Результат интеллектуальной деятельности: Способ генетической дифференциации штаммов Yersinia pseudotuberculosis путем молекулярно-генетического типирования

Предполагаемое изобретение относится к области медицинской микробиологии, а именно молекулярной диагностики и генетической инженерии и может быть использовано в лабораторных исследованиях вновь выявленных штаммов Yersinia pseudotuberculosis и при характеристики штаммов, находящихся в коллекциях культур учреждений, занимающихся их изучением.

Возбудитель псевдотуберкулеза является одним из трех видов рода Yersinia, способных вызвать тяжелые инфекционные заболевания человека. Заболеваемость псевдотуберкулезом регистрируется в большинстве субъектов РФ, при этом нозоареал болезни отличает наличие регионов на Дальнем Востоке, в Сибири, на Урале и Северо-Западе страны, характеризующихся наиболее высоким уровнем заболеваемости. Эпидемический процесс псевдотуберкулеза проявляется в виде спорадических случаев и групповых заболеваний. Групповые заболевания возникают, главным образом, в организованных коллективах - детских дошкольных, загородных, оздоровительных учреждениях, школах, интернатах, воинских частях, на предприятиях или в учебных заведениях, объединенных единым источником питания. Изучение штаммов Y. pseudotuberculosis, выделенных во время вспышек или при спорадических случаях псевдотуберкулеза является важной задачей эпидемиологического расследования и предупреждения возникновения новых заболеваний. Углубленная характеристика штаммов Y. pseudotuberculosis предполагает необходимость проведения их генотипирования. В настоящее время существует большое количество способов генотипирования штаммов Y. pseudotuberculosis. Однако в большинстве случаев методы сложны, требуют специального оборудования и высококвалифицированного персонала.

Известен способ генотипирования штаммов Y. pseudotuberculosis с помощью VNTR типирования (1), который основан на получении в ПЦР генотипической характеристики штаммов при использовании праймеров, выявляющих локусы, включающие вариабельные тандемные повторы, при этом совокупность полученных результатов о длине различных VNTR локусов в различных штаммах и является одной из генетических особенностей штамма.

Однако, способ прост в исполнении, но в ряде случаев, требует учета результатов с определением точной длины амплифицированных продуктов продуктов ПЦР. Определить разницу в длине амплифицированных фрагментов у различных штаммов, без использования специальных дорогостоящих методик, проводимых длительное время, не всегда удается.

За прототип выбран способ мультлокусного сиквенирования-типирования (MLST) [2], включающий генотипирование штаммов возбудителя псевдотуберкулеза при сравнении последовательностей 7 «housekeeping» генов (glnA, thrA, tmk, trpE, adk, argA, aroA).

Недостатком этого способа является сложность его исполнения, так как требует для прочтения нуклеотидной последовательности генов их секвенирование, что доступно только хорошо оснащенным диагностическим лабораториям с высококвалифицированным персоналом, является дорогим в экономическом плане видом анализа и занимает длительное время. Секвенирование проводят с помощью дорогостоящих импортных приборов и реактивов к ним.

Технической задачей настоящего изобретения является разработка нового способа генотипирования позволяющего достоверно, быстро и с невысокой себестоимостью осуществлять дифференциацию штаммов Y. pseudotuberculosis, выделенных в различных регионах, областях и странах.

Поставленная задача достигается тем, что в способе генетической дифференциации штаммов Y. pseudotuberculosis путем молекулярно-генетического типирования, включающем выделение ДНК из исследуемого штамма Y. pseudotuberculosis, постановку ПЦР со специфическими праймерами и учет реакции с помощью электрофореза, в ДНК исследуемого штамма Y. pseudotuberculosis выявляют семь INDEL-маркеров (локусов) ps397, ps866, ps1105, ps1452, ps1509, ps1969, ps1779, имеющих два или три альтернативных аллеля:

с праймерами к гену YPK_0397

Forward: GGGGCCACAAAAAGAGAGTT

Reverse: GTTTTCACGCAGGAACCACT

с длиной фрагмента амплификации 97 п. о. или 79 п. о.;

с праймерами к гену YPK_0866

Forward: CACCGCCAGTGTGTGTCTAA

Reverse: TAACTCGGGCGACTGACAAC

с длиной фрагмента амплификации 148 п. о., 124 п. о. или 0;

с праймерами к гену YPK_1105

Forward: CCGAACAGCATGCACAGA

Reverse: AACCCTCTCGGGTGCTATTT

с длиной фрагмента амплификации 81 п. о. или 72 п. о.;

с праймерами к гену YPK_1452

Forward: GCGAGGAAAATCTGATTGTGA

Reverse: CAGCGGCTACAATAGGGTGT

с длиной фрагмента амплификации 103 п. о. или 88 п. о.;

с праймерами к гену YPK_1509

Forward: TGGCCGTGGCTTTTATTTAT

Reverse: GCCGGAGAATTCCCATTTT

с длиной фрагмента амплификации 90 п. о. или 72 п. о.;

с праймерами к гену YPK_1969

Forward: CTCCGATATTGATCCATTCCT

Reverse: GGTATCAATCGCCATTTCCA

с длиной фрагмента амплификации 92 п. о., 70 п. о. или 0;

с праймерами к гену YPK_1779

Forward: TGGATTGATGGCGGTATTCT

Reverse: CTGTAAAGGGGGTATTGTTTCA

с длиной фрагмента амплификации 92 п. о. или 71 п. о.

при этом учет результатов реакции проводят визуально после электрофореза в 2% агарозном геле в присутствии маркеров молекулярных масс ДНК и для каждого штамма устанавливают уникальный INDEL-генотип по семи INDEL -маркерам, а путем сравнения обнаруженных семи INDEL-генотипов между собой и с известными генотипами идентификационной таблицы устанавливают общее или различное происхождение исследуемых штаммов Yersinia pseudotuberculosis.

При этом ПЦР проводят в объеме 25 мкл и реакционная смесь содержит:

10 мкл 2,5 кратного буфера,

1,0 мМ MgCl₂,

0,25 mM смеси dNTP,

0,5 ед Tag DNA полимеразы,

25 нг исследуемой ДНК в объеме 5 мкл.

Кроме того ПЦР проводят с соблюдением следующих этапов и режимов:

1) 95°С этап денатурации - 3 мин (1цикл),

2) 95°С этап денатурации - 15 сек,

3) 60°С этап отжига праймеров - 15 сек,

4) 72°C этап элонгации - 15 сек,

5) Повтор 2, 3 и 4 этапов (40 циклов),

6) 72°С этап элонгации - 3 мин.

Обоснование выбора праймеров.

При анализе полногеномных последовательностей 30 штаммов Y. pseudotuberculosis, депонированных в базах данных GenBank, с использованием авторских компьютерных программ, разработанных в ФКУЗ Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора «GeneExpert» и ContigSearcher» обнаружены мутации, связанные с возникновением инсерций, или делеций (INDEL-мутации) в определенных локусах. Среди всех обнаруженных мутаций были отобраны семь, которые позволяли дифференцировать штаммы возбудителя псевдотуберкулеза по различным генетическим группам (INDEL-типам). Эти семь локусов содержали специфические последовательности, обозначенные как INDEL-маркеры. С помощью компьютерных программ Primer М и BLAST NCBI к варьирующим участкам указанных локусов ps397, ps866, ps1105, ps1452, ps1509, ps1969, ps1779 были сконструированы специфические праймеры, которые были использованы в ПЦР для генотипирования штаммов Y. pseudotuberculosis (таблица 1).

Применение каждой пары праймеров позволило дифференцировать штаммы Y. pseudotuberculosis на два или три генетических варианта, в соответствии с аллелем конкретного INDEL-маркера, в результате синтеза фрагментов ДНК, специфических для каждого варианта. Анализ результатов ПЦР при использовании предложенных праймеров и 30 штаммов Y. pseudotuberculosis различных серовариантов и выделенных из различных источников в разных географических зонах позволил представить наборы фрагментов амплификации, с которыми возможно сравнение результатов будущих определений (таблица 2).

Идентифицирующая таблица 2 отражает результаты ПЦР с использованием праймеров, сконструированных на основе INDEL-маркеров и ДНК штаммов Y. pseudotuberculosis. Кроме того в таблице2, отражены INDEL-типы, которые объединяют исследуемые штаммы Y. pseudotuberculosis и обозначены как генетические группы (I, II-XVI). Способ осуществляется следующим образом. Перед постановкой способа дифференциации штаммов Y. pseudotuberculosis выделяют ДНК исследуемой культуры. Бактериальную суспензию штамма в дистиллированной воде вносят в микропробирку объемом 1,5 мл, после чего проводят обеззараживание материала и выделение ДНК согласно МУ 1.3.2569-09(3).

Затем в ПЦР в отдельных пробирках проводят амплификацию выделенной ДНК со следующими праймерами:

ps0397

Forward: GGGGCCACAAAAAGAGAGTT

Reverse: GTTTTCACGCAGGAACCACT

с длиной фрагмента амплификации 97 п. о. или 79 п. о.;

ps866

Forward: CACCGCCAGTGTGTGTCTAA

Reverse: TAACTCGGGCGACTGACAAC

с длиной фрагмента амплификации 148 п. о., 124 п. о. или 0;

ps1105

Forward: CCGAACAGCATGCACAGA

Reverse: AACCCTCTCGGGTGCTATTT

с длиной фрагмента амплификации 81 п. о. или 72 п. о.;

ps1452

Forward: GCGAGGAAAATCTGATTGTGA

Reverse: CAGCGGCTACAATAGGGTGT

с длиной фрагмента амплификации 103 п. о. или 88 п. о.;

ps1509

Forward: TGGCCGTGGCTTTTATTTAT

Reverse: GCCGGAGAATTCCCATTTT

с длиной фрагмента амплификации 90 п. о. или 72 п. о.;

ps1969

Forward: CTCCGATATTGATCCATTCCT

Reverse: GGTATCAATCGCCATTTCCA

с длиной фрагмента амплификации 92 п. о., 70 п. о. или 0;

ps1779

Forward: TGGATTGATGGCGGTATTCT

Reverse: CTGTAAAGGGGGTATTGTTTCA

с длиной фрагмента амплификации 92 п. о. или 71 п. о.

Условия проведения реакции амплификации

Готовят семь пробирок для реакционных смесей ПЦР. Реакционные смеси объемом по 25 мкл включают: олигонуклеотидные праймеры представленные в таблице 1, по каждой паре на отдельную пробирку (смесь), 2,5 ×ПЦР-буфер - 10 мкл, MgCl₂ - 1,0 мМ, смесь dNTP - 0,25 мМ, Taq DNA полимеразу - 0,5 ед., исследуемую ДНК - 25 нг в объеме 5 мкл.

После этого осуществляют постановку реакции амплификации в амплификаторе, в котором заданы следующие условия амплификации:

1) 95°С этап денатурации - 3 мин (1 цикл),

2) 95°С этап денатурации - 15 сек,

3) 60°С этап отжига праймеров - 15 сек,

4) 72°С этап элонгации - 15 сек,

5) Повтор 2, 3 и 4 этапов (40 циклов),

6) 72°С этап элонгации - 3 мин.

Учет результатов типирования проводят визуально после электрофоретического разделения фрагментов, полученных в ПЦР, в 2% агарозном геле в присутствии маркеров молекулярных весов, позволяющих при окраске ДНК этидиум бромидом в геле оценить молекулярные веса полученных амплификатов в проходящем УФ-свете.

Анализ результатов заключается в получении для каждого исследуемого штамма набора из семи фрагментов амплификации определенного размера и определении штамма к одной генетической группе (INDEL-типу), которая характеризуется тождественным по молекулярным весам набором амплификатов, представленным в идентификационной таблице 2. Включение исследуемого штамма в одну из генетических групп (I,II-XVI) подтверждаяет родство этого штамма с теми, которые находятся в этой группе.

Сущность изобретения поясняется примерами.

Пример 1. Генотипирование штамма Y. pseudotuberculosis Т 197 (17854) в модельном эксперименте. Штамм получен из коллекции ФКУЗ Ростовского-на-Дону противочумного института Роспотребнадзора.

Выделение ДНК штамма Y. pseudotuberculosis Т 197 (17854) проводят согласно стандартной методике [3]. Основным этапом является постановка ПЦР с выделенной ДНК в амплификаторе с использованием семи пар праймеров. ПЦР проводят при использовании программы амплификации: 1) 95°С - 3 мин, 2) 95°С - 15 сек, 3) 60°С - 15 сек, 4) 72°С - 15 сек, 5) повтор 2 и 3 и 4 этапов 40 раз, 6) 72°С - 3 мин. После проведенной ПЦР реакционные смеси 7 пробирок, каждая из которых содержит одну из пар предложенных праймеров и ДНК штамма Y. pseudotuberculosis Т 197 (17854) наносят на 2% агарозный гель и проводят электрофорез с окрашиванием этидиум бромидом в присутствии маркеров молекулярных весов и визуализацией в проходящем УФ-свете. Учет проведенного разделения (таблица 3) определил набор фрагментов молекулярных весов амплифицированных в ПЦР:

Таким образом сравнительный анализ полученных результатов с идентификационной таблицей 2 свидетельствует о том, что штамм Y. pseudotuberculosis Т 197 (17854) имеет набор фрагментов амплификации и, следовательно, аллели локусов с INDEL-маркерами, идентичные штаммам Y. pseudotuberculosis Ра3606, Т1779 (17848) и IP33250, что позволяет объединить эти штаммы в одну генетическую группу - X и считать их близкородственными.

Пример 2. Генотипирование штамма Y. pseudotuberculosis IP 33131 (379) в модельном эксперименте. Штамм получен из коллекции ФБУН НИИ эпидемиолгии и микробиологии имени Пастера Роспотребнадзора.

Выделение ДНК штаммов Y. pseudotuberculosis IP 33131 (379) проводят согласно стандартной методике [3]. Основным этапом является постановка ПЦР с выделенной ДНК в амплификаторе с использованием семи пар праймеров. ПЦР проводят при использовании программы амплификации: 1)95°С - 3 мин, 2)95°С - 15 сек, 3)60°С - 15 сек, 4) 72°С - 15 сек, 5) повтор 2 и 3 и 4 этапов 40 раз, 6) 72°С - 3 мин. После проведенной ПЦР реакционные смеси 7 пробирок, каждая из которых содержит одну из пар предложенных праймеров и ДНК штамма Y. pseudotuberculosis IP 33131 (379) наносят на 2% агарозный гель и проводят электрофорез с окрашиванием этидиум бромидом в присутствии маркеров молекулярных весов и визуализацией в проходящем УФ-свете. Учет проведенного разделения (таблица 4) определил набор фрагментов молекулярных весов амплифицированных в ПЦР:

Вывод сравнение полученных результатов с идентификационной таблицей 2 свидетельствует о том, что штамм Y. pseudotuberculosis IP 33131 (379) имеет набор фрагментов амплификации и, следовательно, аллели локусов с INDEL-маркерами идентичные штаммам Y. pseudotuberculosis N912, IP 33131 (604) и SP93422, что позволяет объединить эти штаммы в одну генетическую группу - I и считать их близкородственными, что дает возможность определять место их выделения и происхождения.

Использование предлагаемого изобретения позволяет достоверно, быстро, с низкой себестоимостью, на любом этапе лабораторной диагностики проводить генетическую дифференцировку штаммов Y. pseudotuberculosis за счет применения разработанных праймеров. В результате получают индивидуальную генотипическую характеристику штамма на основе семи маркерных INDEL-локусов, совокупность которых составляет самостоятельную генетическую группу (INDEL-тип).

Источники информации.

1. Евсеева В.В., Платонов М.Е., Дентовская С. В., Анисимов А.П. Типирование Yersinia pseudotuberculosis с помощью мультилокусного анализа вариабельного числа тандемных повторов // Проблемы особо опасных инфекций, вып. 4, 2015. С. 55-57.

2. Laukkanen-Ninios R, Didelot X, Jolley КА, Morelli G, Sangal V, Kristo P, Brehony C, Imori PF, Fukushima H, Siitonen A, Tseneva G, Voskressenskaya E, Falcao JP, Korkeala H, Maiden MC, Mazzoni C, Carniel E, Skurnik M, Achtman M. 2011. Population structure of the Yersinia pseudotuberculosis complex according to multilocus sequence typing. Environ Microbiol 13:3114-3127.

3. Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности: Методические указания. МУ 1.3.2569-09. - М.: Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, 2009. - 35 с.