“Becton, Dickinson and Company”, США). Подготовку микобактериальной суспензии 3-х недельного (вторая генерация) стандартизованного вирулентного тест-штамма M. tuberculosis H37Rv осуществляли ex tempore в день заражения животных. Заражающая доза составляла 106 клеток микобактерий в 0,5 мл физиологического раствора. Микобактериальную суспензию вводили внутрибрюшинно.

Методы обследования лабораторных животных:

- постановка пробы с аллергеном туберкулезным рекомбинантным (АТР). АТР вводили кроликам внутрикожно на спине в концентрации 2 мкг/мл в 0,1 мл физиологического раствора;

- в сыворотке крови (исходно и через 7 недель после инфицирования): исследовали концентрацию общего белка и альбумина реактивами «Beckman Coulter» на биохимическом анализаторе «Synchron СХ5 PRO» («Beckman Coulter», США), активность аденозиндезаминазы (экто-АДА-1 и экто-АДА-2) методом G. Giusti (1974) на спектрофотометре PV1251C (Беларусь). Принцип метода заключается в том, что аммиак, высвобождаемый при трансформации (дезаминировании) аденозина в инозин, образует со щелочным раствором гипохлорита натрия и фенолом голубой индофенол, концентрация которого полностью пропорциональна концентрации аммиака и отражает активность АДА;

- патоморфологическое исследование включало в себя некропсию, макроскопическое исследование на наличие выпота в серозных полостях, бугорковых образований на серозных покровах печени, селезенки, кишечника, легких, а также форму и величину внутригрудных и внутрибрюшных лимфатических узлов, размеры и структуру почек. Выполняли многоцентровую биопсию брюшины и забирали материал для гистологического исследования париетальной брюшины, печени, почек, селезенки, легких, сердца и лимфатических узлов. Помимо стандартного гистологического исследования с окраской гематоксилином и эозином, применялись специализированные методы окрашивания по Ван Гизону (для идентификации коллагеновых волокон), по Перлсу (качественная реакция на трехвалентное железо), по Цилю-Нельсену для обнаружения кислотоустойчивых микобактерий (КУМ) в препарате;

- проводили молекулярно-генетическое тестирование тканей брюшины и сальника методом ПЦР для детекции ДНК МВТ;

- статистическая обработка данных осуществляли с использованием пакета прикладных программ Statistica 7.0 (StatSoftlnc, USA). В случае отклонения от нормального распределения (критерий Шапиро-Уилка) рассчитывали медиану (Me), первый и третий квартили (Q1-Q3). Оценивали достоверность различий метрических величин (критерий Вилкоксона), их корреляционную зависимость между собой (критерий Спирмена) и с количественными признаками (критерий Крускала-Уоллеса).

Через 30 дней после инфицирования осуществляли постановку внутрикожной пробы с аллергеном туберкулезным рекомбинантным (АТР). Показано, что через 72 часа в ответ на введение аллергена в области спины у инфицированного кролика регистрировали появление эритемы размером 19,8±1,4 мм, что свидетельствует о наличии сенсибилизации и подтверждает развитие туберкулезного процесса (Фиг. 1).

Через 7 недель после инфицирования в сыворотке крови животного по сравнению с исходными показателями значимо повысилась концентрация общего белка (ОБ) и альбумина, а также активность экто-АДА-2 (Фиг. 2). Выявленные корреляции подтверждают, что повышение ОБ - абсолютное, и рост ОБ и активности общей АДА и экто-АДА-2 иллюстрируют развитие специфического воспаления - туберкулезного перитонита.

Эвтаназия животного выполнена через 7 недель после инфицирования путем введения в латеральную вену уха раствора тиопентала натрия (250 мг) и пипекурония бромида (1 мг) в дозах в 5 раз, превышающих терапевтическую.

При некропсии регистрировали незначительное количество серозного выпота в брюшной полости до 2 мл без запаха, умеренно выраженный спаечный процесс в брюшной полости в виде плоскостных межкишечных сращений и фиксационных штрангов с париетальной брюшиной, эктопии и спаянию сальника, а также наличия множественных туберкулезных бугорков-диссеминатов от 2 до 7 мм на париетальной и висцеральной брюшине (Фиг. 3, 4, 5). При ПЦР исследовании тканей сальника обнаруживали ДНК МВТ. При гистологическом исследовании микропрепаратов тканей брюшины регистрировали значимое увеличение толщины брюшины с формированием эпителиоидно - гигантоклеточных гранулем с очаговым казеозным некрозом (Фиг. 5). Кроме того, в гранулемах обнаруживались гигантские многоядерные клетки Лангханса, примесь лимфоцитов и плазматических клеток (Фиг. 6). При окраске наиболее пораженных участков брюшины по методу Циля-Нельсена выявлены скопления кислотоустойчивых микобактерий (Фиг. 7).

Положительный результат кожного теста АТР и ПЦР на наличие ДНК МБТ, признаки специфического поражения брюшины в виде многочисленных бугорков-диссеминатов на париетальной и висцеральной брюшине, неровности и изъеденности серозных покровов брюшной полости, организация экссудата с адгезивным процессом, выявленные гистологические признаки туберкулезного перитонита являются доказательством развития туберкулезного воспаления в тканях брюшной полости экспериментального животного.

Способ применен на 14 половозрелых кроликах- самцах (4 из которых интактные). Время наблюдения составило 7 недель. Результаты проведенных опытов свидетельствуют, что инокуляция кроликам в брюшную полость суспензии вирулентного стандартизированного штамма М. tuberculosis H37Rv (в концентрации 10⁶ КОЕ в 0,5 мл физиологического раствора) после предварительного подавления функциональной активности ФНО-альфа (инфликсимабом) приводит к развитию структурно-функциональных изменений, характерных для туберкулезного перитонита. Воспроизводимость модели составляет 100%.

Таким образом, предложенный способ позволяет получить модель локального туберкулезного поражения брюшины, позволяющую изучать развитие специфического воспалительного процесса в брюшной полости, обеспечивает полное морфологическое повторение эквивалентное процессу у человека. Модель может быть использована для изучения патофизиологических механизмов развития туберкулезного перитонита и разработки патогенетически обоснованной терапии.

Список литературы

1. Ahmed Khan F.Y. Peritoneal tuberculosis: Advances and controversies. Libyan Journal of Medical Sciences. 2018; 2:3-7.

2. Aslan B., Tiiney D., Abdulaziz Z., Ercetin Y., Erbarut I. Tuberculous peritonitis mimicking carcinomatosis peritonei: CT findings and histopathologic correlation. Radiology Case Reports. 2019; 14(12): 1491-1494.

3. Идрисов A.C. Вопросы изучения туберкулезного перитонита. Дис.… канд. мед. наук. - Алма-Ата, 1953. - 111 с.

4. Волков А.А., Дудниченко Д.С. Трудности в диагностике абдоминального туберкулеза // Известия высших учебных заведений. Северо-Кавказский регион. Естественные науки. 2006. (S24), 112-113.

5. Арямкина О.Л., Савоненкова Л.Н. Абдоминальный туберкулез Гастроэнтерология Санкт-Петербурга. - 2008; 1:41-43.

6. Чикаев В.Ф., Бондарев Ю.В., Зиятдинов К.М., Петухов Д.М. Особенности диагностики и лечения туберкулезного перитонита. Практическая медицина. 2014; 2(80):156-159.

7. Wu D.C., Averbukh L.D., Wu G.Y. Diagnostic and therapeutic strategies for peritoneal tuberculosis: A review. Journal of Clinical and Translational Hepatology. 2019;7(2):140-148.

8. Schluger N.W. The pathogenesis of tuberculosis: the first one hundred (and twenty-three) years. Am. J. Respi. CellMol. Biol. 2005, 32, 251-256.

9. Кишенский Д.Н. Влияние чревосечения на туберкулез брюшины. Экспериментальное исследование. Дис.… д-ра медицины. М.: Товарищество типографии А.И. Мамонтова. 1894. 82 с.

10. Lurie М.В. The fate of tubercle bacilli in the organs of reinfected rabbits. J Exp Med. 1929;50(6):747-765. doi:10.1084/jem.50.6.747.

11. Omachi K. Experimental Tuberculous Infection in Mice. The Tohoku Journal of Experimental Medicine. 1953. 57. 4. P. 317-326.