Результат интеллектуальной деятельности: ШТАММ "PCV2/SHBC" ЦИРКОВИРУСА СВИНЕЙ ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА ПРОФИЛАКТИЧЕСКИХ И ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ

Изобретение относится к области ветеринарии, ветеринарной биотехнологии и касается применения штамма цирковируса свиней 2 типа для производства профилактических и диагностических препаратов, используемый в научно-исследовательских институтах и предприятиях биологической промышленности при конструировании биопрепаратов, в частности вакцин против цирковируса свиней 2 типа и контроля их иммуногенности, а также изготовления антигенов для диагностических наборов.

Цирковирус свиней (PCV) является мелким икосаэдрическим безоболочечным вирусом, который содержит одноцепочечный кольцевой ДНК-геном с размером примерно 1,76 т.п.н. Он был первоначально выделен в качестве контаминанта клеточной культуры линии клеток почки свиньи РК-15 (I. Tischer et al., Nature 295: 64-66 (1982); I. Tischer et al., Zentralbl. Bakteriol. Hyg. Otg. A. 226 (2): 153-167 (1974)). PCV классифицируют в семейство Circoviridae, которое состоит из трех других цирковирусов животных (вирус анемии кур (CAV), вирус болезни клюва и перьев попугаев (PBFDV) и недавно обнаруженный голубиный цирковирус (CoCV) из голубей) и трех цирковирусов растений (вирус кустистости верхушки банана, вирус увядания листьев кокосовой пальмы и вирус карликовости подземного клевера) (M.R. Bassami et al., Virology 249: 453-459 (1998); J. Mankertz et al., Virus Genes 16: 267-276 (1998); A. Mankertz et al., Arch. Virol. 145: 2469-2479 (2000); B.M. Meehan et al., J. Gen. Virol. 78: 221-227 (1997); B.M. Meehan et al., J. Gen. Virol. 79: 2171-2179 (1998); D. Todd et al., Arch. Virol. 117: 129-135 (1991)). Члены трех ранее идентифицированных цирковирусов животных (PCV, CAV и PBFDV) не имеют гомологии нуклеотидных последовательностей или антигенных детерминант между собой (M.R. Bassami et al., 1998, выше; D. Todd et al., 1991, выше). Экспериментальное инфицирование свиней вирусом PCV, полученным из клеток РК-15, не вызывает клинического заболевания, и поэтому этот вирус не считается патогенным для свиней (G.M. Allan et al., Vet. Microbiol. 44: 49-64 (1995); I. Tischer et al., Arch. Virol. 91: 271-276 (1986)). Этот непатогенный PCV, полученный из зараженной клеточной линии РК-15, обозначили как свиной цирковирус типа 1 или PCV.

Синдром послеотъемного мультисистемного истощения (PMWS, postweaning multisystemic wasting syndrome), впервые описанный в 1991 г. (J.C. Harding and E.G. Clark, Swine Health and Production 5: 201-203 (1997)), представляет собой комплексное заболевание отъемных поросят, которое становится все более распространенным. PMWS в основном поражает свиней в возрасте 5-18 недель. Клинические признаки PMWS включают в себя прогрессирующую потерю массы тела, одышку, учащенное дыхание, анемию, диарею и желтуху. В Великобритании уровень смертности может варьировать от 1-2% до 40% в некоторых осложненных случаях (М. Muirhead, Vet. Rec. 150: 456 (2002)). Микроскопические поражения, характерные для PMWS, включают в себя гранулематозную интерстициальную пневмонию, лимфаденопатию, гепатит и нефрит (G.M. Allan and J.A. Ellis, J. Vet. Diagn. Invest. 12: 3-14 (2000); J.C. Harding and E.G. Clark, Swine Health and Production 5: 201-203 (1997)).

Хотя PCV1 является повсеместным у свиней, он не является патогенным для свиней. Первичным причиной PMWS обычно является патогенный штамм PCV, обозначенный как свиной цирковирус типа 2 или PCV2 (G.M. Allan et al., Vet. Rec. 142: 467-468 (1998); G.M. Allan et al., J. Vet. Diagn. Invest. 10:3-10 (1998); G.M. Allan et al., Vet. Microbiol. 66: 115-23 (1999); G.M. Allan and J.A. Ellis, J. Vet. Diagn. Invest. 12: 3-14 (2000); J. Ellis et al. Can. Vet. J. 39: 44-51 (1998); A.L. Hamel et al., J. Virol. 72: 5262-5267 (1998); B.M. Meehan et al., 1998, выше; I. Morozov et al., J. Clin. Microbiol. 36: 2535-2541 (1998)). Была определена полная геномная последовательность PMWS-ассоциированного PCV2 (М. Fenaux et al., J. Clin. Microbiol. 38: 2494-503 (2000); A.L. Hamel et al., 1998; J. Mankertz et al., 1998; B.M. Meehan et al., 1997; B.M. Meehan et al., 1998; I. Morozov et al., 1998). Вирусные штаммы, выделенные из тканевого образца, особенно из пораженного болезнью участка, из свиньи, имеющей синдром PMWS, можно размножать на клеточных линиях, особенно таких, как клеточные линии почек свиней, в частности клетки РК-15, свободные от контаминации (в частности, для PCV, а также для пестивирусов, аденовирусов свиней и парвовирусов свиней), с целью их размножения и особенно с целью продуцирования ими антигена, целого (например, вируса) и/или его субъединиц (например, полипептидов).

Существует необходимость в вакцине, которая защищает свиней от заболеваний, связанных с PCV2.

Целью настоящего изобретения является получение нового производственного вирулентного штамма цирковируса свиней для производства профилактических и диагностических препаратов, выделенного в Российской Федерации и обладающего стабильными культуральными свойствами и высокой биологической и антигенной активностью, для конструирования биопрепаратов, в частности вакцин против цирковируса свиней и контроля их иммуногенности, а также изготовления антигенов для диагностических наборов.

Поставленная цель достигается получением штамма «PCV2/SHBC» цирковируса свиней, семейства circoviridae, депонированного в Государственной коллекции вирусов Института вирусологии Федерального государственного бюджетного учреждения «Федеральный научно-исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» под №2845, для производства профилактических и диагностических препаратов (см. приложение - удостоверение). Вирус выделен из суспензии клеток селезенки свиньи в 2015 году в частном хозяйстве Владимирской области. Штамм является новым, ранее неизвестным, выделен в Российской Федерации. Прошел 5 пассажей на культуре клеток почки свиньи РК-15.

Штамм «PCV2/SHBC» цирковируса свиней - ДНК-содержащий вирус, семейства, рода circovirus, вид - цирковирус свиней 2 типа (PCV2).

До настоящего времени неизвестны выделенные в России изоляты эпизоотического вируса PCV2, гомологичного вируса для изготовления диагностических и вакцинных препаратов.

Новый штамм «PCV2/SHBC» характеризуется следующими признаками и свойствами.

Морфологические свойства. Форма - икосаэдрическая. Безоболочечный вирус. Полный геном ЦВС-2, представленный одноцепочечной кольцевой ковалентно-замкнутой минус-ДНК молекулой, длиной 1768 нуклеотидов. Размер вириона: 16,8-20,7 нм.мл.

Культуральные свойства. Штамм размножается в перевиваемых линиях клеток почки свиньи РК-15.

Инфекционная активность. Биологическую активность полученных материалов определяют путем титрования на культуре клеток с помощью иммунофлюоресцентного или иммунопероксидазного анализа, титр вируса рассчитывают по методу Рида и Менча и выражают в lgТЦИД₅₀/см³. Накопление вируса штамма «PCV2/SHBC» в зависимости от культуральной системы, множественности заражения и длительности культивирования составляет 5,0-7,0 lg ТЦИД₅₀/см³.

Патогенность для животных. Штамм «PCV2/SHBC» патогенен для свиней. Передается контактным путем, через инфицированные объекты, воздушно-капельным путем.

Антигенные свойства. Вирус штамма «PCV2/SHBC» стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой. При вакцинации антиген штамма «PCV2/SHBC» индуцирует образование специфических антител, выявляемых в иммуноферментном анализе (ИФА). Вирусоспецифические антигены, общие для всех серотипов вируса цирковируса свиней 2 типа (PCV2), выявляются с помощью иммунофлюоресцентного или иммунопероксидазного анализа или ИФА.

Сущность изобретения поясняется следующими примерами.

Пример 1. Накопление вируса в культуре клеток почки свиньи РК-15.

В табл. 1 приведены сведения по культивированию штамма «PCV2/SHBC» цирковируса свиней в монослое культур клеток почки свиньи РК-15.

Как следует из табл. 1, титры выделенного вируса в культуре клеток почки свиньи РК-15 на уровне пятого пассажа составляют 6,0-7,0 lg ТЦИД₅₀/см³, что обеспечивает возможность приготовления сырья для инактивированной вакцины.

Пример 2. Приготовление культурального специфического антигена штамма «PCV2/SHBC» цирковируса свиней.

Все исследования по получению вируссодержащего сырья выполняют на клеточных культурах почки свиньи РК-15, для которых было известно, что они не заражены цирковирусом свиней (PCV), пестивирусами, аденовирусами свиней и парвовирусами свиней (Allan G. et al., Pathogenesis of porcine circovirus experimental infections of colostrum-deprived piglets and examination of pig foetal material. Vet. Microbiol. 1995, 44, 49-64).

Полуконфлюэнтный монослой культуры клеток почки свиньи РК-15 в количестве 10 л с концентрацией клеток 0,7-1,0 млн кл/см³ заражают вирусом штамма «PCV2/SHBC» цирковируса свиней с множественностью заражения 0,01 ТЦИД₅₀/мл. Питательная среда - ДМЕМ с добавлением 5% фетальной сыворотки крупного рогатого скота. После 18-20 часовой инкубации монослой клеток обрабатывают 300 мМ D-глюкозамина. Вирус культивируют при (37,0±0,5)°С, поддерживая рН среды в пределах 7,0-7,4 в течение 92-96 часов.

После этого культуральные сосуды подвергают трем последовательным циклам замораживания/оттаивания. Полученный вирус освобождают от клеточного детрита центрифугированием при 1000 об/мин в течение 20 минут. Очищенная от детрита суспензия должна иметь вид прозрачной жидкости розовато-вишневого цвета. Полученный вирус контролируют на инфекционную активность и подвергают инактивации β-пропиолактоном. Для полной инактивации штамма вируса оптимальной является концентрация β-пропиолактона - 0,025-0,05% при 4°С. 300 мкл β-пропилактона вносят в каждые 1000 мл вирусной суспензии, выдерживают 20 ч при температуре 4°С, затем вносят еще 300 мкл β-пропилактона и выдерживают еще 20 часов.

Полноту инактивации антигена проверяют в 3-х последовательных пассажах в чувствительной культуре клеток РК-15. Полученный антиген не содержит остаточной инфекционности, обладает высокой специфичностью и активностью в ИФА (1:1600-1:3200). В работе используют набор ИФА производства Испания: «INgezim PCV DAS MUESTRA: Virus culture samples : Double Antibody Sandwich ELISA DETECTA: PCV antigen 11.CIR.K.2» для количественной оценки капсидного антигена цирковируса свиней 2 типа в вирусном сырье, содержание которого определяет иммуногенные свойства вируса в составе вакцины. Набор ИФА «INGEZIM PCV DAS…», каталожный номер продукта: 11.CIR.K2 - это сэндвич-иммуноанализ методом двойной системы антител для контроля вирусной нагрузки (цирковируса свиней типа II) в вакцинах посредством титрования.

Пример 3. Получение инактивированного культурального вируссодержащего сырья из штамма «PCV2/SHBC» цирковируса свиней с применением роллерного метода культивирования.

Вакцину против цирковируса свиней 2 типа инактивированную эмульсионную готовят из посевной расплодки вируса штамма «PCV2/SHBC», выращенного в перевиваемой культуре клеток РК-15 2-3-суточного возраста с концентрацией более 100000 кл/см³. Посевной вирус считается пригодным для наработки вирусного сырья, если он соответствует следующим требованиям: титр инфекционности после репродукции в монослое клеток РК-15 не менее 4,0 lg ТЦИД₅₀/см³, рН 7,2-7,4 и при отсутствии контаминации.

Монослой клеток почки свиньи РК-15 диссоциируют посредством трипсинизации (смесью трипсина и версена) из конфлюэнтных (сливающихся) культур, а затем переносят в среду ДМЕМ, содержащую 5% фетальной телячьей сыворотки, не загрязненную пестивирусом (среда ДМЕМ), с конечной концентрацией около 400000 клеток на 1 см³. Фракции этой суспензии аликвотами по 100 см³ смешивают с 20-миллилитровыми аликвотами фракций матровой расплодки вируса штамма «PCV2/SHBC» и окончательную смесь после предварительной выдержки в течение 2-3 часов при температуре 37°С для адсорбции вируса переносят в роллерные сосуды для репродукции вируса. Добавляют питательную среду ДМЕМ с 5% фетальной сыворотки и антибиотиком (гентамицин в концентрации 50 мкг/мл или его аналоги) и затем инкубируют при температуре 37°С в течение 18-20 часов в атмосфере СО₂.

После инкубации культуральную среду полуконфлюэнтных монослоев обрабатывают 300 мМ D-глюкозамина (Cat. № G48175, Sigma-Aldrich Company Limited, Poole, UK) (Tischr I. et al., Arch. Virol., 1987, 96, 39-57), затем продолжают инкубацию еще в течение 76-92 часов при температуре 37°С. После этой последней инкубации роллерные сосуды подвергают трем последовательным циклам замораживания/оттаивания. Полученный вирус освобождают от клеточного детрита центрифугированием при 1000 об/мин в течение 20 минут. Очищенная от детрита суспензия должна иметь вид прозрачной жидкости розовато-вишневого цвета. Полученный вирус контролируют на инфекционную активность.

Производственная серия вируса штамма «PCV2/SHBC» считается пригодной для изготовления вакцинных препаратов, если она соответствует следующим требованиям: титр инфекционности после репродукции в монослое клеток РК-15 не меньше 4,0 lg ТЦИД₅₀/см³, рН 7,2-7,4 и при отсутствии контаминации. Очищенную вируссодержащую суспензию подвергают инактивации. Инактивацию вируса PCV2 штамма «PCV2/SHBC» ведут как описано в Примере 2.

Эмульсионную вакцину готовят путем смешивания культурального инактивированного сырья - штамма «PCV2/SHBC» цирковируса свиней и масляного адъюванта по инструкции производителя адъюванта. В качестве масляного адъюванта используют препарат фирмы «Seppic» (Франция) под торговой маркой «Montanide ISA-201» или его аналоги.

К полученному таким образом инактивированному сырью добавляют масляный адъювант - остальное до 100%, тщательно перемешивают, и получают вакцину при следующем соотношении компонентов, масс %:

Культуральное инактивированное сырье:

Приготовленная таким образом вакцина представляет собой эмульсию бледно-розового цвета.

Полученную вакцину фасуют в стеклянные флаконы и контролируют в соответствии с СТО на стерильность, безвредность и антигенную активность.

Вакцину проверяют на стерильность посевом на следующие питательные среды: МПБ, МПА, МППБ, среду Сабуро и тиогликолевую среду. Во всех случаях роста микрофлоры не отмечается.

Для оценки антигенной активности вакцину вводят серонегативным к PCV2 четырем поросятам-отъемышам с соблюдением правил асептики и антисептики внутримышечно в область шеи за ухом в объеме 2,0 см³. До иммунизации и через 21 день после вакцинации от животных отбирают кровь и сыворотку исследуют на наличие вируснейтрализующих антител в ИФА с использованием диагностического набора «ИФА тест-набор для определения антител к Цирковирусу свиней PCV2» («Semi-quantitative ELISA for detection of all antibodies induced by the different Porcine Circovirus type 2 strains») производства «BioChek» (Нидерланды), согласно инструкции производителя. Учет результатов наличия антител к PCV2 в лаборатории проводят по оценке отношения S/P (исследуемый образец/позитивное отношение), используя при спектрофотометрии длину волны 405 нм. Расчет S/P производят по формуле, указанной в инструкции производителя. Образцы с отношением S/P равным или более 0,500 содержат антитела к PCV2 и считаются позитивными.

Результаты исследований свидетельствуют о том, что до иммунизации в сыворотках крови подсвинков антител к вирусу PCV2 не было выявлены, а через 21 день после вакцинации во всех 4 пробах выявляли специфические антитела - отношение S/P значительно превышала 0,5 (от 1,398 до 2,026).

Таким образом, полученная вакцина инактивированная эмульсионная из штамма «PCV2/SHBC» является стерильным, безвредным препаратом и обладает достаточной антигенной активностью. Однократное введение вакцины обеспечивает высокий уровень антител в сыворотке крови у привитых животных.