Результат интеллектуальной деятельности: КЛЕТОЧНАЯ ЛИНИЯ МЕЛАНОМЫ КОЖИ ЧЕЛОВЕКА mel-Alx-LP

Изобретение относится к области медицины, биотехнологии, а именно к получению клеточной линии. Полученная клеточная линия может быть использована как модельная система для изучения процессов канцерогенеза и метастазирования in vitro, поиска новых потенциальных мишеней в терапии меланомы кожи, а также тестирования противоопухолевых препаратов и новых терапевтических подходов. Клеточная линия mel-Alx-LP обладает стабильными культуральными, морфологическими и молекулярными характеристиками.

Клеточная линия также может быть использована в качестве положительного контроля при проведении иммуногистохимического и иммуноцитохимического анализов при выявлении маркеров меланомы кожи, поскольку характеризуется стабильной экспрессией меланоцитарных маркеров: SOX10, MITF.

Меланома кожи составляет ~5% всех случаев рака кожи, на нее приходится >75% смертей от рака кожи [1]. 5-летняя относительная выживаемость пациентов с локализованным или региональным заболеванием составляет 98% и 64%, соответственно. Напротив, у пациентов с метастатической меланомой 5-летняя выживаемость снижается до 23%.

Метастатическая меланома исторически считалась не поддающимся лечению заболеванием, пока в 2011 и 2014 годах FDA не одобрило терапевтические стратегии на основе таргетной терапии и иммунотерапии.

Для пациентов с BRAF^V600E/K mutant меланомой значительная эффективность наблюдалась при комбинации ингибитора BRAF и ингибитора МЕК, с частотой ответа ~76% [2]. При этом >80% пациентов в дальнейшем рецидивируют на коктейле BRAF/MEK-ингибиторов, оставляя их пригодными только для анти-PD-1 и анти-СТLА4 иммунотерапии [3].

Активность комбинированной терапии ингибиторами контрольных точек с использованием анти-PD-l и анти-СТLА-4 антител продемонстрировала длительный ответ, что представляет собой терапевтическую стратегию, подходящую для всех генотипов. Однако 60-70% пациентов с меланомой не отвечают на терапию ингибиторами контрольных точек из-за токсичности, внутренней резистентности и других не до конца понятных причин. При этом сохраняющиеся клетки меланомы, которые не отвечают на текущие стандартные стратегии лечения представляют собой проблему, которую пытаются преодолеть исследователи и клиницисты [4].

Лечение метастатической меланомы является сложной задачей. Хотя таргетная и иммунная терапия позволили увеличить выживаемость у пациентов, в большинстве случаев опухолевые клетки вырабатывают резистентность к терапии. Динамические взаимодействия клеток меланомы с другими клеточными и ацеллюлярными компонентами микроокружения опухоли обеспечивают дополнительные механизмы гомеостатической регуляции, критически важные для эффективности терапии [5]. Несмотря на последние технологические достижения в изучении меланомы кожи до сих пор остается вопросом, какую роль играет микроокружение в резистентности меланомы к проводимой терапии.

Для разработки новых стратегий терапии меланомы кожи, способных преодолеть нынешнее клиническое плато, наблюдаемое при лечении пациентов с помощью таргетных и иммунных терапевтических стратегий, необходимо, чтобы модельные системы меланом были максимально приближены к естественной опухолевой системе, воспроизводя многообразные сложные механизмы резистентности in vivo у пациентов.

С помощью традиционных клеточных культур возможно исследовать фенотипический портрет опухоли, цитотоксичность, пролиферацию, подвижность, инвазивность, адаптацию к гипоксическим условиям, приводящие к ее устойчивости и диссеминации, изучить чувствительность к лекарственным препаратам, экспрессию белков и пластичность молекулярных путей, геномные и генетические характеристики (секвенирование РНК, секвенирование целого экзома).

В общей сложности в мире насчитывается >2000 клеточных линий меланомы. Проведенные для большинства этих клеточных линий в ходе систематических скринингов генетические и молекулярные тесты, а также высокопроизводительных скринингов лекарственных препаратов, позволили получить исчерпывающую информацию об основных генах и молекулярных путях, ответственных за прогрессирование меланомы и ее резистентность к терапии. А создание трехмерных моделей из двухмерных культур с введением культур клеток стромы позволяет усложнить взаимодействия опухолевых клеток и микроокружения, что значительно приближает такую модель к естественным условиям.

Поэтому важной и актуальной задачей на сегодняшний день является расширение арсенала охарактеризованных клеточных линий с целью применения их в качестве модельных систем для исследования процессов канцерогенеза, тестирования противоопухолевых препаратов и апробации новых терапевтических подходов в лечении злокачественных новообразований, а также для поиска новых потенциальных мишеней.

Наиболее близкой к заявляемой клеточной линии - прототипом, является линия NCI-H838 [Н838] Lung Adenocarcinoma Human из коллекции АТСС с коллекционным номером CRL-5844 (https://www.atcc.org/products/crl-5844). По данным проведенного STR-анализа с исследованием маркеров, присутствующих в базе АТСС, процент совпадения составляет 82%. Клеточная линия NCI-H838 была получена из метастазов аденокарциномы легкого в лимфатический узел. Культура характеризуется эпителиальной морфологией и адгезионным типом роста.

Техническим результатом изобретения является расширение арсенала клеточных линий, обладающих метастатическим потенциалом и туморогенностью, которые могут быть использованы для тестирования активности новых противоопухолевых препаратов, а также для поиска новых потенциальных мишеней в терапии меланомы кожи и разработки новых терапевтических подходов в лечении злокачественных новообразований. Клеточная линия также может быть использована в качестве положительного контроля при проведении иммуногистохимического

и иммуноцитохимического анализов при выявлении маркеров меланомы кожи, поскольку характеризуется стабильной экспрессией меланоцитарных маркеров: SOX10, MITF.

Указанный технический результат изобретения достигается новой клеточной линией меланомы кожи человека mel-Alx-LP, сохраняющей ключевые характеристики опухолевого образца: экспрессия маркеров меланомы кожи, способность к инвазии и миграции, высокий пролиферативный потенциал, из которого культура была получена, хранится в специализированной коллекции культур клеток ЦКП "Коллекция культур клеток позвоночных" Института Цитологии РАН под номером РККК(П) 812Д.

Получение клеточной линии mel-Alx-LP было осуществлено следующим путем:

Клеточная линия mel-Alx-LP была выделена из метастаза злокачественной меланомы кожи человека в паховом лимфоузле. Образец характеризовался высокой митотической активностью (21 митозов на 1 кв.мм опухоли).

Интраоперационно полученные фрагменты опухолевой ткани помещали в стерильную пробирку, содержащую полную питательную среду (DMEM/F-12, 10% FBS, пенициллин 25000 Ед/500 мл среды + стрептомицин 25 мг/500 мл среды), и транспортировали в лабораторию. Образцы переносили в ламинар и измельчали на стерильной чашке Петри стерильным скальпелем с добавлением 5-7 мл DMEM/F-12 на кусочки размером не более 2 мм³. Далее кусочки опухоли помещали в стерильный медикон (Medicon, Sterile, BD™) и подвергали механической дезагрегации внутри медимашины (Medimachine, BD™) в течение 1 мин. Полученную клеточную суспензию пропускают через стерильные фильтры диаметром 50-70 мкм с помощью стерильного шприца 1 см³. Центрифугировали полученную фильтрованную клеточную взвесь при 1000 об/мин в течение 5 мин, аккуратно убирали супернатант и высаживали во флакон объемом 25 см² с добавлением 5 мл питательной среды DMEM/F-12, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS), антибиотики (пенициллин со стрептомицином в концентрации: 100 ед/мл и 100 мкг/мл соответственно). Клетки инкубировали при 37°С, 5% СО₂, 100% влажности.

Стабильно пролиферирующая культура была получена на 10 пассаже.

Условия культивирования клеточной линии mel-Alx-LP представлены следующим образом.

Тип роста - адгезионный.

Во флаконы объемом 25 см² в 5 мл среды засевают 1×10⁶ клеток.

Клетки культивируют в питательной среде DMEM/F-12, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS), антибиотики (пенициллин со стрептомицином в концентрации: 100 ед/мл и 100 мкг/мл соответственно) в культуральном флаконе объемом 25 см² и инкубируют при 37°С, 5% СО₂, 100% влажности.

Пересев 1 раз в 3-4 дня в соотношении 1:1 с использованием равных объемов 0,25% раствора Трипсина и 0,02% раствора Версена.

Жизнеспособность клеток оценивают по включению трипанового синего с помощью автоматических счетчиков или камеры Горяева. Жизнеспособность клеток после пересева составляет от 90-99%.

Морфологические признаки клеточной линии mel-Alx-LP характеризуются следующим образом:

Клетки представлены преимущественно эпителиоидно-клеточной морфологией (75%) и веретеновидно-клеточными чертами (25%). Ядра крупные, округлые. Единичные клетки двуядерные и многоядерные.

Мультиплексный анализ 19-ти STR-маркеров и локуса амелогенина человека представлен в табл.

Проведен анализ выявленного генотипа по референсной базе АТСС.

Результаты поиска по референсной базе: Максимальная степень совпадения генотипа установлена для клеточной линии - NCI-H838Lung AdenocarcinomaHuman (82%). Согласно рекомендациям АТСС: идентичными могут считаться клеточные линии, демонстрирующие 100% совпадение по исследованным маркерам присутствующим в базе АТСС. Клеточные линии, демонстрирующие не менее чем 80% совпадение генотипов по исследованным маркерам присутствующим в базе АТСС, могут считаться родственными (произошедшими от общей линии-предшественника). Клеточные линии, демонстрирующие менее чем 80% совпадение генотипов по исследованным маркерам присутствующим в базе АТСС, не могут достоверно считаться родственными линиями на основании полученных данных (Capes-Davis et al., Match criteria for human cell line authentication: Where do we draw the line? Int. J. Cancer. 2012 Nov 8. doi:0.1002/ijc.27931).

Маркерные признаки клеточной линии mel-Alx-LP:

SOX10 - 40-45% экспрессируют клетки эпителиоидно-клеточной морфологии, 5% - веретеновидной морфологии клетки, оставшиеся клетки утратили экспрессию этого маркера. MITF - 40-45%, из которых 20% окрашиваются наиболее ярко.

Маркер пролиферации Ki-67 выявлен в 92% клеток.

Условия криоконсервации клеточной линии mel-Alx-LP следующие:

Криосреда: эмбриональная телячья сыворотка 90%, DMSO 10%.

Объем клеток на криопробирку: 1,5-3×10⁶ клеток/мл.

Клетки ресуспендируют в криосреде до образования гомогенной суспензии, переносят в криопробирки. Криопробирки помещают в контейнер-холодильник для поддержания постоянной скорости охлаждения 1°С/мин., контейнер помещают в холодильник на -80°С на 24 часа. Для длительного хранения пробирки переносят в криобанк на -196°С.

Размораживание линии проводят при 37°С.

Клетки разводят в 10 мл бессывороточной среды и осаждают центрифугированием, ресуспендируют в 5 мл той же среды, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, антибиотики (пенициллин со стрептомицином в концентрации: 100 ед/мл и 100 мкг/мл соответственно), переносят в культуральный флакон объемом 25 см² и инкубируют при 37°С, 5% СO₂, 100% влажности.

Жизнеспособность клеток оценивают по включению трипанового синего с помощью автоматических счетчиков или камеры Горяева. Жизнеспособность клеток после криоконсервации 85-99%.

Контаминация клеточной линии меланомы кожи mel-Alx-LP была исследована следующим образом.

Методом ПЦР были произведены исследования на наличие микоплазмы - микоплазма не была обнаружена. При длительном культивировании в среде контаминация бактериями и грибами не была обнаружена.

Использование клеточной линии меланомы кожи mel-Alx-LP представлено следующими примерами.

Пример 1. Использование клеточной линии меланомы кожи mel-Alx-LP в качестве положительного контроля для фактора транскрипции SOX10 (SRY-Box Transcription Factor 10)

Клетки культивируют в питательной среде DMEM/F-12, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS), антибиотики (пенициллин со стрептомицином в концентрации: 100 ед/мл и 100 мкг/мл соответственно) в культуральном флаконе объемом 25 см² и инкубируют при 37°С, 5% СО₂, 100% влажности. Через 3-е суток осуществляют пересев клеток в соотношении 1:1 с использованием равных объемов 0,25% раствора Трипсина и 0,02% раствора Версена.

При достижении конфлюэнтного монослоя, супернатант удаляют, добавляют 1 мл раствора: 0,25% раствора Трипсина и 0,02% раствора Версена (в соотношении 1:1) и помещают в СO₂-инкубатор при 37°С, 5% СО₂, 100% влажности на 2 минуты. По истечении указанного времени флакон достают из инкубатора, с помощью автоматического дозатора на 1 мл снимают клетки со дна флакона, помещают в стерильную пробирку (15 мл) с добавлением DMEM/F-12, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) и центрифугируют 5 минут при 1000 об/мин.

По окончании центрифугирования супернатант удаляют, а клетки отмывают в однократном растворе фосфатного буфера (PBS).

Далее готовят клеточные блоки на основе 2% агара и обрабатывают блок так же как биопсийный материал: фиксация в 10% забуференном формалине (до 12 ч), проводка, заливка в парафин и микротомия. Контрольный срез с клеточной линией монтируют на одно стекло с исследуемым образцом.

Для иммуногистохимического исследования производят депарафинизацию, регидратацию, демаскировку и обработку перекисью полученных срезов.

Первичные моноклональные антитела против SOX10 (ЕР268, Rabbit Monoclonal Antibody, Cell Marque) инкубируют в течении 30 минут при 25°С. После инкубации промывали TBS-буфером трижды. В качестве системы визуализации используют систему EnVision FLEX, High рН (Link) (Agilent), инкубацию со вторичными антителами производят в течении 30 минут при 25°С. После инкубации промывали TBS-буфером и производят визуализацию диаминобензидином при комнатной температуре 10 мин. Промывают TBS-буфером и осуществляли докраску ядер клеток гематоксилином Майера. Образцы обезвоживают серией погружений в изопропиловый спирт, ксилол и заключают.

В результате с помощью светового микроскопа наблюдают экспрессию SOX10 клеточной линией mel-Alx-LP в виде ядерного окрашивания.

Пример 2. Использование клеточной линии меланомы кожи mel-Alx-LP в качестве модельной системы для оценки цитотоксического эффекта противоопухолевых препаратов.

Клеточные линии высаживают в плоскодонные 96-луночные планшеты и помещают в СО₂-инкубатор (+37°С, 5-6.5% СО₂) на 3 суток. Весь планшет делят на следующие группы: контрольная группа - 3 лунки; экспериментальные группы: добавление исследуемого противоопухолевого препарата в различных концентрациях - 3 лунки.

Через 3 суток в среду добавляют исследуемый противоопухолевый препарат.Время инкубации в условиях СО₂-инкубатора (+37°С, 5-6.5% СО₂) составляет определяют заранее. По окончании культивирования с препаратом получают изображения монослойных культур с помощью с помощью фазового контрастного микроскопа Zeiss Primo Vert (4×0,10) (Zeiss, Germany).

Затем в лунки, где культивировались монослойные клеточные линии, вносят по 10 μl МТТ (Roche, Basel, Switzerland) в конечной концентрации 0.5 мг/мл и инкубируют в течении 4 часов в условиях СО₂-инкубатора (+37°С, 5-6.5% СO₂).

Через 4 часа удаляют супернатант и добавляли 100 μ1 DMSO на 1 ч. Оптическую плотность (ОП) полученных растворов измеряют на спектрофотометре для микропланшетов iMark (Bio-Rad Laboratories, США) на длине волны 595 nm. Для перевода единиц оптической плотности в проценты жизнеспособности используют формулу: (ОП исследуемого образца - ОП контрольной группы)* 100%.

В результате получают кривую зависимости дозы-эффекта, характеризующей изменение влияния противоопухолевого препарата в зависимости от концентрации на клеточную линию.

Новая клеточная линия меланомы кожи человека mel-Alx-LP позволяет расширить арсенал клеточных линий, обладающих метастатическим потенциалом и туморогенностью, которые могут быть использованы для тестирования активности новых противоопухолевых препаратов, а также для поиска новых потенциальных мишеней в терапии меланомы кожи и разработки новых терапевтических подходов в лечении злокачественных новообразований. Клеточная линия также может быть использована в качестве положительного контроля при проведении иммуногистохимического и иммуноцитохимического анализов при выявлении маркеров меланомы кожи, поскольку характеризуется стабильной экспрессией меланоцитарных маркеров: SOX10, MITF.

Источники информации:

1. Matthews NH, Li WQ, Qureshi AA, et al. Epidemiology of Melanoma. In: Ward WH, Farma JM, editors. Cutaneous Melanoma: Etiology and Therapy. Brisbane (AU): Codon Publications; 2017 Dec 21. Chapter 1. doi: 10.15586/codon.cutaneousmelanoma.2017.chl.

2 Dummer, R. et al. Overall survival in patients with BRAF-mutant melanoma receiving encorafenib plus binimetinib versus vemurafenib or encorafenib(COLUMBUS): a multicentre, open-label, randomised, phase 3 trial. Lancet Oncol. 19, 1315-1327 (2018).

3. Schreuer, M. et al. Combination of dabrafenib plus trametinib for BRAF andMEK inhibitor pretreated patients with advanced BRAF(V600)-mutantmelanoma: an open-label, single arm, dual-centre, phase 2 clinical trial. Lancet Oncol. 18, 464-472 (2017).

4. Rogiers, A. et al. Long-term survival, quality of life, and psychosocial outcomes in advanced melanoma patients treated with immune checkpoint inhibitors. J. Oncol.2019, 5269062 (2019).

5. Falcone I, Conciatori F, Bazzichetto C, Ferretti G, Cognetti F, Ciuffreda L, Milella M. Tumor Microenvironment: Implications in Melanoma Resistance to Targeted Therapy and Immunotherapy. Cancers (Basel). 2020 Oct 6;12(10):2870. doi: 10.3390/cancersl2102870.