СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ СУММЫ ФЛАВОНОИДОВ В ЛИСТЬЯХ ТОПОЛЯ ЧЕРНОГО

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и может быть использовано в центрах контроля качества лекарственных средств и контрольно-аналитических лабораториях при проведении количественного определения суммы флавоноидов в листьях тополя черного (Populus nigra L.).

Действующая система контроля качества лекарственных препаратов требует постоянного усовершенствования подходов к стандартизации биологически активных соединений (БАС) с использованием современных методов анализа и актуальных данных об их физико-химических, спектральных и фармакологических свойствах, позволяющих объективно и селективно определять содержание целевых веществ (4).

Тополь черный (Populus nigra L.) является одним из фармакопейных видов растений, включенных в Государственную Фармакопею Российской Федерации XIII издания: в качестве лекарственного растительного сырья (ЛРС) зарегистрированы почки (ФС.2.5.0042.15) (2). Препараты на основе почек тополя обладают широким спектром фармакологической активности: противогрибковым, антисептическим, ранозаживляющим и противовоспалительным действием (1).

Особый интерес, наряду с фармакопейным сырьем - почками, представляют листья данного растения. Листья тополя черного (Populus nigra L.) являются перспективным источником БАС, обладающим противовоспалительным и антибактериальным действием. Однако, проблема стандартизации данного вида сырья остается нерешенной.

Известен способ количественного определения суммы флавоноидов в листьях тополя черного методом прямой спектрофотометрии (3). Данная методика включает такие стадии, как экстрагирование сырья 60% этиловым спиртом, предварительную обработку хлороформом с целью освобождения экстракта от хлорофилла, измерение оптической плотности испытуемого раствора при аналитической длине волны 330 нм и расчет содержания суммы флавоноидов.

Данный метод взят нами в качестве прототипа. Недостатками этого метода являются: низкая специфичность, неточность, неполнота экстракции (экстрагент выбран неоптимальный), необъективность, заключающаяся в получении заниженных результатов анализа, отсутствие пересчета содержания суммы флавоноидов на конкретное флавоноидное вещество, трудоемкость методики (предварительная обработка экстракта хлороформом).

Таким образом, целью изобретения является разработка способа количественного определения суммы флавоноидов в листьях тополя черного, обладающего более высокой специфичностью, точностью и воспроизводимостью.

Техническим результатом является создание способа количественного определения суммы флавоноидов в листьях тополя черного в пересчете на рутин.

Технический результат достигается тем, что получают водно-спиртовое извлечение из листьев тополя черного путем однократной экстракции этиловым спиртом в концентрации 70% воздушно-сухого сырья точной навеской массой 1 г, измельченного до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 1 мм, количественное определение суммы флавоноидов в листьях тополя черного проводят при длине волны 414 нм в пересчете на рутин и содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин и абсолютно сухое сырье рассчитывают по формуле:

где:

х - содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин, %;

D - оптическая плотность испытуемого раствора;

D₀ - оптическая плотность раствора Государственного стандартного образца рутина;

m - масса сырья, г;

m₀ - масса Государственного стандартного образца рутина, г;

W - потеря в массе при высушивании, %;

в случае отсутствия стандартного образца рутина для расчета целесообразно использовать теоретическое значение его удельного показателя поглощения, равное 240:

где:

х - содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин, %;

D - оптическая плотность испытуемого раствора;

m - масса сырья, г;

m₀ - масса Государственного стандартного образца рутина, г;

240 - удельный показатель поглощения Государственного стандартного образца рутина при длине волны 414 нм;

W- потеря в массе при высушивании, %.

При изучении спектральных характеристик было выявлено, что именно рутин определяет характер кривой поглощения водно-спиртового извлечения из листьев тополя черного. Определено, что в УФ-спектре водно-спиртового извлечения тополя черного наблюдается батохромный сдвиг длинноволновой полосы флавоноидов (Фигура 1 в Приложении 1), как и в случае рутина (Фигура 2 в Приложении 2), где кривая 1 на фигуре 1 и фигуре 2 демонстрирует исходный раствор водно-спиртового извлечения из листьев тополя черного или исходный раствор рутина соответственно, а кривая 2 -раствор водно-спиртового извлечения из листьев тополя черного в присутствии алюминия хлорида или раствор рутина в присутствии алюминия хлорида соответственно.

Изучение УФ-спектров фигуры 2 (где кривая 1 - раствор рутина, а кривая 2 -раствор рутина с добавлением алюминия хлорида) показало, что раствор ГСО рутина в присутствии алюминия хлорида имеет максимум поглощения при длине волны 414 нм. В УФ-спектре водно-спиртового извлечения из листьев тополя черного в дифференциальном варианте на фигуре 3 (Приложение 3) так же обнаруживается при длине волны 414 нм максимум поглощения, который соответствует максимуму поглощения спиртового раствора рутина.

Данный факт позволяет проводить спектрофотометрическое определение суммы флавоноидов в листьях тополя черного при аналитической длине волны 414 нм.

Также нами было изучено влияние экстрагента на процесс экстракции. В таблице 1 (Приложение 4) представлена зависимость выхода флавоноидов листьев тополя черного от концентрации экстрагента. В результате эксперимента в качестве оптимального экстрагента нами был выбран 70% этиловый спирт, так как выход действующих веществ из сырья при его использовании максимален.

Далее нами был изучен вопрос относительно продолжительности экстракции на кипящей водяной бане, в таблице 2 (Приложение 4) представлена зависимость выхода флавоноидов листьев тополя черного от времени экстракции на кипящей водяной бане, при этом было выбрано время экстракции 60 минут.

В таблице 3 (Приложение 5) представлена зависимость выхода флавоноидов листьев тополя черного от соотношения «сырье-экстрагент». Из таблицы 3 видно, что максимальный выход действующих веществ наблюдается при соотношении «сырье-экстрагент» 1:30, по этой причине данное соотношение было выбрано нами в качестве оптимального.

Учитывая, что увеличение числа операций на стадии пробоподготовки ведет к возрастанию ошибки, выбор сделан в пользу одностадийного процесса экстракции с подтверждением требуемой точности количественного определения.

Таким образом, было определено, что оптимальными параметрами экстракции являются: однократное извлечение 70% этиловым спиртом на кипящей водяной бане в течение 60 минут в соотношении «сырье-экстрагент» - 1:30.

Принимая по внимание тот факт, что специфическим для листьев тополя черного является рутин, а максимумы поглощения раствора рутина и водно-спиртового извлечения листьев тополя черного находятся в области 414 нм, целесообразным является определение содержания суммы флавоноидов в пересчете на рутин при длине волны 414 нм.

Способ реализуется следующим образом.

Аналитическую пробу воздушно-сухого сырья тополя черного измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 1 мм. Около 1 г точной навески измельченного сырья помещают в колбу со шлифом вместимостью 100 мл, прибавляют 30 мл 70% этилового спирта. Колбу закрывают пробкой и взвешивают на тарирных весах с точностью до ±0,01. Колбу присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане (умеренное кипение) в течение 60 минут. Затем колбу охлаждают в течение 30 мин, закрывают той же пробкой, снова взвешивают и восполняют недостающий экстрагент до первоначальной массы. Извлечение фильтруют через фильтр с красной полосой (извлечения из травы).

Испытуемый раствор для анализа суммы флавоноидов готовят следующим образом: 1 мл полученного извлечения помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, прибавляют 2 мл 3% спиртового раствора алюминия хлорида и доводят объем раствора до метки 96% этиловым спиртом (испытуемый раствор).

Раствор сравнения готовят следующим образом: 1 мл полученного извлечения помещают в мерную колбу на 50 мл, доводят объем раствора до метки 96% этиловым спиртом (раствор сравнения).

Для расчета содержания суммы флавоноидов готовят раствор стандартного образца рутина, добавляют к нему 3% спиртовой раствор алюминия хлорида, измеряют оптическую плотность окрашенного комплекса при аналитической длине волны 414 нм и определенное значение оптической плотности используют в формуле расчета.

Приготовление раствора стандартного образца рутина

Около 0,025 г (точная навеска) рутина помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, растворяют в 30 мл 70% этилового спирта при нагревании на водяной бане. После охлаждения содержимого колбы до комнатной температуры доводят объем раствора 70% этиловым спиртом до метки (раствор А рутина). После чего 1 мл раствора А рутина помещают в мерную колбу на 25 мл, добавляют 2 мл 3% спиртового раствора алюминия хлорида и доводят объем раствора до метки спиртом этиловым 96% (испытуемый раствор Б рутина). Раствор сравнения готовят следующим образом: 1 мл полученного раствора помещают в мерную колбу на 25 мл, доводят объем раствора до метки спиртом этиловым 96%.

Измерение оптической плотности проводят при длине волны 414 нм через 40 минут после приготовления всех растворов.

Содержание суммы флавоноидов (х, %) в пересчете на рутин и абсолютно сухое сырье вычисляют по формуле:

где:

х - содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин, %;

D - оптическая плотность испытуемого раствора;

D₀ - оптическая плотность раствора Государственного стандартного образца рутина;

m - масса сырья, г;

m₀ - масса Государственного стандартного образца рутина, г;

W - потеря в массе при высушивании, %;

в случае отсутствия стандартного образца рутина для расчета целесообразно использовать теоретическое значение его удельного показателя поглощения, равное 240:

где:

х - содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин, %;

D - оптическая плотность испытуемого раствора;

m - масса сырья, г;

m₀ - масса Государственного стандартного образца рутина, г;

240 - удельный показатель поглощения Государственного стандартного образца рутина при длине волны 414 нм;

W- потеря в массе при высушивании в процентах.

Предлагаемый способ поясняется следующими примерами.

Пример 1.

Аналитическую пробу сырья тополя черного (заготовлено в Самарской области, п.Алексеевка, июнь 2012 г.) измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 1 мм. 1,0032 г измельченного сырья помещают в колбу со шлифом вместимостью 100 мл, прибавляют 30 мл 70% этилового спирта. Колбу закрывают пробкой и взвешивают на тарирных весах с точностью до+0,01. Колбу присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане (умеренное кипение) в течение 60 минут. Затем колбу охлаждают в течение 30 мин, закрывают той же пробкой, снова взвешивают и восполняют недостающий экстрагент до первоначальной массы. Извлечение фильтруют через бумажный фильтр (красная полоса).

Испытуемый раствор для анализа суммы флавоноидов готовят следующим образом: 1 мл полученного извлечения помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, прибавляют 2 мл 3% спиртового раствора алюминия хлорида и доводят объем раствора до метки спиртом этиловым 96% (испытуемый раствор).

Раствор сравнения готовят следующим образом: 1 мл полученного извлечения помещают в мерную колбу на 50 мл, доводят объем раствора до метки спиртом этиловым 96% (раствор сравнения).

Для расчета содержания суммы флавоноидов готовят раствор стандартного образца рутина, добавляют к нему 3% спиртовой раствор хлорида алюминия, измеряют оптическую плотность окрашенного комплекса при длине волны 414 нм и определенное значение оптической плотности используют в формуле расчета.

Приготовление раствора стандартного образца рутина.

0,025 г рутина помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, растворяют в 30 мл 70% этилового спирта при нагревании на водяной бане. После охлаждения содержимого колбы до комнатной температуры доводят объем раствора 70% этиловым спиртом до метки (раствор А рутина). После чего 1 мл раствора А рутина помещают в мерную колбу на 25 мл, добавляют 2 мл 3% спиртового раствора алюминия хлорида, затем доводят объем раствора до метки спиртом этиловым 96%. Раствор сравнения готовят следующим образом: 1 мл полученного раствора помещают в мерную колбу на 25 мл, доводят объем раствора до метки спиртом этиловым 96%.

Измерение оптической плотности проводят при длине волны 414 нм через 40 минут после приготовления всех растворов.

Содержание суммы флавоноидов (х, %) в пересчете на рутин и абсолютно сухое сырье вычисляют по формуле:

где:

0,4507 - оптическая плотность испытуемого раствора;

0,4745 - оптическая плотность раствора стандартного образца рутина;

1,0032 - масса сырья, г;

0,025 - масса стандартного образца рутина, г;

5 - потеря в массе при высушивании в процентах.

Содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин равно 2,99%.

Пример 2.

При необходимости определения суммы флавоноидов в листьях тополя черного в отсутствии стандартного образца рутина, необходимо провести все действия из примера 1 до приготовления раствора стандартного образца рутина.

После измерения оптической плотности извлечения из листьев тополя черного при длине волны 414 нм, содержание суммы флавоноидов (х, %) в пересчете на рутин и абсолютно сухое сырье вычисляют по формуле, используя теоретическое значение удельного показателя поглощения рутина, равное 240:

где:

0. 4507 - оптическая плотность испытуемого раствора;

1,0032 - масса сырья, г;

240 - удельный показатель поглощениястандартного образца рутина при 414 нм;

5 - потеря в массе при высушивании в процентах.

Содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин равно 2,99%, что совпадает со значением, полученном в примере 1.

Все результаты были статистически обработаны. Ошибка единичного количественного определения составила ±3,21%.

Таким образом, предлагаемый способ количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на рутин в листьях тополя черного с использованием дифференциальной спектрофотометрии разработан впервые для данного вида сырья и обладает следующими преимуществами:

1. Разработанный метод является более специфичным и селективным, а также позволяет проводить экстракцию сырья однократно 70% этиловым спиртом, позволяющим исчерпывающе извлекать целевые вещества (флавоноиды).

2. Пересчет суммы флавоноидов идет на специфическое для листьев тополя черного флавоноидное вещество - рутин, определяющее характер кривой поглощения в УФ - спектре испытуемого раствора (длина волны 414 нм)

3. Ошибка единичного определения предлагаемого способа составляет±3,21%, что свидетельствует об объективности разработанного способа.

4. Разработанный способ позволяет исключить пробоподготовку, имеющуюся в прототипе, заключающуюся в обработке экстракта токсическим растворителем -хлороформом.

Этот способ можно применять в центрах контроля качества лекарственных средств, на фармацевтических предприятиях и контрольно-аналитических лабораториях при проведении количественного анализа листьев тополя черного (Populus nigra L.).

ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ:

1. Браславский В.Б. Комплексное фармакогностическое и физико-химическое исследование флавоноидов и фенилпропаноидов представителей семейства ивовых (Salicaceae): дис.... докт.фармац. наук: 14.04.02 / Браславский Валерий Борисович. - Самара, 2012. - 319 с.

2. Государственная Фармакопея Российской Федерации. XIII издание / МЗ РФ. - Москва, 2015.-Т. 3. - С. 657-663.

3. Ионова В.А., Батырханов Е.Е., Имашева Н.М., Щепетова Е.В. Фитохимическое исследование растительных экстрактов из почек и листьев Populus nigra L. Естественные науки. 2013. №1 (42). С. 99-104.

4. Куркин В.А. Фармакогнозия. Учебник для студентов фармацевтических вузов (факультетов). - 3-е изд., перераб. и доп.- Самара: ООО «Офорт»; ФГБОУ ВО СамГМУ Минздрава России, 2016. - 1279 с.