ВНК-21/13-02-перевиваемая монослойно-суспензионная сублиния клеток почки новорожденного сирийского хомячка, предназначенная для репродукции вируса ящура и вируса бешенства

3.2.4.1. Область техники, к которой относится изобретение

Область биотехнологии, сфера суспензионного культивирования перевиваемых культур клеток ВНК-21.

3.2.4.2. Уровень техники

Характеристика аналогов изобретения

Перевиваемая линия клеток почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21 клон 13, полученная в 1961 году в Англии Максферсоном и Стокером /Macpherson J, Stoker M. - Syrian hamster fibrolast cell line BHK-21 snd its derivatives. - Nature, 1964, 203, 1355-1357/, распространилась по всему Миру.

Из литературных данных /С.Г. Юрков, В.В. Зуев и др. "Каталог коллекции клеточных культур ВНИИВВиМ" - Покров. -2000 г. – стр. 59-63/ в нашей стране имеются клетки ВНК-21, поступившие из Англии, Франции, Мексики, США, Швеции и подученные в отечественных профильных учреждениях.

Известны следующие аналоги клеток почки хомячка:

1. ВНК-21/13 - сублиния перевиваемых клеток почки новорожденного сирийского хомячка, полученная в Институте полиомиелита;

2. ВНК21/13 - сублиния перевиваемых клеток почки новорожденного сирийского хомячка, полученная в НИИС;

3. ВНК-21/2-17а - перевиваемый монослойно-суспензионный клон клеток, получен во ВНИЯИ (прототип).

ХАРАКТЕРИСТИКА АНАЛОГОВ

1. ВНК-21/13 - сублиния перевиваемых клеток почки новорожденного сирийского хомячка, поддерживалась в Институте полиомиелита и вирусных энцефалитов АМН СССР /С.Г. Юрков, В.В. Зуев и др. "Каталог коллекции клеточных культур ВНИИВВиМ" - Покров. - 2000 г. – стр. 60/.

Среда культивирования. Адаптирована к выращиванию в пристеночных культурах. Клетки отделяют от стекла с помощью 0,25% раствора трипсина, подогретого до 37°С.

Ростовые свойства. При пересеве с коэффициентом 1:2-1:3 монослой формируется на 2-3 сутки после эксплантации. При условии коррекции рН среды до 7,5-7,6 сформированный монослой сохраняется до 5-6 дней. В литровом матрасе РУ накапливается 40-45 млн клеток.

Морфология. Клетки фибробластоподобные.

Кариология. Культура резко гетероплоидная с вариабельностью хромосомных наборов от 32 до 78. Стволовую линию (модальный класс) составляют клетки с 40 хромосомами (32-34%), 4-6% клеток в популяции сохраняют диплоидный набор хромосом.

Среда замораживания. Среда культивирования (90%), диметил-сульфоксид (10%).

Восстановление после хранения в жидком азоте. Жизнеспособность в пределах 85-95%. Культуры восстанавливают исходные ростовые свойства на 2-3 пассаже.

2. ВНК21/13 - сублиния перевиваемых клеток почки новорожденного сирийского хомячка, получена в НИИС /С.Г. Юрков, В.В. Зуев и др. "Каталог коллекции клеточных культур ВНИИВВиМ" - Покров. - 2000 г. – стр. 61/.

Среда культивирования. Для суспензионного выращивания применяют среду Игла-MEM, обогащенную 120 мг/л серина и 610 мг/л глутамина, с добавлением 0,25% ГЛА и 10% сыворотки крови КРС. При пристеночном культивировании употребляют среду Игла MEM (90%) и сыворотку КРС (10%) рН 7,5-7,6.

Способ поддержания. Поддерживается в суспензионных условиях в реакторах различной емкости. Сохранила способность расти в пристеночных культурах. В этом случае при очередном пассировании клеточный пласт диспергируют 0,25% раствором трипсина, подогретого до 37°С.

Ростовые свойства. В суспензионной культуре при посеве в концентрации 500 тыс клеток на мл обеспечивает 3-4-кратный прирост популяции на 3-4 сутки роста. При коэффициенте пересева 1:3 монослой формируется в пристеночных культурах на 2-3 сутки после посева и переживает не более 3-х дней.

Морфология. Клетки эпителиоподобные.

Кариология. Популяция гетероплоидная с разбросом числа хромосом в клетках от 20 до 78. Модальный класс составляют клетки с диплоидным набором хромосом (16-24%).

Среда замораживания. Ростовая среда (90%), диметилсульфоксид (10%).

Восстановление после хранения в жидком азоте. Жизнеспособность на уровне 88-96%. Культуры восстанавливаются на 1-2 пассаже.

Характеристика прототипа, выбранного заявителем:

3. ВНК-21/2-17а - перевиваемый монослойно-суспензионный клон клеток /С.Г. Юрков, В.В. Зуев и др. "Каталог коллекции клеточных культур ВНИИВВиМ" - Покров. - 2000 г. – стр. 62/ получен во ВНИЯИ и хранится в жидком азоте на уровне 13 пассажа.

Среда культивирования. 0,25% мышечный гидролизат на растворе Эрла (для монослойных культур) и раствор Хенкса для суспензионного культивирования с добавлением 5 аминокислот (аргинин, глутамин, метеонин, цистин, серин), согласно прописи модифицированной среды Игла и 8 витаминов группы В, сыворотка КРС (5%), рН среды 6,8-7,2.

Способ поддержания. Суспензионную культуру выращивают объемно-доливным методом. Монослойную культуру в пристеночных сосудах любой емкости. При очередном пересеве применяют смесь 0,25% трипсина и 0,02% раствора версена в соотношении 1:1.

Ростовые свойства. Через 48 часов культивирования в суспензии культура дает 6-7 кратный прирост, достигая конечной концентрации 2,3-2,8 млн/мл. При выращивании в монослое при посевной концентрации 50-100 тыс клеток на мл среды монослой образуется на 2-3 сутки роста.

Морфология. В суспензии культура представлена одиночными блестящими, округлыми клетками. В монослое популяция состоит из фибробластоподобных клеток с прозрачной гомогенной цитоплазмой.

Кариология. Культура гетероплоидная. Модальный класс представлен клетками с 42 хромосомами, составляющими в популяции 28-40%.

Среда замораживания. Ростовая среда (90%), диметилсульфоксид (10%).

Восстановление после хранения в жидком азоте. Жизнеспособность 85-90%, клетки восстанавливают морфологию и ростовые свойства на 2-3 пассаже.

Чувствительность к вирусам. Культура клеток чувствительна к вирусу ящура типа А, О, С, Азия.

3.2.4.3. Раскрытие изобретения

(1) Сведения, раскрывающие сущность изобретения.

1.2. Задача, на решение которой направлено заявляемое изобретение.

Культура клеток ВНК-21/13-02 предназначена для репродукции в промышленных условиях вируса ящура типа А, О, С, Азия, вируса бешенства шт. "Щелково-51", используемых для изготовления противовирусных вакцин против ящура и бешенства.

Клетки ВНК-21/13-02 характеризуются высокой чувствительностью к вирусу ящура, который накапливается в количестве 7,01 g ТЦД_50/мл, при содержании иммуногенного компонента до 1 млг/мл, а также чувствительностью к вирусу бешенства, обеспечивая титр инфекционности 6,5 ЛД_50/мл.

Сущность изобретения

"ВНК-21/13-02 - перевиваемая монослойно-суспензионная сублиния клеток почки новорожденного сирийского хомячка", адаптированная к суспензионному способу выращивания с использованием питательной среды для суспензионного выращивания на основе солевого раствора Хенкса, содержащая 5-7% сыворотки, 0,125% гидролизата мышечных белков и 0,125% гидролизата лактальбумина с добавлением пяти аминокислот: 1-аргинина 0,042 гр/л; 1-глутамина 0,584 гр/л; 1-тирозина 0,02 гр/л; 1-триптофана 0,015 гр/л; 1-цистина 0,032 гр/л и семи витаминов группы В: холин-хлорид 0,0034, пантотенат кальция (B₅) 0,0034, пиридоксаль НСl 0,0034, тиамин (B₁) 0,0034, мезо-инозит 0,0068, никотинамид (РР) 0,0034, рибофлавин (B₂) 0,00034, фолиевая кислота (B₉) 0,0034.

ВНК-21/13-02 депонирована в Российской коллекции клеточных культур (РКК) (СЖК РАСХН) при Всероссийском научно-исследовательcком институте экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко.

Происхождение.

Перевиваемая линия клеток ВНК-21 клон 13 поступила на Щелковский биокомбинат из Всероссийского научно-исследовательского и технологического института биологической промышленности (ВНИиТИБП), который получил эту линию из лаборатории цитологии Московского научно-исследовательского института вирусных препаратов в 1972 г.

Морфология.

В суспензии культура представлена одиночными округлыми клетками с небольшим количеством конгламератов, содержащих от 3 до 5 клеток. В монослое популяция состоит из фибробластоподобных клеток с прозрачной гомогенной цитоплазмой, иногда образуется единый цитоплазматический пласт без границ между клетками, с наличием большого количества ядер. Отмечается присутствие 2-3-4 и более ядерных симпластов, лежащих изолировано или в структуре клеточного пласта. Также отмечается отпочковывание ядер от общей ядерной массы и формирование микроядер в результате разрушения ядра. Часть клеток отделяется от стекла и растет в суспензии.

Способ культивирования

Монослой клеток ВНК-21/13-02 выращивают в матрацах любой емкости. Для диспергирования клеточного пласта при пересевах используют смесь 0,25%-ного раствора трипсина и 0,02%-ного версена в соотношении 1:9 при температуре 37°С. Клетки снимают бесцентрифужным методом и ресуспендируют в ростовой среде до посевной концентрации.

В суспензии культуру клеток выращивают отъемно-доливным способом в течение 48 часов до 10-50 последовательных пассажей.

Условия культивирования

Суспензионное культивирование проводят в реакторах емкостью 4-40-100-600 литров с рабочим объемом 3-30-60-450 литров соответственно при следующих параметрах:

- посевная концентрация 0,4-0,5⋅10⁶ кл/мл;

- скорость перемешивания 25-40 об/мин;

- температура культивирования 36,0-36,5°С;

- рН среды в пределах 6,6-7,1;

- аэрация путем барботирования воздухом 0,5-1,5 л/л среды;

Индекс пролиферации при суспензионном культивировании равняется 6-8, достигая концентрации к 48 часам 4⋅10⁶ кл./мл при жизнеспособности 95-99%.

Пассаж: 32 пассажа в роллерном монослое, 13 пассажей в суспензии. Клеточная суспензия расфасована в ампулы по 2 см³ с концентрацией 7⋅10⁶ кл/мл.

Кариологическая характеристика: кариотип суспензионной культуры клеток ВНК-21/13-02 соответствует кариотипу сирийского хомячка, размах варьирования числа хромосом на клетку от 31 до 80, модальный класс (36%) составляют клетки, содержащие 42 хромосомы. В монослойной культуре количество хромосом на одну клетку варьирует от 31 до 98, модальный класс (22%) составляют клетки с числом хромосом, совпадающим с диплоидным (n=44).

Видовая идентичность.

Культура идентифицирована как ткань почки сирийского хомячка.

Криоконсервация, жизнеспособность после консервации.

Для длительного хранения (-196°С) используют ампулы, при хранении (-70°С) - флаконы. Консервирование клеток проводят в питательной среде (73%), сыворотке (20%), криопротектор диметилсульфоксид (7%). Замораживание суспензии клеток по 2-х ступенчатому режиму понижения температуры от 0 до минус 30°С со скоростью 1°С в минуту, от минус 30°С до минус 70°С со скоростью 4-6°С в минуту. Охлажденные до минус 70°С ампулы с суспензией клеток помещают на хранение в сосуды Дьара с жидким азотом -196°С, предварительно подержав ампулы в парах азота. Жизнеспособность клеток после консервации 85-97%.

3.2.4.5. Осуществление изобретения

Описание способа получения линии клеток.

В качестве исходного материала использовали перевиваемую линию клеток ВНК-21 клон 13, поступившую на Щелковский биокомбинат из Всероссийского научно-исследовательского и технологического института биологической промышленности (ВНИиТИБП), который получил эту линию из лаборатории цитологии Московского научно-исследовательского института вирусных препаратов в 1972 г.

Адаптацию клеток к суспензионным условиям культивирования проводили в биоферментере MD-300 фирмы "MARUBISHI" (Япония) с автоматическим поддержанием концентрации водородных ионов (рН 6,9-7,0), температуры (37°С), ручным регулированием подачи воздуха и скорости перемешивания (до 100 об/мин). Культивирование проводили используя питательную среду на основе раствора Хенкса, содержащей 0.25% суммы гидролизатов лактальбумина и мышечных белков, 7% сыворотки кр.рог. скота, пяти аминокислот и витаминов группы В.

В первых трех пассажах отмечали некоторое уменьшение численности популяции к концу культивирования, что требовало увеличить засевную концентрацию клеток до 500 тыс/мл. Последующие пять пассажей клетки росли с образованием довольно значительных клеточных конгламератов, появлением зернистости в цитоплазме. При дальнейшем пассажировании, с 9-го по 13 пассаж, число конгламератов уменьшалось, цитоплазма становилась прозрачной и гомогенной. Посадочную концентрацию снизили до 200 тыс/мл, популяция клеток в суспензии увеличивалась в 6-7 раз, время генерации составило 48 часов.

После проведения 13 пассажей в суспензии были получены клетки, отличающиеся однообразием морфологии и размера, с небольшим количеством конгламератов и высокой пролиферативной активностью (индекс пролиферации составил 5-7). Консервирование клеток осуществили в криосреде (ростовая среда - 73%, сыворотка - 20%, диметилсульфоксид - 7%), в ампулах по 2 мл с концентрацией 7 млн.кл./мл. Замораживание проводили по двухступенчатому режиму понижения температуры от 0 до -30°С со скоростью 1°С/мин и от -30 до -70°С со скоростью 4°С/мин. Охлажденные до -70°С ампулы с суспензией клеток поместили на хранение в сосуд Дъюара с жидким азотом (-196°С), предварительно выдержав их в парах азота. Жизнеспособность клеток после консервации составила 98%.

Культура клеток прошла контроль на стерильность согласно ГОСТ 28085-89 "Препараты биологические. Метод бактериологического контроля стерильности".

Данные кариологического анализа, проведенного методом Moorhead P.S. et al. 1960 г., адаптированной суспензионной культуры клеток ВНК-21/13-02 соответствуют кариотипу сирийского хомячка, размах варьирования числа хромосом на клетку от 31 до 80, модальный класс (36%) составляют клетки, содержащие 42 хромосомы.

В монослойной культуре количество хромосом на одну клетку варьирует от 31 до 98, модальный класс (22%) составляют клетки с числом хромосом, совпадающим с диплоидным (n=44).

Полученный трофовариант клеток ВНК-21/13-02 отличается высокой пролиферативной активностью. Концентрация клеток, выращенных в среде, содержащей 0,25% гидролизата и 7% сыворотки, составила 1,5-3,0 млн.кл./мл. в биореакторах промышленных объемов.

ВНК-21/13-02 депонирована в Российской коллекции клеточных культур (РКК) в специализированной коллекции перевиваемых соматических клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных при Всероссийском научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко (СХЖ РАСХН).

Адрес коллекции: 109428, г. Москва, Рязанский проспект 24, корпус 1.

Линии клеток присвоен коллекционный номер: №61.

Дата депонирования: 20 мая 2004 г.