Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ ПОВЫШЕННОЙ АКТИВИРОВАННОСТИ Т-ЛИМФОЦИТОВ

Изобретение относится к области иммунологии, лабораторной диагностике и предназначено для выявления повышенной активированности Т-лимфоцитов с целью уточнения диагностики реакций гиперчувствительности замедленного типа, онкологических процессов, аутоиммунных заболеваний, реакций отторжения трансплантата, осложнений послеоперационного периода.

Активация Т-лимфоцитов характерна для многих иммунодефицитных заболеваний, в т.ч. аутоиммунных, онкологических, аллергических, осложнений при трансплантации в виде реакции отторжения трансплантата. Так, при аутоиммунных заболеваниях, связанных с образованием антител к собственным антигенам, преимущественно реагируют Т-лимфоциты с рецептором к IL-2 (CD25+) и Fc-фрагменту [Zwirska-Korczala К. Influence of thyroxine on serum soluble interleukin-2 receptor alpha levels in thyroid disorders / K.Zwirska-Korczala, A.Berdowska, J.Jochem et al. // J. Clin. Pharm.Therapeut. - 2004. - Vol.29, N 2. - P:151-156; Порядин Г.В. Молекулярные и клеточные механизмы иммунопатологии: состояние проблемы и перспективы исследований // Лечебное дело. - 2008. - №3. - С.3-13]. Гиперчувствительность немедленного и замедленного типа отличается реакцией со стороны CD23+ и HLADR+ [Пыцкий В.И. Аллергические заболевания / В.И. Пыцкий, Н.В. Адрианова, А.В. Артомасова. - М., 1999]. Онкологическая патология наряду с увеличением уровня активизации через IL-2 и посредством HLA DR отличается высоким содержанием лимфоцитов о рецептором к трансферрину (CD71+) [Artamonova E.V. Transferrin receptor (CD71) expression by human breast cancer cells / E.V. Artamonova, M.V.Vasiliev, N.N.Tupitsyn et al. // European Journal of Cancer. - 1996. - Т.32. - №2. - С.12.; Тупицын Н.Н. Клиническое значение оценки экспрессии мономорфных детерминант молекулы HLA I и II классов на клетках рака желудка / Н.Н. Тупицын, А.А. Клименков, З.Г. Кадагидзе и др. // Вестник РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН. - 1991. - Т. 2, №1. - С.36-38]. В связи с этим в клинической практике исследуют содержание в периферической крови функционально активных, зрелых Т-клеток (CD3+), клеток е рецепторами активации CD23+, CD25+, HLADR+, CD71+и оценивают количество активированных Т-лимфоцитов.

Известен способ выявления активности интерлейкин-2-опосредованного Т-клеточного звена иммунитета [Титов Л.П., Л.И. Тесевич, О.П.Чудаков, Т.Д. Харитоник Способ определения активности Т-лимфоцитов в организме от 08.09.1988]. Обследуемому пациенту вводят внутривенно фитогемагглютинин и смесь ФГА с циклоспорином. Измеряют зоны гиперемии и вычисляют величину 50%-ной ингибиции ответа на ФГА. При повышении этой величины по сравнению со здоровыми - определяют повышенную активность, а при ее снижении - низкую активность Независимого ответа. Данный способ предполагает введение веществ в организм человека, что может быть не только травмоопасным, но и формировать аллергическую реакцию. Кроме того, выявление активности Т-клеток ведется только относительно CD25+, в то время как в заявленном нами изобретении определяются CD23+, CD25+, CD71+ и HLADR+.

Применение автоматического иммунофенотипирования клеток биосубстратов на проточном лазерном цитофлуориметре является малодоступным для массового внедрения, так как необходим дорогостоящий прибор, стоимость которого составляет несколько миллионов рублей. Учитывая значительные финансовые затраты на приобретение реактивов и текущих расходных материалов, необходимость высокой квалификации исполнителя, указанный метод может использоваться лишь в крупных, центральных медицинских учреждениях.

Прототипом изобретения является способ определения количества активированных Т-лимфоцитов в организме человека, включающих забор крови из вены, выделение лимфоцитов центрифугированием в градиенте плотности, постановку розеткообразования с эритроцитами барана [Патент РФ №2080598 от 03.09.1992]. По количеству лимфоцитов, прикрепивших более 10 эритроцитов барана, определяют активированные Т-лимфоциты в организме. Данное изобретение является многоэтапным процессом со значительным использованием реактивов и рабочего времени, а также не дает возможности установить фенотип активированных клеток.

Предложенное нами изобретение позволяет в обычных условиях гематологической лаборатории без дополнительных затрат на приобретение моноклональных сывороток, аппаратуры и материалов выявить повышение активированности Т-лимфоцитов. Это необходимо в случаях диагностики аутоиммунных заболеваний, реакций гиперчувствительности замедленного типа, опухолевых процессов, реакций отторжения трансплантата, осложнений послеоперационного периода.

Поставленная цель достигается тем, что при выявлении 5÷7% розеток лимфоцитов на 100% лимфоидных клеток делается заключение о патологическом повышении активированности CD23+ и CD71+. Определение 8÷10% розеток лимфоцитов свидетельствует о повышенной активированности CD23+, CD71+ и HLADR+. Выявление более 10% розеток лимфоцитов соответствует активированности CD25+, CD23+, CD71+ и HLADR+. Для выполнения поставленной цели производится забор венозной крови и выделение из нее центрифугированием лимфоцитарной взвеси в градиенте плотности. В полученных препаратах «толстой капли» лимфоцитарной взвеси (предварительно высушенных, фиксированных в спирто-эфирной смеси и окрашенных спиртовым раствором бриллиантового зеленого) подсчитывается % содержание розеток лимфоцитов (с количеством розеткообразующих единиц не менее 3) на 100% лимфоидных клеток. На рисунках 1 и 2 демонстрируется различное содержание розеткообразующих единиц.

Указанным способом были обследованы 192 человека, проживающих в г.Архангельске в возрасте от 21 до 65 лет: 50 практически здоровых лиц; 28 больных аутоиммунным тиреоидитом, 42 больных онкологическими заболеваниями, 55 больных атоническим дерматитом и 17 лиц с метаболическим синдромом. Лица с патологиями проходили реабилитацию в медицинской компании «Биокор». Обследование проводили с соблюдением основных норм биомедицинской этики. Результаты обработаны с использованием пакета прикладных программ «Statistica 6» («StatSoft», США). Тип исследования ретроспективный, выборки случайные, одномоментные. Генеральная совокупность - жители севера Европейской территории России. Достоверность различий между группами оценивали с помощью параметрического t-критерия Стьюдента для независимых выборок и непараметрического критерия Уилкоксона. Статистическая достоверность присваивалась при значении р<0,05.

Установлено, что обнаружение 5÷7% розеток лимфоцитов совпадает с увеличением абсолютного содержания активированных CD23+ (с 0,27±0,03 до 0.48±0.03×10⁹ кл/л), CD71+ (с 0,28±0,01 до 0,35±0,02×10⁹ кл/л). Определение 8÷10% розеток лимфоцитов ассоциировано с увеличением уровня CD23+ (с 0,27±0,03 до 0,58±0,04×10⁹ кл/л), CD71+ (с 0,28±0,01 до 0,37±0,03×10⁹ кл/л) и HLADR+ (с 0,47±0,03 до 0,81±0,04×10⁹ кл/л). Выявление более 10% розеток лимфоцитов соответствует повышению содержания HLADR+ (с 0,47±0,03 до 0,85±0,04×10⁹ кл/л), CD23+(с 0,27±0,03 до 0,67±0,03×10⁹ кл/л), CD71+ (с 0,28±0,01 до 0,47±0,03×10⁹ кл/л) и CD25+ (с 0,43±0,02 до 0,79±0,03×10⁹ кл/л), р<0,001 по сравнению с данными обследуемых лиц, у которых активность розеткообразования лимфоцитов менее значительна. Наиболее высокие концентрации CD23+ (0,70±0,03×10⁹ кл/л) и CD25+ (0,84±0,03×10⁹ кл/л) характерны для больных аутоиммунным тиреоидитом, высокие уровни содержания HLADR+ (0,89±0,05×10⁹ кл/л) - при опухолевых процессах, CD71+ (0,53±0,02×10⁹ кл/л) - для лиц с метаболическим синдромом и злокачественными новообразованиями. Усиление механизма образования розеток лимфоцитов свидетельствует о повышении контактных взаимодействий клеток, что является одним из признаков их активированности.

Частные примеры использования способа.

1. Пациентка А., возраст 34 года. Диагноз - аутоиммунный тиреоидит Хашимото. В препаратах «толстой капли» лимфоцитарной взвеси обнаружено 6% розеток. При контрольном параллельном исследовании с моноклональными сыворотками выявлены 3 розетки с CD71+, 3 розетки с CD23+, 1 розетка с HLADR+. После абсолютного подсчета клеток в контроле установлено повышенное содержание CD23+ (0,45×10⁹ кл/л) и CD71+ (0,34×10⁹ кл/л). Уровень клеток с остальными фенотипами был физиологическим: CD25+ (0,92×10⁹ кл/л) и HLADR+ (0,72×10⁹ кл/л). Выявленная закономерность подтверждена.

2. Пациент В., возраст 52 года. Диагноз: атопический дерматит. В препаратах «толстой капли» лимфоцитарной взвеси обнаружено 10% розеток. При контрольном параллельном исследовании с моноклональными сыворотками выявлены 2 розетки с CD71+, 3 розетки с HLA DR+, 5 розеток с CD23+ и 1 розетка с CD25+. После абсолютного подсчета клеток в контроле установлено повышенное содержание CD23+ (0,75×10⁹ кл/л), CD71+ (0,43×10⁹ кл/л) и HLADR+ (0,68×10⁹ кл/л). Концентрация лимфоцитов CD25+ была физиологической (0,54×10⁹ кл/л). Выявленная закономерность подтверждена.

3. Пациент С., возраст 59 лет. Диагноз - лимфосаркома желудка. В препаратах «толстой капли» лимфоцитарной взвеси обнаружено 12% розеток. При контрольном параллельном исследовании с моноклональными сыворотками выявлено 6 розеток с CD71+, 5 розеток с HLADR+, 4 розетки с CD23+, 5 розеток с CD25+. После абсолютного подсчета лимфоцитов в контроле установлено повышенное содержание CD71+ (0,71×10⁹ кл/л), CD25+ (1,28×10⁹ кл/л), HLADR+ (0,94×10⁹ /л) и CD23+ (0,52×10⁹ кл/л). Выявленная закономерность подтверждена.