Способ определения индивидуальной чувствительности человека к общему охлаждению

Изобретение относится к области медицины, в частности, физиологии труда, иммунологии и касается способа определения индивидуальной чувствительности человека к общему охлаждению.

Холодовое воздействие на организм определяется не только длительностью воздействия, влажностью окружающего воздуха, ветровым режимом, но, в значительной степени, индивидуальной чувствительностью к воздействию низких температур. Известно, что при действии на организм человека холода образование тепла повышается в 3-5 раз. В то время как использование человеком одежды «арктического типа» позволяет сократить теплопотерю в 5-6 раз. В случае, если всё же снижение температуры тела произошло до 35°С и ниже, такое состояние считается гипотермией. На начальных стадиях охлаждения организма гипотермия сопровождается активизацией процессов терморегуляции с увеличением содержания продуктов пероксидации, однако по прошествии времени сменяется ингибицией обмена веществ и снижением потребности тканей в кислороде [Физиология человека / под ред. В.М. Смирнова. - М.: Медицина, 2002. - С. 424-430; Хаснулин В.И. Введение в полярную медицину. Новосибирск: Изд-во СО РАМН, 1998.- 337 с]. Хотя вопрос чувствительности человека к воздействию низких температур достаточно широко изучен, но не теряет своей актуальности и в настоящее время, в связи с активным освоением Арктических территорий [Основы государственной политики Российской Федерации в Арктике на период до 2020 года и дальнейшую перспективу / утв. Президентом РФ 18.09.2008 г. № Пр-1969].

Природными особенностями Арктики являются дефицит солнечного тепла, малые величины годового радиационного баланса, оледенение (морское, наземное и подземное), замедление биологического кругооборота веществ, а также бедность видового разнообразия местной флоры и фауны [Агаджанян Н. А., Александров С. И., Аптикаева О. И. и др. Экология человека в изменяющемся мире / Под ред. В. А. Черешнева. - Екатеринбург: УрО РАН, 2006. - 562 с]. В связи с этим, промышленно-экономическое использование природных ресурсов, освоение Северного морского пути, вооруженная защита государственных границ РФ становятся остро зависимыми от состояния здоровья и адаптированности трудоспособного населения в Арктическом регионе.

Из уровня техники известен способ определения индивидуальной чувствительности человека к оксидативному стрессу [Патент РФ № 2508545, опубл. 27.02.2014], включающий исследование нейтрофилов периферической крови до и после их нагревания в пробирках на водяной бане в течение 30-60 секунд при температуре 42°С. У нейтрофилов регистрируют интенсивность хемилюминесценции путем подсчета числа импульсов в минуту в реакции, индуцированной опсонированным зимозаном; вычисляют отношение исходного значения к опытному, и при значении выражения менее 3 исследуемого относят к категории стрессочувствительных. В указанном аналоге изобретения не ставится цель определить индивидуальную чувствительность человека к общему охлаждению, в предложенном нами изобретении такая задача решается. Способ-аналог применяется, в основном, при лечении различных патологий в медицинских учреждениях, в то время как наше изобретение направлено на отбор практически здоровых людей, наиболее пригодных для успешного выполнения производственных работ в условиях Арктики.

Известен способ оценки степени локальной холодовой травмы в раннем реактивном периоде [Патент РФ № 2554821, опубл. 27.06.2015]. Способ включает выделение лимфоцитов периферической крови, оценку выраженности повреждения плазматической мембраны лимфоцитов в состоянии блеббинга (появление везикул и пузырей) с помощью фазово-контрастной микроскопии, вычисление значения индекса блеббинга лимфоцитов, помноженного на уровень аспартатаминотрансферазы. Определение степени отморожения зависит от значений коэффициента. В указанном способе дается оценка степени повреждения тканей, в то время как в предложенном нами изобретении выявляется наличие или отсутствие реакции лимфоцитов на общее охлаждение избранных параметров воздействия. И в аналоге и в заявленном нами изобретении исследуется системный ответ; различия заключаются в том, что в сравниваемом способе оценивается повреждение клеточной мембраны лимфоцитов, в предлагаемом нами способе - энергетический ресурс клетки. Другими словами, заявленный способ основан на оценке физиологических реакций человека.

Прототипом изобретения можно считать способ выявления лиц с нарушениями адаптации к холоду [Патент РФ №2436498, опубл. 20.12.2011], включающий обследование людей до и после холодовой пробы. В частности, проводится охлаждение рук с последующим тепловизионным их исследованием, определяется вариабельность сердечного ритма, изучается тип передачи тепла с концевых фаланг пальцев током крови от артерий к поверхностным сосудам. Совокупный анализ полученных данных свидетельствует либо о хорошей компенсаторной реакции сосудистой системы в случае конвекционной передачи тепла в течение 10 мин., либо о нарушении адаптации к холоду при контактном пути передачи тепла со стороны предплечья, от теплых зон к холодным, в течение 22 мин. и более. Указанный способ требует применения тепловизора, фиксирующего динамику инфракрасного излучения, а также применения аппаратного комплекса «Варикард». В предложенном нами изобретении необходимо использовать лишь 1 регистрирующий прибор - компактный, переносной люминометр компании «Люмтек» массой 650 г. В нашем способе методика осуществления включает общее холодовое воздействие на организм человека, что позволяет объективно оценить индивидуальную холодовую чувствительность, основанную на реакции системы кровообращения. В прототипе изобретения исследуется локальное холодовое воздействие на руки испытуемых людей, что свидетельствует о преимущественно местной сосудистой реакции и не касается холодовой чувствительности организма со стороны, например, систем внутренних органов и тканей. Кроме того, в сравниваемом способе не представляется возможным в целом оценить адаптированность человека к общему охлаждению.

В заявленном нами изобретении поставленная цель достигается тем, что проводится обследование людей до и после нахождения в холодовой камере в течение 5 мин. при температуре -25° С. В лимфоцитах периферической крови указанных лиц определяют уровень АТФ. При увеличении содержания АТФ не менее чем на 25% от исходного значения обследуемого человека относят к чувствительным к общему охлаждению, что ассоциируется со снижением содержания циркулирующих в крови лимфоцитов не менее чем на 20% от исходного уровня. Способ позволяет объективно оценивать индивидуальную чувствительность к общему охлаждению у практически здоровых людей трудоспособного возраста с целью отбора лиц наиболее пригодных для успешного выполнения производственных работ в условиях Арктики. Таковыми признаются люди, мало чувствительные к действию общего охлаждения.

Заявленный нами способ осуществляется следующим образом. Кровь для исследования берется из локтевой вены в объеме 3 мл до 10 часов утра, натощак. Количественное содержание АТФ определяют в 100 мкл лимфоцитарной взвеси с концентрацией 10⁶ клеток на 1 мкмоль при помощи люциферин-люциферазного метода. В основе метода лежит регистрация интенсивности свечения, возникающего при смешивании восстановленного субстрата (люциферина) и АТФ со специфическим ферментом - люциферазой. Результаты реакции оцениваются на люминометре ЛЮМ-1 компании "Люмтек" (Россия) с использованием стандартных наборов реактивов "Люмтек".

Предлагаемым способом были обследованы 30 человек в возрасте от 20 до 50 лет, проживающих в г. Архангельске, практически здоровых на момент исследования (средний индекс массы тела составил 23,8±4,26 кг/м²). Указанные люди не страдали острыми инфекционными заболеваниями, у них не было выявлено признаков аутоиммунных и лимфопролиферативных заболеваний, частота ОРЗ составляла не более 2 раз в год. Испытуемые находились в холодовой камере 5 мин. при температуре -25° С. Лабораторные исследования проводились 2 раза: до и после воздействия холодового фактора на людей. При этом соблюдались нормы и правила биомедицинской этики, утвержденные Хельсинкской декларацией Всемирной медицинской ассоциации об этических принципах проведения медицинских исследований (2000). В периферической крови определяли абсолютное содержание лимфоцитов и их фенотипов. Содержание фенотипов лимфоцитов изучали с помощью непрямой иммуннопероксидазной реакции с использованием моноклональных антител на препаратах лимфоцитов типа «высушенной капли» производства НПЦ МедБиоСпектр г. Москва.

Результаты обработаны с использованием пакета прикладных программ «Statistica 6.0» («StatSoft», США). Тип исследования ретроспективный, выборки случайные, одномоментные. Генеральная совокупность - жители севера Европейской территории России. Достоверность различий между группами оценивали с помощью параметрического t-критерия Стьюдента для независимых выборок и непараметрического критерия U-Манна-Уитни. Статистическая достоверность присваивалась при значении р<0,05.

Среди общей группы обследуемых лиц были выделены 2 подгруппы. Первая (N=19) включала людей, у которых в динамике холодового воздействия уровень АТФ лимфоцитов увеличивался не менее чем на 25% от исходного значения (в среднем на 84%). В медианном выражении рост АТФ составил с 1,05(0,63-1,77) до 2,48(1,24-4,19) мкмоль/10⁶кл, р=0,0012. Во второй подгруппе обследуемых лиц (N=11) в динамике холодового воздействия содержание АТФ, напротив, снижалось не менее чем на 20% от исходного значения (в среднем на 46%). В медианном выражении сокращение уровня АТФ составило с 2,77(0,37-5,06) до 1,04(0,22-1,47) мкмоль/10⁶кл, р=0,003. У лиц с нарастанием концентрации АТФ в лимфоцитах регистрируется значительное снижение параметров иммунной системы. Снижается общее число лимфоцитов с 2,4±0,15 до 1,53±0,06×10⁹ кл/л, падает содержание активированных, дифференцированных и апоптотических (CD95+ с 0,34±0,02 до 0,16±0,01×10⁹ кл/л) клеток: CD4+ с 0,47±0,03 до 0,21±0,01; CD8+ с 0,42±0,03 до 0,18±0,02; CD16+ с 0,47±0,03 до 0,22±0,03; CD23+ с 0,39±0,03 до 0,21±0,02; CD25+ 0,42±0,03 до 0,21±0,02; CD71+ с 0,49±0,04 до 0,22±0,02; HLADR с 0,42±0,03 до 0,24±0,02×10⁹ кл/л (р<0,05). Под действием общего охлаждения у лиц второй группы, характеризующихся выраженным снижением концентрации АТФ в лимфоцитах, изучаемые показатели иммунной системы сохраняют своё значение (в отдельных случаях растут). Не имеют статистически значимых различий общее число лимфоцитов 1,86±0,16 и 2,01±0,14×10⁹ кл/л, а также содержание фенотипов: CD4+ 0,33±0,02 и 0,31±0,02; CD8+ 0,3±0,01 и 0,3±0,03; CD16+ 0,3±0,02 и 0,29±0,02; CD23+ 0,34±0,03 и 0,36±0,03; CD25+ 0,33±0,02 и 0,34±0,03; CD71+ 0,33±0,04 и 0,32±0,03; CD95+ 0,26±0,02 и 0,25±0,02; HLADR 0,36±0,02 и 0,40±0,03×10⁹ кл/л (р>0,05).

Из литературных сведений известно, что АТФ или аденозинтрифосфат вырабатывается в митохондриях в результате ферментативного окисления пирувата и жирных кислот. При этом образование АТФ начинается ещё в цитоплазме клетки в результате ферментативного расщепления глюкозы (реакция гликолиза) и триглицеридов [Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия: учебник. -М.: Медицина, 1998. - 704 с].

Одной из основных функций АТФ является энергетическое обеспечение процессов жизнедеятельности организма, что на биохимическом уровне достигается наличием в молекуле двух высокоемких фосфоангидридных связей (β, γ). Данные связи легко разрушаются в реакции гидролиза с образованием АДФ и неорганического фосфата, в последующем АМФ и неорганического фосфата. В результате каждой реакции выделяется до 60кДж свободной энергии, часть из которой рассеивается в окружающем пространстве в виде тепла. В условиях холодового воздействия уровень теплопродукции увеличивается, что приводит к снижению коэффициента полезного действия физической работы [Гомеостаз и проблемы приполярной медицины / Л.Е. Панин // Бюллетень СО РАМН. - 2010. - Т.30, №3. - С. 6-11].

Насколько велика интенсивность использования АТФ в клетке можно судить по скорости утилизации данной молекулы: она расходуется в течение 1 минуты после возникновения; за сутки каждая молекула АТФ распадается (и тут же синтезируется) 2-3 тысячи раз [Биохимия: учебник / под ред. Е. С. Северинаю - М.: ГЭОТАР-МЕД. - 2004. - 784 с]. Все иммунные реакции являются энергоёмкими [A role for mitochondria in antigen processing and presentation / L. C. Bonifaz, M. P. Cervantes-Silva, E. Ontiveros-Dotor, et al. // Immunology. - Vol. 144, Is. 3. - P. 461-471; Fuel feeds function: energy metabolism and the T-cell response / C. J. Fox, P. S. Hammerman, С. B. Thompson // Nat. Rev. Immunol. - 2005 - Vol. 11. - P. 844-852; Bioenergetics of immune functions: fundamental and therapeutic aspects / F. Buttgereit, G. R. Burmester, M. D. Brand // Immunol. Today. - 2000. - Vol. 21. - P. 192-199].

Срочная реакция снижения в крови лимфоцитов и их активированных фенотипов в условиях общего охлаждения может быть объяснена только перераспределением клеток из циркулирующего слоя в пристеночный. При этом снижается концентрация всех изучаемых в работе фенотипов, в том числе и готовых к апоптозу. Содержание АТФ в лимфоцитах, оставшихся в циркуляции, повышается, что может быть объяснено увеличением энергетических расходов на теплопродукцию, которая в условиях холода значительно вырастает.

Частные примеры использования способа.

1. Практически здоровая женщина П., возраст 33 года. Вес 53 кг, рост 1,64 м, индекс массы тела 19,7 кг/м. При лабораторном исследовании крови выявлено, что содержание АТФ в лимфоцитах до нахождения в холодовой камере составило 0,16 мкмоль/10⁶кл, после холодовой пробы - 0,55 мкмоль/10⁶кл. Таким образом, произошло увеличение уровня АТФ на 241,8% (в абсолютном выражении на 0,39 мкмоль/10⁶кл) от исходного значения. Сделан вывод о чувствительности обследуемой к общему охлаждению, что доказывается результатами иммунологического исследования лимфоцитов. Установлено сокращение общей популяции лимфоцитов с 4,14 до 1,72×10⁹ кл/л (в относительном выражении на 58,5%), что подтверждается снижением содержания фенотипов активированных, дифференцированных и апоптотических лимфоцитов: CD4+ с 0,42 до 0,21; CD8+ с 0,49 до 0,18; CD16+ с 0,61 до 0,23; CD23+ с 0,52 до 0,23; CD25+ с 0,69 до 0,31; CD71+ с 0,52 до 0,17; CD95+ с 0,42 до 0,25; HLADR с 0,47 до 0,25х10⁹ кл/л.

2. Практически здоровый мужчина Г., возраст 25 лет. Вес 93 кг, рост 1,75 м, индекс массы тела 30,4 кг/м. При лабораторном исследовании крови выявлено, что содержание АТФ в лимфоцитах до нахождения в холодовой камере составило 1,2 мкмоль/10⁶кл, после холодовой пробы - 5,57 мкмоль/10⁶кл. Таким образом, произошло увеличение уровня АТФ на 363,2% (в абсолютном выражении на 4,37 мкмоль/10⁶кл) от исходного значения. Сделан вывод о чувствительности обследуемого к общему охлаждению, что доказывается результатами иммунологического исследования лимфоцитов. Установлено сокращение общей популяции лимфоцитов с 2,6 до 1,02×10⁹ кл/л (в относительном выражении на 60,8%), что подтверждается снижением содержания фенотипов активированных, дифференцированных и апоптотических лимфоцитов: CD4+ с 0,32 до 0,12; CD8+ с 0,36 до 0,15; CD16+ с 0,57 до 0,21; CD23+ с 0,39 до 0,2; CD25+ с 0,44 до 0,21; CD71+ с 0,57 до 0,19; CD95+ с 0,38 до 0,15; HLADR с 0,42 до 0,17×10⁹ кл/л.

3. Практически здоровая женщина Л., возраст 34 года. Вес 64 кг, рост 1,64 м, индекс массы тела 23,8 кг/м. При лабораторном исследовании крови выявлено, что содержание АТФ в лимфоцитах до нахождения в холодовой камере составило 0,21 мкмоль/10⁶кл, после холодовой пробы - 0,18 мкмоль/10⁶кл. Таким образом, произошло снижение уровня АТФ на 10% (в абсолютном выражении на 0,03 мкмоль/10⁶кл) от исходного значения. Сделан вывод о малой чувствительности обследуемой к общему охлаждению, что доказывается результатами иммунологического исследования лимфоцитов. Установлено увеличение общей популяции лимфоцитов с 3,5 до 3,97×10⁹ кл/л. Не выявлено значительного снижения содержания фенотипов активированных, дифференцированных и апоптотических клеток, в отдельных случаях регистрируется нарастание их концентрации: CD4+ 0,37 и 0,36; CD8+ 0,41 и 0,4; CD16+ с 0,42 до 0,43; CD23+ с 0,35 до 0,45; CD25+ с 0,32 до 0,4; CD71+ 0,39 и 0,38; CD95+ 0,42 и 0,41; HLADR 0,39 и 0,4×10⁹ кл/л.

4. Практически здоровая женщина В., возраст 22 года. Вес 68 кг, рост 1,67 м, индекс массы тела 24,4 кг/м. При лабораторном исследовании крови выявлено, что содержание АТФ в лимфоцитах до нахождения в холодовой камере составило 2,77 мкмоль/10⁶кл, после холодовой пробы - 0,59 мкмоль/10⁶кл. Таким образом, произошло снижение уровня АТФ на 78,8% (в абсолютном выражении на 2,18 мкмоль/10⁶кл) от исходного значения. Сделан вывод о малой чувствительности обследуемой к общему охлаждению, что доказывается результатами иммунологического исследования лимфоцитов. Установлено увеличение общей популяции лимфоцитов с 2,26 до 2,68×10⁹ кл/л. Не выявлено значительного снижения содержания фенотипов активированных, дифференцированных и апоптотических лимфоцитов, в отдельных случаях регистрируется нарастание их концентрации: CD4+ с 0,29 до 0,42; CD8+ с 0,2 до 0,3; CD16+ с 0,27 до 0,33; CD23+ с 0,28 до 0,37; CD25+ с 0,32 до 0,30; CD71+ с 0,31 до 0,34; CD95+ с 0,26 до 0,35; HLADR с 0,31 до 0,34×10⁹ кл/л.