Результат интеллектуальной деятельности: Способ выявления критериев риска формирования атеросклероза

Изобретение относится к области медицины, а именно: терапии, иммунологии, лабораторной диагностике и касается способа выявления критериев риска формирования атеросклероза.

Атеросклероз представляет собой хроническую сосудистую патологию, ответственную за большинство сердечно-сосудистых ишемических событий. В основе патогенеза атеросклероза лежит изменение стенки сосуда из-за развития превентивного воспаления в ответ на дислипидемию с последующим включением иммунного компонента и формированием атеросклеротической бляшки. В месте поражения формируется фибриновый монослой, куда активно мигрируют циркулирующие тромбоциты, нейтрофилы и моноциты [The role of monocytosis and neutrophilia in atherosclerosis / D.A. Chistiakov, A.V. Grechko, V.A. Myasoedova, A.A. Melnichenko, A.N. Orekhov // Journal of Cellular and Molecular Medicine. 2018. Volume 22, Issue 3. Pages 1366-1382]. В результате происходит нарушение сосудистой функции, изменение гемодинамики и тромбообразования. Тромбоз может постепенно перекрывать артериальный просвет, что приводит к появлению ишемического синдрома [Thrombosis formation on atherosclerotic lesions and plaque rupture / L. Badimon, G. Vilahur // Journal of Internal Medicine. 2014. Volume 276, Issue 6, Pages 618-632].

В структуре общей смертности населения Российской Федерации на долю сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ) приходится 56% [Иванов Д.О., Орел В.И., Александрович Ю.С., Пшениснов К.В., Ломовцева Р.Х. Заболевания сердечно-сосудистой системы как причина смертности в Российской Федерации: пути решения проблемы // Медицина и организация здравоохранения. 2019. Т. 4, №2. С. 4-12]. Развитие неблагоприятных сердечно-сосудистых и цереброваскулярных событий у больных с клиническими проявлениями атеросклероза (инфаркт миокарда, нарушение мозгового кровообращения, внезапная сердечная смерть и т.д.) является ведущей причиной инвалидизации и смертности населения всех развитых стран. Действительно, Всемирная организация здравоохранения сообщила, что в 2016 году от сердечно-сосудистых заболеваний умерло 17,9 млн. человек (около 31% всех случаев смерти в мире), а в будущем, в 2030 году, от сердечно-сосудистых заболеваний погибнет более 23,3 млн. человек [Mathers CD, Loncar D. Projections of global mortality and burden of disease from 2002 to 2030. PLoS Med 2006; 3: e442; https://www.who.int/ru/news-room/ fact-sheets/detail/cardiovascular-diseases].

Факторами риска атеросклероза являются: дислипидемия, артериальная гипертензия, нарушение толерантности к глюкозе [Havel R.J. Role of triglyceride-rich lipoprotein in progression of atherosclerosis// Circulation. 1990. Vol. 81. P. 694-696; Haffner S.M. Hyperinsulinemia, insulin resistance and cardiovascular disease// Atherosclerotic vascular disease in diabetes. Lappeenranta, Finland. 1997. Р10]. Выявление в клинической практике соотношения содержания в крови ОХС, ТГ, ХС ЛПНП и ХС ЛПВП помогает установить дислипидемию, но имеется достаточно научных фактов и статистических данных об отсутствии строгих корреляций между уровнями нарушений липидного обмена и проявлениями атеросклероза [Диагностика и коррекция нарушений липидного обмена с целью профилактики и лечения атеросклероза. Рекомендации ВНОК. М.: 2005, 9-14.]

Повышенное содержание в межклеточной среде ТГ, ЛПНП, ЛПОНП или аномальное содержание иных субстанций обуславливает развитие иммунной воспалительной реакции, в том числе в интиме артерий. В крови начинают нарастать концентрации аутоантител к двухспиральной ДНК, нуклеопротеидам, кардиолипину, фосфолипидам, фосфатидил-серину, фосфатидилинозитолу, фосфатидиловой кислоте, окисленным липопротеинам низкой плотности, катепсину G и эластазе [Сенькова Л.В. Физиологическая роль антинуклеарных, антифосфолипидных и каталитических аутоантител у лиц, проживающих на Севере: автореф. дис.... канд. биол. наук. - Архангельск, 2005; Лютфалиева Г. Т. Роль аутоантител в поддержании гомеостаза иммунных, гормональных и метаболических процессов: автореф. дис... докт.мед. наук. - Екатеринбург, 2012]. Происходит активация митогензависимых протеинкиназ и синтез медиаторов превентивного воспаления (хемокины, молекулы адгезии, С-реактивный белок (СРБ), IL-1, IL-6, TNF-α). Повышенный сывороточный уровень СРБ отражает высокую атеросклеротическую нагрузку, тенденцию к разрыву атеросклеротической бляшки и является независимым предиктором ИБС [Щербак С.Г., Лисовец Д.Г., Сарана A.M. Биомаркеры сердечно-сосудистых заболеваний // Клеточные технологии в физической и реабилитационной медицине; Naka KK, Bechlioullis A, Marini A et al. Interleukin-1 genotypes modulate the long-term effect of lipoprotein(a) on cardiovascular events: The Ioannina Study. J Clin Lipidol. 2018;12(2):338-347. doi: 10.1016/jjacl. 2017.12.004]. У пациентов с дестабилизацией атеросклеротической бляшки в коронарных артериях в сыворотке крови регистрируют увеличение концентраций С-реактивного белка (СРБ), IL-6 и IL-8 [Lenderick Т., Boersma Е., Heeschen С.Elevated troponin Т and C-reactive protein predict impaired outcome for 4 years in patients with refractory unstable angina, and troponin T predicts benefit of treatment with abciximab in combination with PTCA // Eur. Heart. J. 2003. V. 24. №1. P. 77; Manginas A., Bei E., Chaidaroglou A. Peripheral levels of matrix metalloproteinassse-9, interleukin-6, and Creactive protein are elevated in patients with acute coronary syndromes; correlations with serum troponin // J. Clin. Cardiol. 2005. V. 28. №4. P. 183]. Таким образом, критерии к развитию воспалительных процессов четко взаимосвязаны с различными проявлениями атеросклероза.

Белок острой фазы SSA (Сывороточный амилоид А) циркулирует в основном в ассоциации с ЛПВП. При воспалении гепатоциты секретируют ЛПВП, в которых до 80% A по AI замещено на SSA. Синтез SSA приводит к характерному для острой фазы воспаления снижению в крови содержания ЛПВП и A по AI. Такое поведение белков острой фазы уменьшает нормальное поглощение клетками ЛПОНП и ЛПНП, обуславливает то, что гиперлипидемия сопровождает воспаление [Регуляция метаболических процессов при сахарном диабете II типа/ Под общей ред. докт.мед. наук Л.К. Добродеевой. - Екатеринбург: РИО УрО РАН, 2014. - 204 с]. Количество SAA увеличено у пациентов с атеросклерозом коронарных и периферических артерий. Показаны атерогенные эффекты SAA, такие как активация моноцитов и образование пенистых макрофагов, хемотаксис нейтрофилов, усиление секреции провоспалительных цитокинов моноцитами-макрофагами и лимфоцитами, индукция эндотелиальной дисфункции [Щербак С.Г., Лисовец Д.Г., Сарана A.M. Биомаркеры сердечно-сосудистых заболеваний // Клеточные технологии в физической и реабилитационной медицине].

Nt-proBNT также является биомаркером для определения риска ССЗ и обладает важным прогностическим значением для выявления доклинических симптомов атеросклероза [Predictive utility of atrial, N-terminal pro-atrial, and N-terminal pro-B-type natriuretic peptides for mortality and cardiovascular events in the general community: A 9-year follow-up study.]. Дисбаланс продукции эндотелина-1 может свидетельствовать о дисфункции эндотелия и о других ассоциированных нарушениях, детерминирующих развитие атеросклероза [Климушина М.В., Туманова Н.Г., Горшкова Н.Е. Взаимосвязь статинов и маркера эндотелиальной функции, эндотелина у мужчин и женщин с коронарным атеросклерозом]. Тем самым, оправдано использование показателей функции эндотелия в качестве показателей ранних атеросклеротических изменений, а также для выявления нарушенной функции эндотелия у лиц с факторами риска атеросклероза еще до появления клинических признаков заболевания [Воробьева Е.Н., Казызаева А.С.и др. Современные маркеры взаимосвязи сердечно-сосудистых заболеваний и метаболического синдрома//Медицина и образование в Сибири].

Помимо отдельных предикторов и критериев риска атеросклероза в современной медицинской литературе и базах данных патентных ведомств широко представлены многочисленные способы определения генетической предрасположенности к атеросклерозу [Патент РФ №2641568 от 28.12.2016; Патент РФ №2641571 от 28.12.2016; Патент РФ №2698092 от 10.04.2018], способы диагностики скрытой сосудистой недостаточности у больных атеросклерозом [Патент РФ №2194986 от 05.03.1999; Патент РФ №2197172 от 17.07.2000], способы определения степени риска формирования клинических осложнений атеросклероза [Патент РФ №2498307 от 12.10.2011; Патент РФ №2502473 от 02.10.2012; Патент РФ №2574896 от 04.04.2014; Патент РФ №2578968 от 02.03.2015], способы лечения больных атеросклерозом [Патент РФ №2284190 от 14.06.2005; Патент РФ №2411965 от 30.11.2009; Патент РФ №2678967 от 15.08.2017], фармацевтические средства для профилактики и лечения атеросклероза [Патент РФ №2287327 от 16.10.2003; Патент РФ №2597161 от 12.12.2014; Патент РФ №2655803 от 10.03.2016]. Таким образом, наряду с достаточно хорошо изученными вопросами профилактики, лечения и диагностики осложнений атеросклероза актуальным остается выявление достоверных критериев риска формирования атеросклероза в ситуации повышения уровня заболеваемости атеросклерозом в России и в мире (по данным ВОЗ).

Из уровня техники известен способ диагностики предрасположенности к прогрессированию атеросклероза сонных артерий у лиц с нормолипидемией по содержанию CD4+ Т-лимфоцитов в периферической крови [Патент РФ №2636238 от 11.05.2016]. У пациентов с концентрацией холестерина липопротеидов низкой плотности <3,5 мМ (нормолипидемией) определяют относительное содержание CD4+ с использованием меченных флуоресцентными метками моноклональных антител. Уровень Т-хелперов более 39,5% свидетельствует о высоком риске прогрессирования атеросклероза в краткосрочной перспективе (1 год). Однако повышение содержания и активизация Т-хелперов характерны для любого воспаления и развития реакции антителообразования. Так, антитела классов М и G отражают обычный уровень острого и хронического воспаления, в то время как формирование атеросклеротической бляшки связано с преобладанием иммунологического компонента, в частности, увеличением концентрации СРБ, IL-6, IL-8 [Lenderick Т., Boersma Е., Heeschen С.Elevated troponin Т and C-reactive protein predict impaired outcome for 4 years in patients with refractory unstable angina, and troponin T predicts benefit of treatment with abciximab in combination with PTCA // Eur. Heart. J. 2003. V. 24. №1. P. 77. 21. Manginas A., Bei E., Chaidaroglou A. Peripheral levels of matrix metalloproteinassse-9, interleukin-6, and Creactive protein are elevated in patients with acute coronary syndromes; correlations with serum troponin // J. Clin. Cardiol. 2005. V. 28. №4. P. 183.]. Предложенное нами изобретение позволяет выявлять гиперэргическую реакцию, которая обусловлена только иммунологическим механизмом особой чувствительности иммуноглобулинов класса Е.

Предложенный нами способ учитывает определение всего двух параметров, а именно содержание в периферической венозной крови IgE и IL-10. При увеличении содержания IgE более 100 МЕ/мл и IL-10 более 20 пг/ мл диагностируют высокий риск формирования атеросклероза. Изобретение позволяет формировать группы риска для проведения профилактики атеросклероза, а также определять эффективность мероприятий в динамике лечения. Преимуществом способа является доступность, малая стоимость и простота в постановке исследования с применением широко используемого в лабораторной диагностике иммуноферментного метода анализа.

Заявленный способ осуществляется следующим образом. Кровь для исследования берется из локтевой вены для многофункционального клинического анализа в минимальном объеме (1 мл) до 10 часов утра, натощак. Количественное содержание IgE и IL-10 изучают в сыворотке крови при помощи иммуноферментного метода с применением стандартного диагностического набора. Результаты реакции при необходимости могут быть получены через 4 часа, пробу можно заморозить.

Предлагаемым способом были обследованы 50 человек с метаболическими нарушениями в возрасте от 28 до 50 лет, наблюдавшиеся в эндокринологическом консультативном центре г. Архангельска и проходившие реабилитацию в МК «Биокор». Средний индекс массы тела больных составил 32,5±3,85 кг/м². В качестве группы сравнения были обследованы 191 человек, практически здоровых на момент исследования, проживающих в пос. Ревда, с. Ловозеро Мурманской области в возрасте от 21 до 55 лет (средний индекс массы тела равняется 22,8±4,26 кг/м²). Обследование проводили с соблюдением норм и правил биомедицинской этики. Результаты обработаны с использованием пакета прикладных программ «Statistica 6.0» («StatSoft», США). Тип исследования ретроспективный, выборки случайные, одномоментные. Генеральная совокупность - жители севера Европейской территории России. Достоверность различий между группами оценивали с помощью параметрического t-критерия Стьюдента для независимых выборок и непараметрического критерия U-Манна-Уитни. Статистическая достоверность присваивалась при значении р<0,05.

Проведенные нами исследования показали, что у 92,19% лиц с метаболическими нарушениями концентрации А по А1 в крови колебались от 39,15 до 127,46 мг/дл, в среднем составляя 69,11±13,09 мг/дл, содержание IgE и IL-10 - соответственно (151,47±26,90 МЕ/мл) и (30,79±2,37 пг/мл). У обследованных нами больных присутствовали общее ожирение, повышенное содержание триглицеридов в крови (в среднем 3,73±0,31 ммоль/л), глюкозы (7,63±0,56 ммоль/л), общего холестерина (6,81±0,38 ммоль/л), АроВ (186,22±10,74 мг/дл), оЛПНП (10,43±2,73 мг/дл), мозгового натрийуретического пептида (563,15±60,28 фмоль/мл).

Повышение содержания в крови IgE свидетельствует о напряжении механизмов регуляции иммунного гомеостаза. Известно, что IgE обладают особой чувствительностью, улавливающей даже конформационные особенности антигена, что предопределяет увеличение возможностей идентифицировать антигенное разнообразие и позволяет отвечать на множество воспалительных пептидов [Barbee R. А., 1981; Masaki Н. et.al., 1995]. Кроме того, IgE вовлекают в реакции мощный потенциал базофилов и эозинофилов, который резко повышает цитотоксический эффект [Capron М. Rat mast cell-eosinophil interaction in antibody-dependent eosinophil citotoxicity to schistosoma mansoni schistosomula / M. Capron, J. Rouseaux, C. Mazingue, et al. // J. Immunol. - 1978. - №121. - P. 2518-252]. В этой ситуации вполне оправданно повышение противовоспалительного цитокина IL-10, способствующего восстановлению гомеостаза [Dhus Oliver IL-10 release requires stronger toll-like receptors 4-triggering than TNF / Oliver Dhus, Sebastian Bunk, S. von Aulock, Corinna Hermann // Immunology. 2008. - V. 213, N8. -P.621-627; Palmer M.J. Signaling thresBhaholds governheterogeneity in IL-7-receptor-mediated responses of naive CD8+ T-cells / M.J. Palmer, V.S. Mahajan, D. J. Chen et. al. // Immunol. And cell Biol. - 2011. - V. 89, N 5. - P. 581-594; Wilk CM. Dual biological effects of the cytokines interleukin-10 and interferon-γ / CM. Wilk, S. Wei, L. Wong et al. // Immunol, and Immunother. - 2011. - Vol.60, N11.-P. 1529-1541].

IL-10 является естественным ингибитором иммунной реакции превентивных реакций и воспаления, снижает экспрессию адгезивных, активирующих молекул, рецепторов, лигандов [Hebeda СВ. Nitric oxide modulates lipopolysaccharide-induced endothelial platelet endothelial cell adhesion molecule expression via interleukin-10 / C.B. Hebeda, S.A. Teixeria, E. K. Tamura et al. // Clin, and Exp. Immunol. - 2011 - Vol.165, N2. - P. 172-176], играет основную роль в формировании иммунной толерантности [Henry Е. Dendritic cells genetically engineered to express IL-10 induce long-lasting antigen-specific tolerance in experimental asthma / E. Henry, C.J. Desmet, V. Garze et al. // J. Immunol. - 2008. - Vol. 181. - P. 7230-7242; Lu M. Therapeutic induction of tolerance by IL-10-differentiated dendritic cells in house mite-asthma / M. Lu, W. Dawicki, X. Zhang et al. // Allergy. - 2011. - Vol. 66, N5. - P. 612-620], ингибирует иммунную реакцию снижением активности экспрессии генов рецепторов и их шеддингом [Arock М. Interleukin-10 inhibits cytokine generation from mast cells / M. Arock, C. Zuany-Amorim, M. Singer et al. // Eur. J. Immunol. - 1996. - V. 26. - P. 166 - 170; Moore K. Interleukin-10 and the Interleukin-10 receptor / K. Moore, R. De Waal Malefit, R. Coffmann, A. O'Garra // Annu. Rev. Immunol. - 2001. - V. 19. - P. 683-765]. Частные примеры использования способа.

Пример 1. Пациентка И., возраст 50 лет, диагноз - ожирение, регрессионное течение; сопутствующее заболевание - артериальная гипертензия II степени, риск IV. ИМТ - 42,9. Проходила комплексное обследование в Институте физиологии природных адаптаций УрО РАН по договоренности с эндокринологическим консультативным центром г. Архангельска. При лабораторном изучении периферической венозной крови концентрация IgE в сыворотке крови составила 383,9 МЕ/мл, содержание IL-10 - 50,34 пг/мл. Согласно предлагаемому способу пациентка имеет совокупность признаков: IgE более 100 МЕ/мл и IL-10 более 20 пг/мл, на основании чего сделано заключение о высоком риске формирования атеросклероза. В качестве контрольного параллельного исследования были определены уровни следующих биомаркеров атеросклероза: ApoA1 - 362,47 мг/дл, АроВ -206,29 мг/дл, ОХ - 8,88 ммоль/л, оЛПНП - 2,45 мг/мл, глюкоза - 8,20 ммоль/л, ТГ - 3,09 ммоль/л, Nt-pro-BNP - 551,3 фмоль/мл. Значения данных показателей оказались выше нормы. Диагноз атеросклероз подтвержден.

Пример 2. Пациентка Э., возраст 37 лет, диагноз - ожирение II степени, абдоминальный вариант, медленно-прогрессирующее течение; сопутствующее заболевание - артериальная гипертензия I степени, риск II степени. ИМТ - 34,8. Проходила комплексное обследование в Институте физиологии природных адаптаций УрО РАН по договоренности с эндокринологическим консультативным центром г. Архангельска. При лабораторном изучении периферической венозной крови концентрация IgE в сыворотке крови составила 119,38 МЕ/мл, содержание IL-10 - 50,65 пг/мл. Согласно предлагаемому способу пациентка имеет совокупность признаков: IgE более 100 МЕ/мл и IL-10 более 20 пг/мл, на основании чего сделано заключение о высоком риске формирования атеросклероза. Дальнейшее изучение биохимических параметров сыворотки и плазмы крови обследуемой пациентки позволило получить следующие значения биомаркеров атеросклероза: ApoA1- 186,39 мг/дл, АроВ - 159,9 мг/дл, ОХ -6,53 ммоль/л, оЛПНП - 0,98 мг/мл, глюкоза 3,16 ммоль/л, ТГ - 6,82 ммоль/л, Nt-pro-BNP - 932,8 фмоль/мл. По результатам ультразвуковой доплерографии установлен атеросклероз сосудов нижних конечностей. Таким образом, несмотря на то, что концентрации оЛПНП и глюкозы находились в пределах нормативных значений, у пациентки подтвердился диагноз атеросклероз.

Пример 3. Пациентка Т., возраст 50 лет, диагноз - ожирение I степени, высокий риск СД 2 типа (инсулин 10,21 мкМЕ/мл). ИМТ - 31,2. Проходила комплексное обследование в Институте физиологии природных адаптаций УрО РАН по договоренности с эндокринологическим консультативным центром г. Архангельска. При комплексном лабораторном обследовании периферической венозной крови концентрация IgE в сыворотке крови составила 142,6 МЕ/мл, содержание IL-10 - 38,75 пг/мл. Согласно предлагаемому способу пациентка имеет совокупность признаков: IgE более 100 МЕ/мл и IL-10 более 20 пг/мл, на основании чего сделано заключение о высоком риске формирования атеросклероза. В качестве контрольного параллельного исследования были определены уровни следующих биомаркеров атеросклероза: ApoA1 - 56,3 мг/дл, АроВ - 191,14 мг/дл, ОХ -6,71 ммоль/л, оЛПНП - 3,56 мг/мл, глюкоза - 7,55 ммоль/л, ТГ - 3,17 ммоль/л, Nt-pro-BNP - 631,9 фмоль/мл. Используя инструментальные методы исследования диагноз атеросклероза подтвержден: выявлено нарушение кровоснабжения сонных и коронарных артерий, приступы стенокардии, гипертензия. Низкий уровень ApoAl в данной ситуации свидетельствует всего лишь о дислипидемии, но не характеризует риска атеросклероза.