Результат интеллектуальной деятельности: Способ экстракции полифенольных соединений из змееголовника молдавского

Изобретение относится к фармакологии и медицине и может быть использовано для экстракции полифенольных соединений из растительного сырья, в частности змееголовника молдавского.

Возникновению и прогрессированию различных заболеваний в значительной степени способствует окислительный стресс клеток, вызванный постоянным накоплением активных форм кислорода.

В течение последних лет растет интерес к антиоксидантам растительного происхождения, так как терапевтический акцент сменился в сторону их использования.

Фитохимические вещества обычно используются для лечения широкого спектра острых и хронических заболеваний, и обширные исследования указывают на то, что антиоксидантная активность таких фитохимических веществ является основным фактором их терапевтического действия.

Травы семейства Lamiaceae, такие как Melissa officinalis (мелисса), Ocimum sp.(базилик), Origanum vulgare (орегано), Perilla frutescens (китайский базилик), Rosmarinum officinalis (розмарин), Salvia officinalis (шалфей) и Thymus sp.(тимьян), используются в качестве ароматизатора в пищевых блюдах, а также в лечебных целях. Было продемонстрировано, что высокое содержание розмариновой кислоты в этих травах является основным фактором их терапевтического действия.

Использование фитохимических веществ требует подбора метода их извлечения из растительного сырья. Наряду с традиционными методами было разработано множество новых методов, но до сих пор ни один метод не считается стандартом для извлечения биологически активных соединений из растений.

Змееголовник молдавский (Dracocephalum moldavica L.) - многолетнее травянистое растение в составе которого содержится большое количество фенольных кислот, в частности розмариновой кислоты, благодаря чему экстракты змееголовника молдавского обладают высокой антиоксидантной активностью [10.1016/j.foodchem.2020.128531 10.1016/j.1wt.2006.11.013].

Глубокие эвтектические растворители - Deep eutectic solvents (DES) представляют интерес для современной фармацевтической технологии в качестве альтернативны традиционным органическим экстрагентам. Они характеризуются образованием сильных водородных связей и из-за чрезвычайно низкого давления паров, широко используются в химии полимеров и синтетической органической химии. Перспективы их использования обусловлены низкой токсичностью, биоразлагаемостью, возможностью селективного извлечения конкретного вещества и возобновления экстрагента. В литературе описаны результаты изучения влияния DES на выход различных групп биологически активных веществ (БАВ), как из высушенных, так и из свежих растений. Процесс экстракции глубокими эвтектическими растворителями основан на замещении молекул растворителя извлекаемыми биологически активными веществами с разрывом существующих водородных связей и образованием новых. DES хорошо проявили себя и как для экстракции групп соединений, так и для селективного извлечения отдельных биологически активных молекул. При этом применение DES характеризуется сложностью выбора исходных субстанций, необходимостью подбора их соотношения, агрегационной нестабильностью некоторых систем.

Целью проведенных исследований, результаты которых положены в основу предложенного изобретения, являлась разработка и оптимизация технологии ультразвуковой экстракции полифенольных соединений из змееголовника молдавского.

Известен способ экстракции флавоноидов из растительного сырья [Абилхан А.Ж. и др. Экстракция флавоноидов из лабазника вязолистного в условиях микроволнового излучения. XX Международная научно-практическая конференция имени профессора Л.П. Кулева. Теоретические и прикладные аспекты фармации и биотехнологии], согласно которому в качестве растительного сырья используют лабазник вязолистный, который предварительно измельчают и пропускают через сито с диаметром отверстий 0,5 мм, а в качестве экстрагента для извлечения флавоноидов используют водно-спиртовые смеси раз личной концентрации.

Недостатком способа является относительно низкая безопасность, вызванная применением экстрагента в виде водно-спиртовой смеси.

Известны, например, способы получения глубоких эвтектических растворителей, обладающих высокой безопасностью применения, [Облучинская Е.Д. и др. Глубокие природные эвтектические растворители как альтернативные экстрагенты для извлечения флоротанинов бурых водорослей. Химико-фармацевтический журнал. Том 53, №3, 2019], заключающиеся в том, что используют смесь природных компонентов L-молочной кислоты, бетаина, холина хлорида, яблочной кислоты, глюкозы и глицерина, которые смешивают в определенных молярных соотношениях и нагревают до температуры 50° при постоянном перемешивании до образования прозрачной жидкости в виде конечного продукта.

Недостатком способа является относительно узкая область применения, поскольку он не может быть использован без дополнительных усовершенствований для экстракции полифенольных соединений из змееголовника молдавского, обладающего, как указывалось выше, высокой антиоксидантной активностью. Это сужает арсенал технических средств, которые могут быть использованы для экстракции полифенольных соединений из растительного сырья.

Близким по технической сущности к предложенному является способ экстракции флавоноидов из лекарственного растительного сырья [RU 2453322, C1, A61K 36/00, 20.06.2012], заключающийся в том, что экстракцию проводят при напряжении электрического поля 5 В и частотой 10⁵ Гц при перемешивании в течение 30-60 мин.

Недостатком способа является относительно низкая эффективность экстракции и относительно высокая сложность, вызванная необходимостью формирования электрического поля, а также относительно узкая область применения, поскольку он не может быть использован без дополнительных усовершенствований для экстракции полифенольных соединений из змееголовника молдавского, обладающего, как указывалось выше, высокой антиоксидантной активностью. Это сужает арсенал технических средств, которые могут быть использованы для экстракции полифенольных соединений из растительного сырья с обеспечением безопасного применения готового продукта.

Наиболее близким по технической сущности к предложенному является способ получения экстракта из травы змееголовника молдавского (Dracocephalum moldavica L.), содержащего флавоноиды, обладающего противовоспалительной активностью [RU 2695328, C1, A61K 36/53, 23.07.2019], заключающийся в экстракции измельченного сырья этиловым спиртом, фильтровании, упаривании, при этом, измельченную траву змееголовника молдавского, собранную в фазе бутонизации и цветения, трижды экстрагируют 50% этиловым спиртом, при соотношении сырье : экстрагент, равном 1:10, при комнатной температуре, при подаче на каждую последующую экстракцию свежего экстрагента, равного слитому извлечению, полученные экстракты упаривают последовательно по мере поступления до объема 1/20, водные кубовые концентраты объединяют и обрабатывают три раза хлороформом в соотношении хлороформгводная фаза, равном 1:2, органическую фазу отделяют, а водный кубовый остаток переосаждают 96% этиловым спиртом в соотношении 1:10, выпавший осадок отстаивают, дважды промывают 96% этиловым спиртом и фильтруют с последующим высушиванием на воздухе или в вакуум-сушильном шкафу при температуре 40°С в течение 4 ч.; полученный сухой остаток растворяют в дистиллированной воде с добавлением ацетона, взятых в соотношении вода:ацетон, равном 1:4, выдерживают в течение 1 часа, фильтруют, полученный фильтрат упаривают.

Недостатком способа является относительно низкая эффективность экстракции и относительно высокая сложность, вызванная необходимостью безопасного проведения операций с использованием хлороформа и ацетона, а также относительно низкая эффективность экстракции полифенольных соединений из растительного сырья. Это сужает арсенал технических средств, которые могут быть использованы для экстракции полифенольных соединений из растительного сырья с обеспечением безопасного применения готового продукта.

Задачей, которая решается в изобретении, направлена на разработку способов эффективной экстракции полифенольных соединений из растительного сырья, в частности, из змееголовника молдавского и обеспечивающих безопасность применения готового продукта.

Требуемый технический результат заключается в расширении арсенала технических средств для экстракции полифенольных соединений из растительного сырья с одновременным обеспечением безопасности применения конечного продукта.

Поставленная задача решается, а требуемый технический результат достигается тем, что смешивают растительное сырье с растворителем и при экстракции воздействуют на смесь физическим полем. Согласно изобретению, в качестве растительного сырья используют змееголовника молдавского траву, которую измельчают до размера частиц 2-3 мм, добавляют 40% водный раствор эвтектического растворителя DES 1 - DES 11 (см. Таблицу) в соотношении 1:20 г/мл, после смешивания нагревают до 40°С на водяной бане и воздействуют на смесь ультразвуковым излучением частотой 40 кГц. При этом воздействие проводят в течение трех последовательных интервалов, в каждом из которых через 5 минут воздействие прекращают и смесь перемешивают в течение 30 секунд, а по окончании третьего интервала воздействия смесь охлаждают до комнатной температуры для получения конечного продукта.

На чертеже представлены:

на фиг. 1 - данные по извлечению полифенольных соединений из сбора змееголовника молдавского;

на фиг. 2 - влияние содержания воды в составе DES на процесс экстракции полифенольных соединений;

на фиг. 3 - циклическая вольтамперограмма спиртового экстракта из травы змееголовника молдавского;

на фиг. 4 - циклическая вольтамперограмма экстракта DES-3 из травы змееголовника молдавского;

на фиг. 5 - циклическая вольтамперограмма экстракта DES-6 из травы змееголовника молдавского;

на фиг. 6 - циклическая вольтамперограмма экстракта DES-7 из травы змееголовника молдавского;

на фиг. 7 - циклическая вольтамперограмма экстракта DES-8 из травы змееголовника молдавского;

на фиг. 8 - циклическая вольтамперограмма экстракта DES-1 из травы змееголовника молдавского;

на фиг. 9 - циклическая вольтамперограмма экстракта DES-2 из травы змееголовника молдавского;

на фиг. 10 - циклическая вольтамперограмма экстракта DES-5 из травы змееголовника молдавского.

Способ экстракции полифенольных соединений из змееголовника молдавского реализуется следующим образом.

Растительное сырье в виде сбора змееголовника молдавского (Dracocephalum moldavica L.) измельчают до размера частиц 2-3 мм, добавляют 40% водный раствор эвтектического растворителя DES 1 - DES 11 (см. Таблицу) в соотношении 1:20 г/мл, после смешивания нагревают до 40°С на водяной бане и воздействуют на смесь ультразвуковым излучением частотой 40 кГц, при этом, воздействие проводят в течение трех последовательных интервалов, в каждом из которых через 5 минут воздействие прекращают и смесь перемешивают в течение 30 секунд, а по окончании третьего интервала воздействия смесь охлаждают до комнатной температуры для получения конечного продукта.

Лекарственные растения были получены из Ботанического сада Всероссийского научно-исследовательского института лекарственных и ароматических растений (ВИЛАР). Данный сбор обладает антиоксидантными свойствами благодаря содержанию полифенольных соединений, основной из которых является розмариновая кислота.

Для изготовления различных комбинаций глубоких эвтектических растворителей был использован тепловой метод. Компоненты смешивали в определенных мольных соотношениях в стеклянной конической колбе, закрывали пробкой и нагревали при 60°С на водяной бане до образования однородной прозрачной жидкости (60-90 мин), устойчивой и стабильной при комнатной температуре. Для первоначального скрининга экспериментальных образцов DESs, изготовлены их 40% (m/m) водные растворы.

В данном эксперименте нами получены 11 глубоких эвтектических растворителей. Их составы приведены в таблице.

Изготовленные DESs представляют собой вязкие прозрачные жидкости.

Экстракция полифенольных соединений из змееголовника молдавского производится следующим образом.

Пример. Около 0,5 г (точная навеска) исследуемого сырья помещали в коническую колбу вместимостью 25 мл, прибавляли 10 мл полученного глубокого эвтектического растворителя, колбу закрывали пробкой. Затем колбу нагревали при температуре 40°С и подвергали воздействию ультразвукового излучения частотой 40 кГц в течение 15 минут. Каждые 5 минут экстракцию останавливали и перемешивали содержимое колбы в течение 30 секунд. Колбу охлаждали до комнатной температуры, содержимое колбы фильтровали через бумажный складчатый фильтр (синяя лента) для дальнейшего анализа.

Оптимизация процесса экстрагирования.

Все экстракты на основе DESs были получены в одинаковых условиях: отношение сырье : экстрагент 1:20 г/мл, время экстракции 15 мин., температура экстракции 40°С, частота ультразвукового излучения 40 кГц. Для первоначального скрининга экспериментальных образцов DESs, представленных в таблице, изготовлены их 40% (m/m) водные растворы. Усовершенствование процесса экстрагирования осуществлялось после выбора оптимального DES по параметрам содержания воды в растворе DES (20, 40, 60 и 80%).

Влияние состава DES на процесс экстракции полифенольных соединений.

Эффективность DESs для извлечения полифенольных соединений была доказана ранее проводимыми исследованиями. Нами были протестированы 11 глубоких эвтектических растворителей, чтобы проанализировать эффективность экстракции полифенольных соединений из травы змееголовника молдавского. Эффективность экстракции сравнивали с экстрактами, полученными на основе 50% спирта и воды.

Данные по извлечению полифенольных соединений из сбора растительной композиции приведены на фиг. 1.

Как видно из графика фиг. 1, способность DES к извлечению полифенольных соединений зависит от состава конкретного экстрагента. Так для экстрагентов, где акцептором водородной связи выступал

Для DESs, основу которых составляли лимонная кислота и пролин, экстрагирующая способность оказалась в целом ниже, чем у растворителей на основе холина хлорида. Однако очевидно, что основную роль играют доноры водородной связи. Возможно, это обусловлено особенностью возникновения водородных связей между компонентами DES. Чем больше образуется водородных связей в структуре DES, тем большее количество полифенольных соединений может взаимодействовать с компонентами растворителя и извлекаться из растительного материала.

Таким образом, оптимальным экстрагентом для извлечения полифенольных соединений из растительной композиции является DES-3 на основе холина хлорида и молочной кислоты в мольном соотношении 1:3. С помощью данного экстрагента удалось извлечь 7,72±0,12% полифенольных соединений в пересчете на розмариновую кислоту, что на 0,23% больше, чем в аналогичном водно-спиртовом извлечении.

Влияние содержания воды в составе DES на процесс экстракции полифенольных соединений.

Далее нами изучен эффект содержания воды в составе DES на его экстрагирующую способность. Получены DESs на основе холина хлорида - молочной кислоты в мольном соотношении 1:3 (DES 3), содержащие 20, 40, 60 и 80% воды (m/m), которые использовали в качестве экстрагентов флавоноидов из растительного сбора. Экстракция осуществлялась при температуре 40°С в течение 15 мин с частотой ультразвукового излучения 40 кГц при соотношении сырье : экстрагент 1:20 г/мл.

Влияние содержания воды в составе DES на процесс экстракции полифенольных соединений иллюстрируется на фиг. 2.

Экстрагирующая способность глубокого эвтектического растворителя улучшается при добавлении воды. Это может быть связано со снижением вязкости экстрагента, что позволяет добиться лучшего смачивания сырья и, как следствие, извлечения большего количества полифенольных соединений. Однако при достижении определенного содержания воды выход снижается, что можно объяснить разрывом существующих водородных связей и нарушением надмолекулярной структуры DES.

Таким образом, было установлено, что оптимальное содержание воды в DES на основе холина хлорида и молочной кислоты (мольное соотношение 1:3) составляет 60%.

Определение антиоксидантной активности полученных эвтектических экстрактов.

Антиоксидантную активность полученного экстракта измеряли с помощью циклической вольтамперометрии. Циклическая вольтамперометрия (ЦВА) реализована на компьютерном потенциостате IPC-Pro М производства «Econix» (погрешность сканирования 1,0%; установка потенциала 0,25 мВ). Эксперименты проводились в пятигорлой стеклянной конической электрохимической ячейке объемом 10 мл с водяной рубашкой для термостатирования. ЦВА записывались по трехэлектродной схеме. Рабочий электрод - дисковый стеклоуглеродный электрод (d=3 мм). Платиновая проволока служила вспомогательным электродом. В качестве электрода сравнения использовался электрод Ag/AgNO₃ (0,01 М), соединенный с раствором диафрагмой из пористого стекла.

В типичном случае было использовано 5 мл раствора. Образцы для испытаний готовили растворением 100 мкл экстракта вместе с 1 ммоль уксусной кислоты в 0,1 М растворе n-Bu₄NBF₄ в ацетонитриле. Перед использованием ацетонитрил перегоняли над Р₂О₅. Растворы деаэрировали барботированием аргона в течение 5 мин перед записью циклической вольтамперограммы и выдерживали в терморегулируемых условиях при 25±0,5°С. Циклические вольтамперограммы снимали в диапазоне потенциалов от 0 до 1,0 В при скорости сканирования 100 мВ⋅с^-1. Рабочий электрод полировали перед записью каждой ЦВА.

На фиг. 3 представлена циклическая вольтамперограмма спиртового экстракта из травы змееголовника молдавского, на фиг. 4 - экстракта DES-3 из травы змееголовника молдавского, на фиг. 5 - экстракта DES-6 из травы змееголовника молдавского, на фиг. 6 - экстракта DES-7 из травы змееголовника молдавского, на фиг. 7 - экстракта DES-8 из травы змееголовника молдавского, на фиг. 8 - экстракта DES-1 из травы змееголовника молдавского, на фиг. 9 - экстракта DES-2 из травы змееголовника молдавского, на фиг. 10 - экстракта DES-5 из травы змееголовника молдавского.

Полученные вольтамперограммы показывают, что все экстракты имеют хорошо выраженные пики окисления. Наблюдался широкий анодный пик между 0,2 и 0,8 В. Этот пик был обусловлен реакцией различных антиоксидантов с разным потенциалом окисления, в основном флавоноидов и фенольных кислот. Результаты показывают, что образцы содержали несколько восстановителей в соответствующих экстрактах. Фоновые циклические вольтамперограммы показывают, что DES сам по себе не проявляет антиоксидантной активности, поскольку не наблюдались пики окисления (за исключением системы L-пролин / глицерин). Исходя из высоты пиков окисления, экстракт, приготовленный с использованием смеси хлорида холина и молочной кислоты, имеет наивысшую антиоксидантную активность и наименьшую в случае лимонной кислоты и глюкозы. Следует отметить, что экстракты, приготовленные с использованием DES, в некоторых случаях обладают аналогичной или более высокой антиоксидантной активностью по сравнению с водно-этанольным экстрактом.

Таким образом, благодаря усовершенствованию известного способа экстракции, достигается требуемый технический результат, который заключается в расширении арсенала технических средств для экстракции полифенольных из растительного сырья с одновременным обеспечением безопасности применения конечного продукта.