Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ ТОКСИГЕННЫХ ШТАММОВ 01 VIBRIO CHOLERAE "ПОСТГАИТЯНСКОЙ" ЛИНИИ МЕТОДОМ ПЦР В РЕЖИМЕ РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ

Предлагаемое изобретение относится к области медицинской микробиологии и генетической инженерии и может быть использовано в лабораторной диагностике для быстрого определения эпидемического потенциала каждого свежевыделенного штамма, включающего в себя выявление полного спектра уникальных генетических маркеров, позволяющих установить происхождение конкретного возбудителя.

Возбудитель холеры находится в процессе постоянной эволюции, и поэтому практически каждая крупная вспышка инфекции вызывает генетически отличающимися вариантами.

Известно, что холерный вибрион обладает высокой пластичностью генома и поэтому штаммы, вызвавшие крупные вспышки в последнее время (Гаити, Йемен), отличаются рядом уникальных маркеров (1).

Первые геноварианты отличались от типичных штаммов Эль Тор только наличием гена субъединицы В холерного токсина классического типа (ctxB1). В дальнейшем им на смену стали приходить штаммы, содержащие сразу 2 отличных от типовых маркера: аллель структурной единицы токсин-корегулируемых пил ей адгезии tcpA^CIRS101 вместо tcpA^{E1 Tor} и гена rtxA, кодирующего синтез высокомолекулярного цитотоксина-актиномодулятора MARTX с null-мутацией, приведшей к формированию преждевременного стоп-кодона (2, 3).

Этот аллель с укороченной ORF был обозначен как rtxA4 (4). Такие штаммы условно называют «предгаитянскими», поскольку они, по всей видимости, являются предшественниками так называемых «гаитянских» штаммов, которые приобрели новый аллель ctxB7. Последний сформировался на фоне генотипа tcpA^CIRS101 rtxA4. С 2010 г. после крупномасштабной эпидемии в Гаити в мире началось их стремительное распространение по всему миру. Наконец, в последнее время наметилась тенденция к замещению «гаитянской» линии «постгаитянской», представители которой содержат еще более укороченный rtxA за счет делеции 60 пар нуклеотидов (п.н.) в проксимальной части гена в дополнение к null-мутации на дистальном конце; этот аллель обозначен как rtxA4a.

Делеция 60 нуклеотидов приводящая к образованию rtxA4a обнаружена in silico - биоинформационным методом.

Наиболее современным способом выявления мутантного аллеля rtxA4a является полногеномное или фрагментарное секвенирование изучаемого штамма Vibrio cholerae с последующим биоинформационным анализом результатов с помощью пакета программ (5).

Однако данный прием требует больших затрат на проведение секвенирования (работы квалифицированного персонала, дорогостоящих секвенаторов, расходных материалов, компьютеров для анализа сиквенсов и пр.). Поэтому данный прием не может широко применяться при анализе большого числа культур (6).

Наиболее близким к предполагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является способ выявления токсигенных штаммов 01 Vibrio cholerae «гаитянской» групп методом ПЦР в режиме реального времени по конечной точке (7), заключающийся в том, что амплификацию исслелуемой ДНК проводят с помощью сконструированных праймеров, анализ продуктов амплификации по конечной точке проводят в ПЦР детекторе, при этом учитывают результаты амплификации визуально на мониторе компьютера по данным каналов FAM и HEX.

Однако праймеры и зонды известного способа не могут быть использованы для выявления токсигенных штаммов Vibrio cholerae имеющих мутацию «гаитянского » штамма на «постгаитянский» за счет более укороченной rtxA и делеции 60 (п.н.) в проксимальной части гена. Для обнаружения «дикого» варианта гена rtxA4 и его делетированного варианта rtxA4, необходим другой подбор праймеров.

Технической задачей предполагаемого изобретения является разработка нового способа в режиме реального времени способного быстро и достоверно выявить токсигенные штаммы 01 Vibrio cholerae с определением гена rtxA4a, характерного для «постгаитянской « линии.

Поставленная задача достигается тем, что в способе выявления токсигенных штаммов 01 Vibrio cholerae «постгаитянской» линии методом ПЦР в режиме реального времени, включающем выделение ДНК из исследуемого штамма, постановку ПЦР со специфическими праймерами и последующим учетом реакции амплификации, отличие заключается в том, что с выделенной ДНК проводят две реакции амплификации с помощью сконструированных двух пар праймеров:

при этом в инкубационные смеси добавляют 0,5 мкл интеркалирующего красителя 50X SYBR Green I для выявления продуктов амплификации по нарастанию показателя флюоресценции по каналу FAM амплификатора, учет результатов проводят по геометрическому методу путем регистрации Дельта -Ср, отраженному на экране монитора, если разница между результатом амплификации первой пары праймеров Rtx01-Rtx02 и второй парой Rtx03-Rtx04, превышает 8 единиц циклов, то делают вывод, что клетка исследуемого штамма содержит ген rtx А4а с делецией 60 п. н., поэтому ее относят к штаммам «постгаитянской» линии токсигенных штаммов 01 Vibrio cholerae.

При этом ПЦР проводят в объеме 25 мкл и реакционная смесь содержит: 2,5 мкл буфера, 1 Ед Taq ДНК- полимеразы, 0,2 мкМ смеси дНТФ, 0,5 мкл 50Х SYBR Green 1, 1,0 мкМ каждого из праймеров, 5 мкл ДНК -ДНК матрицы, оставшийся объем - вода.

Кроме того ПЦР реакции проводят с соблюдением режимов:

денатурация при 95°С - 2 мин (1 цикл); затем 30 циклов: денатурация при 95°С - 20 с, отжиг и учет по каналу FAM при 67°С - 20 с.

Обоснование выбора праймеров.

Важнейшим этапом при разработке ПЦР, обеспечивающим получение корректного результата, является правильный подбор мишеней для посадки праймеров. С помощью комплекса программного обеспечения, разработанного во ФКУЗ РостНИПЧИ Роспотребнадзора (г. Ростов-на-Дону), были проанализированы нуклеотидные последовательности холерного вибриона несущие «дикий» вариант гена rtxA4 и его делетированный вариант rtxA4a. В результате были сконструированы две пары праймеров Rtx01-Rtx02 и Rtx03-Rtx04, где первая пара праймеров является внутренним контролем, а вторая уникальной делецией:

Объектом защиты настоящего изобретения является набор двух пар праймеров Rtx01-Rtx02 и Rtx03- Rtx04 для выявления варианта гена rtxA4a с делецией 60 нуклеотидов штаммов Vibrio cholerae O1 с помощью ПЦР в формате реального времени с использованием интекалирующего красителя SYBR Green I. Препарат ДНК из исследуемого штамма анализируют с помощью ПЦР-РВ с двумя парами праймеров Rtx01-Rtx02 и Rtx03-Rtx04. Использование интекалирующего красителя SYBR Green I необходимо для выявления продуктов амплификации по нарастанию показателя флюоресценции по каналу FAM амплификатора. Практически процесс накопления продукта ПЦР оценивают путем возрастания величины показателя Дельта -Ср в ходе амплификации.

Результат достигается тем, что при отсутствии ингибитора реакции происходит образование ампликона с парой Rtx01-Rtx02. Если в пробе присутствует ингибитор амплификации, то нарастания флюоресценции не регистрируют.О наличии целевого продукта- варианта rtxA4a с делецией 60 нуклеотидов свидетельствует либо полное отсутствие амплификации со второй парой Rtx03-Rtx04, либо ее активное протекание, что подтверждает разница показателя Дельта-Ср, исследуемого штамма, которая должна быть не менее 8 циклов по сравнению с парой Rtx01-Rtx02.

Способ осуществляется следующим образом.

Перед постановкой ПЦР проводят предварительную подготовку материала (выделение ДНК). Массу бактерий, сформировавших газон на плотной питательной среде, стерильной палочкой перемещают в пробирку, содержащую 3-5 мл физиологического раствора. Доводят плотность суспензии до 10⁹ клеток на мл среды по оптической плотности после чего выделяют ДНК как принято (Метод. МУ 1.3.1791-9 «Организ. работы при исследовании методом ПЦР материала, инфицированного микроорганизмами 1 и 2 группы патогенности-М.2003-38 с») с помощью любого коммерческого набора для выделения ДНК.

С полученной ДНК далее проводят две реакции амплификации с праймерами Rtx01-Rtx02 и Rtx03-Rtx04 в присутствии интеркалирующего красителя SYBR Green I.

Условия проведения реакции амлификации в формате реального времени.

Инкубационная смесь объемом 25 мкл содержит: 2,5 мкл буфера, 1 Ед Taq ДНК-полимеразы, 0,2 мкМ смеси дНТФ, 0,5 мкл 50Х SYBR Green I (производства ЗАО Евроген, Москва), 1,0 мкМ каждого из праймеров, 5 мкл ДНК -ДНК матрицы, оставшийся объем - вода.

Амплификация проводится в амплификаторе, например, (DTlite5 производства НПФ ДНК-технология), по следующей схеме: денатурация при 95°С - 2 мин (1 цикл); затем 30 циклов: денатурация при 95°С - 20 с, отжиг и учет по каналу FAM при 67°С - 20 с. Учет проводим по каналу FAM.

Учет результатов проводили по геометрическому методу путем регистрации Ср.

Сущность предполагаемого изобретения поясняется следующими примерами:

Пример 1.

Выявление методом ПЦР токсигенных штаммов Vibrio cholerae 01 группы «постгаитянской» линии на анализе трех штаммов: 19191, 19667, 19613.

Все штаммы взяты из коллекции живых культур ФКУЗ Ростовского-на-Дону противочумного института.

В ходе биоинформационного анализа ген ПхА4а с делецией 60 нуклеотидов был идентифицирован в токсигенном штамме Vibrio cholerae O1 19667. Поэтому для первой серии экспериментов использовали этот штамм.

ДНК матрицы, каждого из трех токсигенных штаммов параллельно вносят в две инкубационные смеси объемом 25 мкл содержащую: 2,5 мкл буфера, 1 Ед Taq ДНК-полимеразы, 0,2 мкМ смеси дНТФ, 0,5 мкл 50Х SYBR Green I (производства ЗАО Евроген, Москва), 1,0 мкМ каждого из праймеров, 5 мкл ДНК- ДНК-матрицы анализируемого штамма, оставшийся объем - вода.

Первая смесь содержала праймеры RtxO 1 - Rtx02, вторая смесь - праймеры Rtx03-Rtx04.

Амплификацию проводят в амплификаторе, DTlite5 производства НПФ ДНК-технология по следующей схеме: денатурация при 95°С - 2 мин (1 цикл); затем 30 циклов: денатурация при 95°С - 20 с, отжиг и учет по каналу FAM при 67°С - 20 с.

Учет результатов проводят по геометрическому методу путем регистрации Дельта- Ср (см. рисунки 1, 2, 3), отраженных на мониторе.

На рисунке 1 отражена реакция ДНК штамма 19191 вначале с парой праймеров RtxOl -Rtx02 (криваяАО, а криваяА₂

со второй парой праймеров Rtx03-Rtx04. По горизонтали отмечены циклы амплификации. Стрелка внизу указывает циклы амплификации (Ср), на котором зарегестрировано повышение уровня флюоресценции.

Накопление результата амплификации оценивают по показателю Дельта-Ср, который определяют как:

Cp=A₁-A₂, где

А₁ - результат амплификации штамма 19191 с праймерам Rtx01-Rtx02;

А₂ - результат амплификации штамма 19191 с праймерами Rtx03-Rtx04;

Разница результатов амплификации штамма 19191 с разными праймерами отслеживаем на мониторе в виде графиков полученных с помощью интеркалирующего красителя (см. рис. 1).

Ср=9,7-9,9=-0,2;

Для штамма 19667 (см. рисунок 2).

Ср=Б₁-Б₂, где

Б₁ - результат амплификации штамма 19667 с праймерами Rtx01-Rtx02;

Б₂ - результат амплификации штамма 19667 с праймерами Rtx03-Rtx04;

Ср=15-26,5=-11,5

Для штамма 19613 (см. рисунок 3).

Ср=В₁-В₂, где

В₁ - результат амплификации штамма 19613 с праймерами Rtx01-Rtx02;

В₂ - результат аплификации штамма 19613 с праймерами Rtx03-Rtx04;

Ср=12,9-11,0=1,9;

На рисунке 3, что амплификация успешно прошла с двумя парами праймеров, поскольку разница показателей Ср с праймерами Rtx01-Rtx02 (стрелка 1) и Rtx03-Rtx04 (стрелка 2) соствляет две еденицы. Результат свидетельствует об отсутствии гена rtxA4a. с делецией 60 нуклеотидов в клетках Vibrio cholerae 19613.

Вывод: из рисунков видно, что только штамм 19667 имеет в реакции с праймерам Rtx03-Rtx04 задержку больше чем 10 циклов, так как Дельта Ср=11. Данный результат трактуют как подтверждение наличия делеции rtxA4a. (см. таблицу 1).

Таким образом, полученный результат свидетельствует, что все три образца ДНК пригодны для анализа, поскольку зарегистрирован положительный результат с парой праймеров Rtx01-Rtx02 во всех случаях. Только клетки штамма 19667 содержат ген rtxA4a с делецией 60 нуклеотидов, поскольку величина Ср, регистрируемая в случае использования пар праймеров Rtx01-Rtx02 и Rtx03-Rtx04 превышает 8 циклов и составляет 11 единиц.

Пример 2.

Выявление варианта гена rtxA4a с делецией 60 нуклеотидов штаммов 01 Vibrio cholerae: 17259,18826,971 (569 В), 18899,19667.

Условия проведения и учета реакции как в Примере 1. В качестве положительного контроля служила ДНК из штаммов O1 Vibrio cholerae 19667, использованного в примере 1. Результаты анализа приведены в таблице 2.

Полученный результат свидетельствует, что все четыре исследуемых образца ДНК и один контрольный пригодны для анализа, поскольку во всех случаях зарегистрирован положительный результат с парой праймеров Rtx01-Rtx02. Ни один из четырех исследованных штаммов не содержит ген rtxA4a с делецией 60 нуклеотидов. Только клетки контрольного штамма 19667 содержат ген rtxA4a с делецией 60 нуклеотидов, поскольку величина Ср, регистрируемая в случае использования пар праймеров Rtx01-Rtx02 и Rtx03-Rtx04 составляет не менее 15 единиц.

Пример 3.

ПЦР-анализ шести культур токсигенных штаммов O1 Vibrio cholerae: 19242, 19188, 5879, 19187, 17820, 16302.

Условия проведения и учета реакции как в Примере 1. В качестве положительно контроля служила ДНК из штаммов Ol Vibrio cholerae 19667, использованного в примерах 1 и 2.

Результаты анализа приведены в таблице 3.

Полученный результат свидетельствует, что все шесть исследуемых образцов ДНК и один контрольный пригодны для анализа, поскольку во всех случаях зарегистрирован положительный результат с парой праймеров Rtx01-Rtx02. Пять исследованных штаммов не содержит ген rtxA4a с делецией 60 нуклеотидов. Клетки штамма 19242 и клетки контрольного штамма 19667 содержат ген rtxA4a с делецией 60 нуклеотидов, поскольку величина Ср, регистрируемая в случае использования пар праймеров Rtx01-Rtx02 и Rtx03-Rtx04 составляет 15 и 11 единиц.

Во всех случаях время проведения ПЦР и получения результата с момента получения образцов ДНК не превышало 1,5 часов.

Использование предполагаемого изобретения позволяет достоверно и быстро за счет подбора пар праймеров с помощью ПЦР в формате реального времени выявлять у токсигенных штаммов O1 Vibrio cholerae ген rtxA4a с делецией 60 нуклеотидов, характерный для «постгаитянских» вариантов, вызывающих вспышки инфекции в последнее время. Это крайне важно при проведении мониторинга за холерой и оперативной организации противоэпидемических мероприятий при выделении токсигенного штамма 01 Vibrio cholerae.

Источники информации.

1. Monakhova E.V., Ghosh A., Mutreja A., Weill F.-X., Ramamurthy Т. Endemic Cholera in India and Imported Cholera in Russia: What is Common? Problemy Osobo Opasnykh Infektsii [Problems of Particularly Dangerous Infections]. 2020; 3:17-26. (In English). DOI: 10.21055/0370-1069-2020-3-17-26.

2. Mutreja A., Kim D.W., Thomson N.R., Connor T.R., Lee J.H., Kariuki S., Croucher N.J., Choi S.Y., Harris S.R., Lebens M., Niyogi S.K., Kim E.J., Ramamurthy Т., Chun J., Wood J.L., Clemens J.D., Czerkinsky C, Nair G.B., Holmgren J., Parkhill J., Dougan G. Evidence for several waves of global transmission in the seventh cholera pandemic // Nature. - 2011. - Vol. 477. - P. 462-465.

3. Ramamurthy T, Mutreja A, Weill F.X, Das B, Ghosh A, Nair G.B. Revisiting the Global Epidemiology of Cholera in Conjuction With the Genomics of Vibrio cholerae. Front Public Health. 2019 Jul 23;7:203. doi: 10.3389/fpubh.2019.00203. eCollection 2019. PMID: 31396501

4. Dolores J., Satchell K.J.F. Analysis of Vibrio cholerae genome sequences reveals unique rtxA variants in environmental strains and an rtxA null-mutation in recent altered El Tor isolates. mBio. 2013; 4(2): e00624-12. DOI: 10.1128/mBio.00624-12.

5. Weill F. X., Domman D., Njamkepo E., et. al. Genomic insights into the 2016-2017 cholera epidemic in Yemen. Nature. 2019 Jan; 565(7738): 230-233.

б.Водопьянов A.C., Писанов P.В., Водопьянов C.O., Мишанькин Б.Н., Олейников И.П., Кругликов В.Д., Титова С.В. «Молекулярная эпидемиология Vibrio cholerae- разработка алгоритма анализа данных полногеномного секвенирования». Эпидемиология и инфекционные болезни. 2016;(3): 146-152.

7. «Способ выявления токсигенных штаммов Ol Vibrio cholerae «гаитянской» группы методом ГЩР в режиме реального времени по конечной точке», Патент №2729218,кл. C12Q 1/68, опубликовано 05.08.2020 Бюл.22

Rtx01 CAGCGAAACCGTAGCGGATA

Rtx02 GGTGAGATCCCCTTCTTCGC

Rtx03 ATCAAACGTGACGCGTGGTA

Rtx04 TTTGACAATGACGTTCGCCG

<110>Ростовский-на-Дону противочумный институт

<120>Способ выявления токсигенных штаммов О1 Vibrio cholerae «постгаитянской» линии методом ПЦР в режиме реального времени.

<400>4

Rtx01 cagcgaaaccgtagcggata (20)

Rtx02 ggtgagatccccttcttcgc (20)

Rtx03 atcaaacgtgacgcgtggta (20)

Rtx04 tttgacaatgacgttcgccg (20)

<141> 2021-04-12