Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ СУММЫ ФЛАВОНОИДОВ В ЛИСТЬЯХ ОРЕХА ГРЕЦКОГО

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и может быть использовано в центрах контроля качества лекарственных средств и контрольно-аналитических лабораториях при проведении количественного определения суммы флавоноидов в листьях ореха грецкого (Juglans regia L.).

В настоящее время, система контроля качества лекарственных препаратов требует постоянного усовершенствования подходов к стандартизации биологически активных соединений (БАС) с использованием современных методов анализа и актуальных данных об их физико-химических, спектральных и фармакологических свойствах. Полученные данные позволяют объективно и селективно определять содержание целевых соединений (1).

Орех грецкий (Juglans regia L.) - вид деревьев семейства Орех (Juglandaceae). Данный представитель рода Орех (Juglans L.) недостаточно изучен по сравнению с другими видами, но является перспективным видом официнального лекарственного растительного сырья, препараты которого оказывают противомикробное, общеукрепляющее действие (2).

Обзор литературы показал возможность стандартизации листьев ореха грецкого при проведении количественного определения суммы нафтохинонов методом фотоколориметрии в пересчете на юглон. Извлечение получали методом двухкратной экстракции 20% этиловым спиртом с последующим упариванием, и трехкратной экстракцией диэтиловым эфиром. При этом определено, что содержание нафтохинонов в листьях ореха грецкого достигает 0,083%±0,002% в пересчете на юглон. Принимая во внимание достаточную трудоемкость в ходе проведения пробоподготовки (пятикратная экстракция сырья), сложность проведения анализа для нафтохинонов в качестве целевой группы БАС (большой объем вспомогательных операций, в том числе по экстракции, упариванию, фильтрованию), а также отсутствие литературных данных относительно стандартизации листьев ореха грецкого (Juglans regia L.) по содержанию флавоноидов, актуальным является продолжение исследований в этом направлении (3).

Кроме того, известен способ количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на рутин в листьях гинкго двулопастного с использованием дифференциальной спектрофотометрии (4). Данная методика включает такие стадии, как экстракцию сырья 70% этиловым спиртом, реакцию комплексообразования с хлоридом алюминия, измерение оптической плотности электронного спектра испытуемого раствора при аналитической длине волны 406 нм и расчет содержания суммы флавоноидов на основе значений оптической плотности комплекса государственного стандартного образца рутина с алюминием хлоридом. Данный метод взят нами в качестве прототипа для разработки метода количественного определения листьев ореха грецкого.

Таким образом, целью изобретения является разработка способа количественного определения суммы флавоноидов в листьях ореха грецкого, обладающего более высокой специфичностью и точностью.

Техническим результатом является создание способа количественного определения суммы флавоноидов в листьях ореха грецкого в пересчете на рутин.

Технический результат достигается тем, что экстракцию сырья осуществляют однократно, в качестве экстрагента используют этиловый спирт в концентрации 80% в соотношении «сырье-экстрагент» - 1:30, время экстракции - извлечение на кипящей водяной бане в течение 30 мин, степень измельчения сырья - 2 мм, реакция комплексообразования с хлоридом алюминия в течение 40 мин. Количественное определение суммы флавоноидов в листьях ореха грецкого проводят при длине волны 412 нм в пересчете на рутин; содержание суммы флавоноидов (X в процентах) в пересчете на рутин и абсолютно сухое сырье вычисляют по формуле:

где D - оптическая плотность испытуемого раствора;

D_o - оптическая плотность раствора Государственного стандартного образца рутина;

m - масса сырья, г;

m_o - масса Государственного стандартного образца рутина, г;

W - потеря в массе при высушивании, %.

В случае отсутствия стандартного образца рутина для расчета целесообразно использовать теоретическое значение удельного показателя поглощения при 412 нм - 240:

где D - оптическая плотность испытуемого раствора;

m - масса сырья, г;

m_o - масса ГСО рутина, г;

240 - удельный показатель поглощения ГСО рутина при 412 нм;

W - потеря в массе при высушивании в процентах.

При изучении спектральных характеристик было выявлено, что именно рутин определяет характер кривой поглощения водно-спиртового извлечения из листьев ореха грецкого. Определено, что в УФ-спектре водно-спиртового извлечения ореха грецкого наблюдается батохромный сдвиг длинноволновой полосы флавоноидов - Фигура 1 (Приложение 1), как и в случае рутина - Фигура 2 (Приложение 2), где кривая 1 на фигуре 1 и фигуре 2 демонстрирует исходный раствор водно-спиртового извлечения из листьев ореха грецкого или исходный раствор рутина соответственно, а кривая 2 - раствор водно-спиртового извлечения из листьев ореха грецкого в присутствии алюминия хлорида или раствор рутина в присутствии алюминия хлорида соответственно.

Изучение УФ-спектров фигуры 2 (где кривая 1 - раствор рутина, а кривая 2 - раствор рутина с добавлением алюминия хлорида) показало, что раствор ГСО рутина в присутствии алюминия хлорида имеет максимум поглощения при длине волны 412 нм. В УФ-спектре водно-спиртового извлечения из листьев ореха грецкого в дифференциальном варианте на фигуре 3 (приложение 3) обнаруживается при длине волны 412 нм максимум поглощения, который соответствует максимуму поглощения спиртового раствора рутина.

Данный факт позволяет проводить спектрофотометрическое определение суммы флавоноидов в листьях ореха грецкого при аналитической длине волны 412 нм.

Также нами было изучено влияние экстрагента на процесс экстракции. В таблице 1 (приложение 4) представлена зависимость выхода флавоноидов листьев ореха грецкого от концентрации экстрагента. В результате эксперимента в качестве оптимального экстрагента нами был выбран 80% этиловый спирт, так как выход действующих веществ из сырья при его использовании максимален.

Далее нами был изучен вопрос относительно продолжительности экстракции на кипящей водяной бане, в таблице 2 (приложение 4) представлена зависимость выхода флавоноидов листьев ореха грецкого от времени экстракции на кипящей водяной бане, при этом было выбрано время экстракции 30 минут.

В таблице 3 (приложение 5) представлена зависимость выхода флавоноидов листьев ореха грецкого от соотношения «сырье-экстрагент». Из таблицы видно, что максимальный выход действующих веществ наблюдается при соотношении «сырье-экстрагент» 1:30, по этой причине данное соотношение было выбрано нами в качестве оптимального.

Учитывая, что увеличение числа операций на стадии пробоподготовки ведет к возрастанию ошибки, выбор сделан в пользу одностадийного процесса экстракции с подтверждением требуемой точности количественного определения.

Таким образом, было определено, что оптимальными параметрами экстракции являются: однократное извлечение 80% этиловым спиртом на кипящей водяной бане в течение 30 минут в соотношении «сырье-экстрагент» - 1:30.

Принимая по внимание тот факт, что специфическим для листьев ореха грецкого является рутин, а максимумы поглощения раствора рутина и водно-спиртового извлечения листьев ореха грецкого находятся в области 412 нм, целесообразным является определение содержания суммы флавоноидов в пересчете на рутин при длине волны 412 нм.

Способ реализуется следующим образом.

Аналитическую пробу сырья измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 2 мм. Около 1 г измельченного сырья (точная навеска) помещают в колбу со шлифом вместимостью 100 мл, прибавляют 30 мл 80% этилового спирта. Колбу закрывают пробкой и взвешивают на тарированных весах с точностью до ±0,01. Колбу присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане (умеренное кипение) в течение 30 мин. Затем ее охлаждают в течение 30 мин. закрывают той же пробкой, снова взвешивают и восполняют недостающий экстрагент до первоначальной массы. Извлечение фильтруют через бумажный фильтр (красная полоса).

Испытуемый раствор для анализа суммы флавоноидов готовят следующим образом: 1 мл полученного извлечения помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл. прибавляют 2 мл 3% спиртового раствора алюминия хлорида и доводят объем раствора до метки спиртом этиловым 96% (испытуемый раствор).

Раствор сравнения готовят следующим образом: 1 мл полученного извлечения помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, доводят объем раствора до метки 96% этиловым спиртом (раствор сравнения).

Для расчета содержания суммы флавоноидов готовят раствор стандартного образца рутина, добавляют к нему 3% спиртовой раствор алюминия хлорида, измеряют оптическую плотность окрашенного комплекса при аналитической длине волны 412 нм и определенное значение оптической плотности используют в формуле расчета.

Приготовление раствора стандартного образца рутина.

Около 0,02 г (точная навеска) рутина помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, растворяют в 20 мл 70% этилового спирта при нагревании на водяной бане. После охлаждения содержимого колбы до комнатной температуры доводят объем раствора 70% этиловым спиртом до метки (раствор А рутина). 2 мл раствора А рутина помещают в мерную колбу на 25 мл, прибавляют 2 мл 3% спиртового раствора алюминия хлорида и доводят объем раствора до метки спиртом этиловым 96% (испытуемый раствор Б рутина).

Раствор сравнения готовят следующим образом: 2 мл полученного раствора помещают в мерную колбу на 25 мл, доводят объем раствора до метки спиртом этиловым 96%.

Измерение оптической плотности проводят при длине волны 412 нм через 40 минут после приготовления всех растворов.

Содержание суммы флавоноидов (X в процентах) в пересчете на рутин и абсолютно сухое сырье вычисляют по формуле:

где D - оптическая плотность испытуемого раствора;

D_o - оптическая плотность раствора Государственного стандартного образца рутина;

m - масса сырья, г;

m_o - масса Государственного стандартного образца рутина, г;

W - потеря в массе при высушивании, %.

В случае отсутствия стандартного образца рутина для расчета целесообразно использовать теоретическое значение удельного показателя поглощения при 412 нм - 240:

где D - оптическая плотность испытуемого раствора;

m - масса сырья, г;

m_o - масса ГСО рутина, г;

240 - удельный показатель поглощения ГСО рутина при 412 нм;

W - потеря в массе при высушивании в процентах.

Предлагаемый способ поясняется следующими примерами.

Пример 1.

Аналитическую пробу сырья ореха грецкого измельчают до размера частиц 2 мм (заготовлено в г. Самаре, Ботанический сад, апрель 2018 г.). 1,0006 г измельченного сырья помещают в колбу со шлифом вместимостью 100 мл, прибавляют 30 мл 80% этилового спирта. Колбу закрывают пробкой и взвешивают на тарирных весах с точностью до ±0,01. Колбу присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане (умеренное кипение) в течение 30 минут. Затем колбу охлаждают в течение 30 мин, закрывают той же пробкой, снова взвешивают и восполняют недостающий экстрагент до первоначальной массы. Извлечение фильтруют через бумажный фильтр (красная полоса).

Испытуемый раствор для анализа суммы флавоноидов готовят следующим образом: 1 мл полученного извлечения помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, прибавляют 2 мл 3% спиртового раствора алюминия хлорида и доводят объем раствора до метки спиртом этиловым 96% (испытуемый раствор).

Раствор сравнения готовят следующим образом: 1 мл полученного извлечения помещают в мерную колбу на 50 мл, доводят объем раствора до метки спиртом этиловым 96% (раствор сравнения).

Для расчета содержания суммы флавоноидов готовят раствор стандартного образца рутина, добавляют к нему 3% спиртовой раствор хлорида алюминия, измеряют оптическую плотность окрашенного комплекса при длине волны 412 нм и определенное значение оптической плотности используют в формуле расчета.

Приготовление раствора стандартного образца рутина

0,0220 г рутина помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, растворяют в 20 мл 70% этилового спирта при нагревании на водяной бане. После охлаждения содержимого колбы до комнатной температуры доводят объем раствора 70% этиловым спиртом до метки (раствор А рутина). После чего 2 мл раствора А рутина помещают в мерную колбу на 25 мл, добавляют 2 мл 3% спиртового раствора алюминия хлорида, затем доводят объем раствора до метки спиртом этиловым 96%. Раствор сравнения готовят следующим образом: 2 мл полученного раствора помещают в мерную колбу на 25 мл, доводят объем раствора до метки спиртом этиловым 96%.

Измерение оптической плотности проводят при длине волны 412 нм через 40 минут после приготовления всех растворов.

Содержание суммы флавоноидов (X в процентах) в пересчете на рутин и абсолютно сухое сырье вычисляют по формуле:

где:

0,413 - оптическая плотность испытуемого раствора;

0,6544 - оптическая плотность раствора стандартного образца рутина;

1,0006 - масса сырья, г;

0,0220 - масса стандартного образца рутина, г.

10 - потеря в массе при высушивании, %.

Содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин = 3,70%.

Пример 2.

При необходимости определения суммы флавоноидов в листьях ореха грецкого в отсутствии стандартного образца рутина, необходимо провести все действия из примера 1 до приготовления раствора стандартного образца рутина.

После измерения оптической плотности извлечения из листьев ореха грецкого при длине волны 416 нм, содержание суммы флавоноидов (X в процентах) в пересчете на рутин и абсолютно сухое сырье вычисляют по формуле, используя теоретическое значение удельного показателя поглощения при 412 нм - 240.

где:

0,529 - оптическая плотность испытуемого раствора;

1,0011 - масса сырья, г;

240 - удельный показатель поглощения - оптическая плотность раствора вещества с концентрацией 1 г/100 мл в кювете с толщиной слоя 1 см) Государственного стандартного образца рутина при 412 нм;

10 - потеря в массе при высушивании, %.

Содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин = 3,67%, что сравнимо со значением, полученном в примере 1.

Все результаты были статистически обработаны. Ошибка единичного количественного определения составила ±3,49%.

Таким образом, предлагаемый способ количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на рутин в листьях ореха грецкого с использованием дифференциальной спектрофотометрии разработан впервые для данного вида сырья и обладает следующими преимуществами:

1. Разработанный метод является более специфичным и селективным, а также позволяет проводить экстракцию сырья однократно, поскольку в качестве экстрагента используется 80% этиловый спирт, позволяющий исчерпывающе извлекать целевые вещества (флавоноиды).

2. Пересчет суммы флавоноидов идет на специфическое для листьев ореха грецкого вещество - рутин.

3. Ошибка единичного определения предлагаемого способа составляет ±3,49%.

Этот способ можно применять в центрах контроля качества лекарственных средств, на фармацевтических предприятиях и контрольно-аналитических лабораториях при проведении количественного анализа листьев ореха грецкого (Juglans regia L.).

ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ:

1. Куркин, В.А. Фармакогнозия. Учебник для студентов фармацевтических вузов (факультетов). - 3-е изд., перераб. и доп. - Самара: ООО «Офорт»; ФГБОУ ВО СамГМУ Минздрава России, 2016. - 1279 с.

2. Куркин, В.А. Основы фитотерапии: учебное пособие. - Самара: ООО «Офорт»; ГОУ ВПО «СамГМУ Росздрава», 2009. - 963 с.

3. Дайронас Ж.В. Определение нафтохинонов в сырье и фитопрепарате ореха черного - Juglans nigra L / Фармация. 2013. - №4. - С. 12-14.

4. Государственная Фармакопея Российской Федерации. XIV издание [Электронный ресурс] // МЗ РФ. Москва, 2018. [Т. 2]. С. 2327-2348. URL: http: //resource.rucml.ru/feml/pharmacopia/14_2/HTML/513/index.html (Дата обращения 14.08.2020 г.).