Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ БРУЦЕЛЛЕЗА ДЛЯ ИММУНИЗАЦИИ ПОЗВОНОЧНЫХ ЖИВОТНЫХ (варианты)

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии и биотехнологии, в частности к созданию вакцины для профилактики бруцеллеза позвоночных животных.

Бруцеллез крупного рогатого скота - хроническое зооантропонозное заболевание, распространенное во многих странах мира, наносящее большой экономический ущерб скотоводству и представляющее серьезную опасность здоровью людей.

Основным средством борьбы с бруцеллезом крупного рогатого скота, особенно в зонах его широкого распространения, является вакцинация всего поголовья и своевременное удаление из стада больных животных.

Известен способ получения вакцины против бруцеллеза позвоночных животных, культивирование бруцеллезного штамма рода Brucella abortus с последующим культивированием на стерильной питательной среде с последующим выделением антигена в виде бактериальной массы и его конъюгацией со стабилизатором, содержащим сахарозу и желатин, стерилизацией, фасовкой и лиофилизацией [Авторское свидетельство №1585950, Способ изготовления вакцины против бруцеллеза животных, МПК А61К 39/10, 1990; Промышленный регламент производства вакцины живой сухой против бруцеллеза сельскохозяйственных животных из штамма Бруцелла абортус 19. Щелково, 2008, стр. 16-65].

Недостатками данной вакцины являются высокая агглютиногенность, так как в крови животных, иммунизированных данной вакциной в течение нескольких месяцев, а иногда и нескольких лет обнаруживают антитела в принятых для диагностики бруцеллеза серологических реакциях, что препятствует выявлению больных животных в вакцинированном стаде. Вакцину нельзя применять для иммунизации стельных коров, так как она вызывает аборты у отдельных животных.

Недостатком данной вакцины является ее недостаточный срок хранения с сохранением качества целевого продукта.

Техническим решением предлагаемого изобретения является увеличение сроков хранения целевого продукта с сохранением его иммуногенности против бруцеллеза позвоночных животных.

Предложена группа изобретений, объединенная единым изобретательским замыслом с достижением единого технического результата.

Поставленная задача решается в способе получения вакцины против бруцеллеза позвоночных животных, культивирование бруцеллезного штамма рода Brucella abortus с последующим культивированием на стерильной питательной среде с последующим выделением антигена в виде бактериальной массы и его конъюгацией со стабилизатором, содержащим сахарозу и желатин, стерилизацией, фасовкой и лиофилизацией тем, что в качестве бруцеллезного штамма рода Brucella abortus используют штамм Brucella abortus RB-51/ЩБК, а в качестве антигена используют бактериальную массу штамма Brucella abortus RB-51/ЩБК с содержанием клеток 1,0-4,0×10¹⁰ м.кл./см³, при следующем содержаний компонентов, мас. %:

причем рН стабилизатора доводят до 7,4-7,6 15-20% раствором едкого натрия, стерилизуя его при 116°-120°С в течение 20-30 мин.

Поставленная задача также решается в способе получения вакцины против бруцеллеза позвоночных животных, культивирование бруцеллезного штамма рода Brucella abortus с последующим культивированием на стерильной питательной среде с последующим выделением антигена в виде бактериальной массы и его конъюгацией со стабилизатором, содержащим сахарозу и желатин, стерилизацией, фасовкой и лиофилизацией тем, что в качестве бруцеллезного штамма рода Brucella abortus используют штамм Brucella abortus RB-51/ЩБК, а в качестве антигена используют бактериальную массу штамма Brucella abortus RB-51/ЩБК с содержанием клеток 1,0-4,0×10¹⁰ м.кл./см³, причем стабилизатор дополнительно содержит бета-циклодекстрин, при следующем содержаний компонентов, мас. %:

причем рН стабилизатора доводят до 7,4-7,6 15-20% раствором едкого натрия, стерилизуя его при 116°-120°С в течение 20-30 мин.

Штамм Brucella abortus RB-51/ЩБК депонирован в коллекции микроорганизмов Федерального бюджетного учреждения «Федеральный Научно-исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации (см. приложение 1).

Штамм Brucella abortus RB-51/ЩБК выделен отделом биологического контроля ФКП «Щелковский биокомбинат» из органного материала, переданного с ООО АПК «Титан» Русско-Полянском районе, Омской области.

Известен бета-циклодекстрин, который является пищевой добавкой (Е459), стабилизатором и эмульгатором, который придает продуктам питания вязкость, поддерживает однородную дисперсию компонентов /ГОСТ 33782-2016/.

В патентной и научно-технической литературе неизвестны технические решения аналогичные заявляемому, т.е. предложение соответствует критерию изобретения «новизна».

Заявленная композиция решает актуальную проблему ветеринарии - профилактики бруцеллеза позвоночных животных, т.е. предложение «промышленно применимо».

В отечественной литературе не известно использование штамма Brucella abortus RB-51/ЩБК для получения вакцины против бруцеллеза позвоночных животных. Нами впервые показано, что сочетанное использование вышеуказанных отличительных признаков, взятых в определенных соотношениях компонентов, увеличивает сроки хранения целевого продукта с сохранением его иммуногенности против бруцеллеза позвоночных животных, что приводит к достижению технического результата. Следовательно, изобретение соответствует критерию «изобретательский уровень».

Изобретение иллюстрируется на следующих примерах.

Пример 1. Для получения посевного материала и производственного культивирования бруцелл используют стерильную питательную среду на основе перевара Хоттингера, содержащую, об.%: перевар Хоттингера - 25, глицерин - 2, глюкоза - 1,5, натрия хлорид - 0,5, дрожжевой аутолизат нативный - 3,4, вода - до 100. Для получения посевного материала чистую культуру штамма Brucella abortus RB-51/ЩБК засевают в микроферментер с данной питательной средой. Концентрация посевного материала составляет 3,5 млрд.м.кл./см³. Культивируют 24 часа до накопления 35 млрд.м.кл./см³.

Производственное культивирование проводят глубинным методом в биореакторе в питательной среде того же состава. При культивировании рН поддерживают в пределах 6,9, а температуру - в пределах 36,5°С. Уровень парциального давления растворенного в культуральной жидкости кислорода составляет: с 1 по 3 час - 20 pO₂, с 3 по 6 час - 25 рО₂, с 6 по 15 час - 40 рО₂ с 15 по 16 час - 30 pO₂. Время культивирования составляет 16 часов, накопление клеток составляет 70 млрд.м.кл./см³. По окончании культивирования бактериальную суспензию концентрируют ультрафильтрацией с использованием мембранных кассет с пределом задержания 20 КД. Концентрирование (осаждение) бруцелл проводят натриевой солью карбоксиметилцеллюлозы. Для концентрирования (осаждения) бруцелл натриевой солью карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ) в ферментер вносят (1-2) % раствор КМЦ из расчета 0,2% сухого вещества (на 500 л культуральной жидкости - 100 л 1% раствора КМЦ или 50 л 2% раствора КМЦ). Содержание ферментера тщательно перемешивается и охлаждается до температуры (6-8)°С. Осаждение бруцелл продолжается от 3 до 5 суток. После осаждения надосадочная жидкость должна быть прозрачной. Прозрачная надосадочная жидкость после осаждения культуры декантируется в специальный реактор для обезвреживания при температуре (119-120)°С в течение 40 минут.

К 80 кг полученной бактериальной массы штамма Brucella abortus RB-51/ЩБК с содержанием клеток 10 млрд.м.кл./см³ добавляют стабилизатор, содержащий 7,5 кг сахарозы, 1,2 кг пищевого желатина и 11,3 кг дистиллированной воды, получая состав 1 при следующем соотношении компонентов, мас. %:

причем желатин замачивается в дистиллированной воде на 2 часа до полного набухания, затем к набухшему желатину добавляют сахарозу, рН стабилизатора доводят до 7,4 15% раствором едкого натрия, стерилизуя его при 116°С в течение 20 мин.

Далее получение вакцины против бруцеллеза позвоночных животных проводят аналогично известному способу, в частности состав 1 помещают в морозильную камеру при температуре минус (47-53°С) с принудительной циркуляцией воздуха в камере в течение 18-24 часов. Контроль за понижением температуры в морозильной камере и в вакцине ведется с помощью термодатчиков и вторичных приборов, записывающих показания температуры на диаграммной ленте или показывающий температуры на шкале логометров. Перед замораживанием во флаконы с вакциной помещают датчики температуры сублимационного аппарата, для контроля изменения температуры вакцин в процессе лиофилизации. После окончания процесса замораживания кассеты с вакциной, разлитой во флаконы, быстро перегружают в сублимационную установку (вакуумная, холодильная, контрольно-измерительная) проверяют и приводят в рабочее состояние согласно инструкции по эксплуатации сублимационной аппаратуры. При загрузке сублимационной камеры кроме датчика, регистрирующего изменения температуры в продукте, плотно закрывают дверь сушильной камеры, включают вакуумный насос и по достижении вакуума в камере 100-110 мкм. рт.ст. отключают охлаждение полок. В течение 6-8 часов ведут пассивный нагрев полок, используя циркуляцию в полках жидкости, устанавливают температуру 28-30°С. Продолжительность сушки 68-72 часа. Температура продукта достигает максимального значения 28-30°С, и поддерживается на этом уровне не менее 10-15 часов. По окончании сушки сублимационную камеру через стерилизующий фильтр наполняют азотом особой чистоты ГОСТ 9293-74 до уравнивания давления в сушильной камере с атмосферным. Специальным нажимным устройством в сублимационной камере флаконы с вакциной укупоривают пробкой УЛ-1, накрывают алюминиевым колпачком и обкатывают на линии «Штрунк» или на полуавтоматическом закаточном аппарате (ПЗК-1), получая целевой продукт - Вакцина 1. Готовая вакцина представляет собой сухую пористую мелкокристаллическую массу светло-коричневого или светло-желтого цвета, хорошо растворяющуюся в дистиллированной воде.

Пример 2. Для получения посевного материала и производственного культивирования бруцелл используют стерильную питательную среду на основе перевара Хоттингера, содержащую, об.%: перевар Хоттингера - 25, глицерин - 2, глюкоза - 1,5, натрия хлорид - 0,5, дрожжевой аутолизат нативный - 3,4, вода - до 100. Для получения посевного материала чистую культуру штамма Brucella abortus RB-51/ЩБК засевают в микроферментер с данной питательной средой. Концентрация посевного материала составляет 3,5 млрд.м.кл./см³. Культивируют 24 часа до накопления 35 млрд.м.кл./см³.

Производственное культивирование проводят глубинным методом в биореакторе в питательной среде того же состава. При культивировании рН поддерживают в пределах 6,9, а температуру - в пределах 36,5°С. Уровень парциального давления растворенного в культуральной жидкости кислорода составляет: с 1 по 3 час - 20 рО₂, с 3 по 6 час - 25 рО₂, с 6 по 15 час - 40 рО₂ и с 15 по 16 час - 30 pO₂. Время культивирования составляет 16 часов, накопление клеток составляет 70 млрд.м.кл./см³. По окончании культивирования бактериальную суспензию концентрируют ультрафильтрацией с использованием мембранных кассет с пределом задержания 20 КД. Концентрирование (осаждение) бруцелл проводят натриевой солью карбоксиметилцеллюлозы. Для концентрирования (осаждения) бруцелл натриевой солью карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ) в ферментер вносят (1-2) % раствор КМЦ из расчета 0,2% сухого вещества (на 500 л культуральной жидкости-100 л 1% раствора КМЦ или 50 л 2% раствора КМЦ). Содержание ферментера тщательно перемешивается и охлаждается до температуры (6-8)°С. Осаждение бруцелл продолжается от 3 до 5 суток. После осаждения надосадочная жидкость должна быть прозрачной. Прозрачная надосадочная жидкость после осаждения культуры декантируется в специальный реактор для обезвреживания при температуре (119-120)°С в течение 40 минут.

К 85 кг полученной бактериальной массы штамма Brucella abortus RB-51/ЩБК с содержанием клеток 40 млрд.м.кл./см³ добавляют стабилизатор, содержащий 10,0 кг сахарозы, 1,5 кг пищевого желатина и 3,5 кг дистиллированной воды, получая состав 1 при следующем соотношении компонентов, мас. %:

причем желатин замачивается в дистиллированной воде на 3 часа до полного набухания, затем к набухшему желатину добавляют сахарозу, рН стабилизатора доводят до 7,6 20% раствором едкого натрия, стерилизуя его при 120°С в течение 30 мин.

Далее получение вакцины против бруцеллеза позвоночных животных проводят аналогично известному способу, как и состав 1, получая целевой продукт - Вакцина 2. Готовая вакцина представляет собой сухую пористую мелкокристаллическую массу светло-коричневого или светло-желтого цвета, хорошо растворяющуюся в дистиллированной воде.

Пример 3. Для получения посевного материала и производственного культивирования бруцелл используют стерильную питательную среду на основе перевара Хоттингера, содержащую, об.%: перевар Хоттингера - 25, глицерин - 2, глюкоза - 1,5, натрия хлорид - 0,5, дрожжевой аутолизат нативный - 3,4, вода - до 100. Для получения посевного материала чистую культуру штамма Brucella abortus RB-51/ЩБК засевают в микроферментер с данной питательной средой. Концентрация посевного материала составляет 3,5 млрд.м.кл./см³. Культивируют 24 часа до накопления 35 млрд.м.кл./см³.

Производственное культивирование проводят глубинным методом в биореакторе в питательной среде того же состава. При культивировании рН поддерживают в пределах 6,9, а температуру - в пределах 36,5°С. Уровень парциального давления растворенного в культуральной жидкости кислорода составляет: с 1 по 3 час - 20 рО₂, с 3 по 6 час - 25 pO₂, с 6 по 15 час - 40 рО₂ и с 15 по 16 час - 30 рО₂. Время культивирования составляет 16 часов, накопление клеток составляет 70 млрд.м.кл./см³. По окончании культивирования бактериальную суспензию концентрируют ультрафильтрацией с использованием мембранных кассет с пределом задержания 20 КД. Концентрирование (осаждение) бруцелл проводят натриевой солью карбоксиметилцеллюлозы. Для концентрирования (осаждения) бруцелл натриевой солью карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ) в ферментер вносят (1-2) % раствор КМЦ из расчета 0,2% сухого вещества (на 500 л культуральной жидкости - 100 л 1% раствора КМЦ или 50 л 2% раствора КМЦ). Содержание ферментера тщательно перемешивается и охлаждается до температуры (6-8)°С. Осаждение бруцелл продолжается от 3 до 5 суток. После осаждения надосадочная жидкость должна быть прозрачной. Прозрачная надосадочная жидкость после осаждения культуры декантируется в специальный реактор для обезвреживания при температуре (119-120)°С в течение 40 минут.

К 80 кг полученной бактериальной массы штамма Brucella abortus RB-51/ЩБК с содержанием клеток 10 млрд.м.кл./см³ добавляют стабилизатор, содержащий 7,5 кг сахарозы, 1,2 кг пищевого желатина, 1,5 кг бета-циклодекстрина и 9,8 кг дистиллированной воды, получая состав 3 при следующем соотношении компонентов, мас. %:

причем желатин замачивается в дистиллированной воде на 2 часа до полного набухания, затем к набухшему желатину добавляют сахарозу, рН стабилизатора доводят до 7,4 15% раствором едкого натрия, стерилизуя его при 116°С в течение 20 мин.

Далее получение вакцины против бруцеллеза позвоночных животных проводят аналогично известному способу, в частности состав 3 помещают в морозильную камеру при температуре минус (47-53°С) с принудительной циркуляцией воздуха в камере в течение 18-24 часов. Контроль за понижением температуры в морозильной камере и в вакцине ведется с помощью термодатчиков и вторичных приборов, записывающих показания температуры на диаграммной ленте или показывающий температуры на шкале логометров. Перед замораживанием во флаконы с вакциной помещают датчики температуры сублимационного аппарата, для контроля изменения температуры вакцин в процессе лиофилизации. После окончания процесса замораживания кассеты с вакциной, разлитой во флаконы, подвергают лиофильному высушиванию, получая целевой продукт - Вакцина 3. Готовая вакцина представляет собой сухую пористую мелкокристаллическую массу светло-коричневого или светло-желтого цвета, хорошо растворяющуюся в дистиллированной воде.

Пример 4. Для получения посевного материала и производственного культивирования бруцелл используют стерильную питательную среду на основе перевара Хоттингера, содержащую, об.%: перевар Хоттингера - 25, глицерин - 2, глюкоза - 1,5, натрия хлорид - 0,5, дрожжевой аутолизат нативный - 3,4, вода - до 100. Для получения посевного материала чистую культуру штамма Brucella abortus RB-51/ЩБК засевают в микроферментер с данной питательной средой. Концентрация посевного материала составляет 3,5 млрд.м.кл./см³. Культивируют 24 часа до накопления 35 млрд.м.кл./см³.

Производственное культивирование проводят глубинным методом в биореакторе в питательной среде того же состава. При культивировании рН поддерживают в пределах 6,9, а температуру - в пределах 36,5°С. Уровень парциального давления растворенного в культуральной жидкости кислорода составляет: с 1 по 3 час - 20 рО₂, с 3 по 6 час - 25 рО₂, с 6 по 15 час - 40 pO₂ и с 15 по 16 час - 30 pO₂. Время культивирования составляет 16 часов, накопление клеток составляет 70 млрд.м.кл./см³. По окончании культивирования бактериальную суспензию концентрируют ультрафильтрацией с использованием мембранных кассет с пределом задержания 20 КД. Концентрирование (осаждение) бруцелл проводят натриевой солью карбоксиметилцеллюлозы. Для концентрирования (осаждения) бруцелл натриевой солью карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ) в ферментер вносят (1-2) % раствор КМЦ из расчета 0,2% сухого вещества (на 500 л культуральной жидкости - 100 л 1% раствора КМЦ или 50 л 2% раствора КМЦ). Содержание ферментера тщательно перемешивается и охлаждается до температуры (6-8)°С. Осаждение бруцелл продолжается от 3 до 5 суток. После осаждения надосадочная жидкость должна быть прозрачной. Прозрачная надосадочная жидкость после осаждения культуры декантируется в специальный реактор для обезвреживания при температуре (119-120)°С в течение 40 минут.

К 85 кг полученной бактериальной массы штамма Brucella abortus RB-51/ЩБК с содержанием клеток 40 млрд.м.кл./см³ добавляют стабилизатор, содержащий 10,0 кг сахарозы, 1,5 кг пищевого желатина, 2,0 кг бета-циклодекстрина и 1,5 кг дистиллированной воды, получая состав 4 при следующем соотношении компонентов, мас. %:

причем желатин замачивается в дистиллированной воде на 3 часа до полного набухания, затем к набухшему желатину добавляют сахарозу, рН стабилизатора доводят до 7,6 20% раствором едкого натрия, стерилизуя его при 120°С в течение 30 мин.

Далее получение вакцины против бруцеллеза позвоночных животных проводят аналогично известному способу, в частности состав 3 помещают в морозильную камеру при температуре минус (47-53°С) с принудительной циркуляцией воздуха в камере в течение 18-24 часов. Контроль за понижением температуры в морозильной камере и в вакцине ведется с помощью термодатчиков и вторичных приборов, записывающих показания температуры на диаграммной ленте или показывающий температуры на шкале логометров. Перед замораживанием во флаконы с вакциной помещают датчики температуры сублимационного аппарата, для контроля изменения температуры вакцин в процессе лиофилизации. После окончания процесса замораживания кассеты с вакциной, разлитой во флаконы, подвергают лиофильному высушиванию, получая целевой продукт - Вакцина 3. Готовая вакцина представляет собой сухую пористую мелкокристаллическую массу светло-коричневого или светло-желтого цвета, хорошо растворяющуюся в дистиллированной воде.

Пример 5. Результаты оценки иммуногенных характеристик полученных вакцин 1-4 (в соответствии с вышеприведенными примерами 1-4) с использованием культур штамма Brucella abortus RB-51/ЩБК в сравнении с вакциной-прототипом были получены при оценке ее иммуногенности после хранения вакцин в течение двух лет. Морских свинок (в каждой группе по 5 животных) иммунизируют подкожно в дозе 2,0 млрд микробов по стандарту мутности оптическому для определения концентрации микробов ОСО 42-28-85-2013, через 28 сут после иммунизации животных заражают культурой вирулентного штамма 16М В. melitensis в дозе 100 живых микробов. Иммуногенность вакцин определяют по доле незаболевших животных на основании данных бактериологического и серологического обследования через 30 сут после заражения. Доля незаболевших животных при использовании вакцин 1-4 составила 65, 70, 75 и 80%%, соответственно, а при использовании известного технического решения - 30%.

Пример 6. Испытания иммуногенных свойств вакцин 1-4 и вакцины-прототипа после сохранения их в течение 2 лет проводят на телках 8-10-месячного возраста. Телок иммунизируют подкожно в заднюю треть шеи в дозах 50-400⋅10⁹ м.к. в объеме 5 см³. Через 10 мес иммунизированных вакцинами 1-4 и вакциной-прототипа, а также контрольных (невакцинированных) телок заражают стандартной культурой контрольного вирулентного штамма Brucella abortus 54М/ВГНКИ в дозе 15-20 ИД₅₀. Через 45 дней после заражения животных убивают и проводят бактериологическое исследование внутренних органов и лимфатических узлов (60 объектов). Определяют наличие бруцелл вирулентного штамма в лимфатических узлах и органах, рассчитывают процент защиты и индекс инфицированности (процент инфицированных органов и лимфоузлов). В результате в группах животных, вакцинированных вакцинами 1-4, полученными согласно примерам 1-4 описания) доля незаболевших животных составила 65, 70, 75 и 80%%, соответственно, в то время как при использовании вакцины-прототипа индекс инфицированности составил 20%. В контрольной группе невакцинированных телок индекс инфицированности составил 100%.

Таким образом, вакцина из штамма Brucella abortus RB-51/ЩБК сроком хранения в течение двух лет защищает от заражения высоковирулентной культурой бруцелл 65-80% иммунизированных животных, в то время как аналогичный препарат из штамма Brucella abortus №19 только 20-30%. Использование культуры штамма бактерий Brucella abortus RB-51/ЩБК в биологической промышленности позволит получить высокоэффективные биопрепараты для профилактики бруцеллеза позвоночных животных с увеличенным в два раза сроком хранения вакцин.