09.05.2023

№223.018.52f7

Результат интеллектуальной деятельности: Рекомбинантная плазмидная ДНК pSNCA-C-3XFLAG-2XST-donor, обеспечивающая стабильную доксициклин-управляемую экспрессию химерного белка альфа-синуклеина в культурах клеток человека

Вид РИД

Изобретение

Юридическая информация Юридическая информация Свернуть Развернуть

Авторы

Правообладатели

№ охранного документа

0002795156

Дата охранного документа

28.04.2023

Краткое описание РИД Краткое описание РИД Свернуть Развернуть

Аннотация: Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к генной инженерии, молекулярной и клеточной биологии. Предложена плазмидная генетическая конструкция pSNCA-C-3XFLAG-2XST-donor, содержащая ген альфа-синуклеина с эпитопами 3×FLAG и 2×Strep-Tag II, фланкированный плечами гомологии к локусу AAVS1 генома человека. Экспрессия белка альфа-синуклеина контролируется доксициклин-управляемым промотором. ДНК плазмиды pSNCA-C-3XFLAG-2XST-donor выступает в качестве донорной молекулы для внесения в геном клеток трансгена альфа-синуклеина, содержащего эпитопы 3×FLAG и 2×Strep-Tag II, необходимые для последующей тандемной аффинной очистки комплексов белков, взаимодействующих с альфа-синуклеином, что позволит изучить паттерн взаимодействия альфа-синуклеина с различными белками и структурами в клетках человека при синуклеинопатиях, в частности болезни Паркинсона. 5 ил., 3 пр.

Реферат Реферат Свернуть Развернуть

Изобретение относится к области генной инженерии, молекулярной и клеточной биологии и предназначено для создания клеточной модели, позволяющей изучать белок-белковые взаимодействия альфа-синуклеина в культурах клеток человека.

Альфа-синуклеин - это белок, который имеет высокий уровень экспрессии в большинстве типов нейронов головного мозга. Существует множество генетических и патофизиологических исследований, которые подтверждают вовлеченность альфа-синуклеина в развитие целого ряда патологий, объединяемых в группу синуклеинопатий. Это такие заболевания как болезнь Паркинсона, деменция с тельцами Леви, множественная системная атрофия. На терминальных стадиях развития данных болезней альфа-синуклеин входит в состав так называемых телец Леви - многокомпонентных белковых агрегатов. Несмотря на систематические исследования, до сих пор доподлинно неизвестен конкретный механизм патологического действия данного белка на жизнеспособность нейронов головного мозга, а также закономерности формирования и конкретный состав телец Леви. Для обеспечения прогресса в данном направлении, необходима разработка экспериментальных систем, которые предназначены для выяснения паттерна взаимодействия альфа-синуклеина с различными белками и структурами в нейронах человека.

Известен способ изучения состава белковых комплексов белка семейства 14-3-3, выделенных из культивируемых клеток, с помощью тандемной очистки аффинными смолами, связывающими якорные пептиды 3×FLAG и 2×Strep-Tag II, однако в указанной работе экспрессия трансгена происходит с плазмиды, которой временно трансфицирована культура клеток [1]. В такой системе невозможно контролировать количество копий трансгена, а синтез избыточного количества химерного белка сам по себе может привести к индукции патологических процессов в клетке, в частности, протеинопатий.

Плазмидных ДНК, аналогичных или близких к заявляемой по технической сущности и функциональному назначению, в литературе не описано.

Задачей изобретения является получение плазмидной ДНК, которая служит донорной молекулой для внесения в локус АAVS1 генома человека доксициклин-управляемого трансгена, кодирующего химерный белок альфа-синуклеин с эпитопами 3×FLAG и 2×Strep-Tag II.

Технический результат: получение плазмиды, несущей генетическую конструкцию SNCA-C-3XFLAG-2XST, фланкированную плечами гомологии к л оку су AAVS1, обеспечивающими таргетную интеграцию трансгена в геном человека.

Указанный результат достигается включением в плазмиду pSNCA-C-3XFLAG-2XST-donor фрагментов, содержащих плечи гомологии к локусу AAVS1, что позволяют внести трансген SNCA-C-3XFLAG-2XST в геном человека с помощью СRISPR-Саs9-опосредованной гомологичной рекомбинации [2].

Сущность заявляемого изобретения заключается в следующем.

Предложена плазмидная генетическая конструкция pSNCA-C-3XFLAG-2XST-donor, содержащая ген альфа-синуклеина с эпитопами 3×FLAG и 2×Strep-Tag II, фланкированный плечами гомологии к локусу AAVS1 генома человека. Экспрессия белка альфа-синуклеина контролируется доксициклин-управляемым промотором. ДНК плазмиды pSNCA-C-3XFLAG-2XST-donor выступает в качестве донорной молекулы для внесения в геном клеток трансгена альфа-синуклеина, содержащего эпитопы 3×FLAG и 2×Strep-Tag II, необходимые для последующей тандемной аффинной очистки комплексов белков, взаимодействующих с альфа-синуклеином. Такой подход позволит изучить паттерн взаимодействия альфа-синуклеина с различными белками и структурами в клетках человека при синуклеинопатиях, в частности, болезни Паркинсона.

Исходным генетическим материалом для конструирования плазмиды pSNCA-C-3XFLAG-2XST-donor служит плазмида pSpCas9-HF1-donor, размером 10325 п.н., имеющая нуклеотидную последовательность SEQ ID NO 1, которая была получена следующим образом.

В плазмиду pBluescript SK (+) по сайтам Асс65I и SpeI был клонирован двухцепочечный олигонуклеотид содержащий сайты AƒlII и MluI. Олигонуклеотид был получен при отжиге двух одноцепочечных олигонуклеотидов: HM-MCS-U 5'-CGGCGCGCCCTTAAGGTTAACACGCGTGGCGCGCCA-3' и HM-MCS-L 5'-CTAGTGGCGCGCCACGCGTGTTAACCTTAAGGGCGCGCCGGTAC-3'. В результате была создана плазмида pBluescript SK (+) MCS. В данную плазмиду, по сайтам SpeI и MluI, был помещен фрагмент, содержащий правое плечо гомологии к локусу АЛ VS1 (HA-R) и TRE-minCMV промотор. Данный фрагмент был получен в результате ПЦР с плазмиды Puro-Cas9 donor (Addgene plasmid #58409; http://n2t.net/addgene:58409; RRID: Addgene_58409) с использованием праймеров HA-R-U 5'-ACGCG7GGCGATCTGACGGTTCACT-3' и HA-R-L 5'-ACTAGTAGAGCAGAGCCAGGAACC-3' (сайты рестрикции в последовательностях праймеров выделены курсивом). Затем, между сайтами MluI и AƒlII, в получившуюся плазмиду был помещен фрагмент, который содержит последовательность, кодирующую SpCas9-HF1, сигнал ядерной локализации SV40 NLS, 3XFLAG эпитоп и сигнал полиаденилирования bGHpoly(A). Этот фрагмент был получен в результате ПЦР с плазмиды VP 12 (Addgene plasmid # 72247; http://n2t.net/addgene:72247; RRID: Addgene_72247) с использованием праймеров SPCAS9-HF1-U 5'-ACGCGTGCCACCATGGATAAAAAG-3' и SPCAS9-HF1-L 5'-CTTAAGCCATAGAGCCCACCGCA-3'. Сигнал полиаденилирования bGHpolyA был заменен на SV40poly(A) путем замены соответствующего фрагмента, ограниченного сайтами AgeI и АƒlII. Фрагмент, содержащий SV40poly(A), был получен в результате ПЦР с плазмиды pcDNA 3.1/Hygro (-) с использованием праймеров SV40pA-F 5'-GCAACCGGTACGAGATTTCGATTCCACCG-3' и SV40pA-R 5'-СAGCTTAAGTAAGATACATTGATGAGTTTG-3'. На финальной стадии в получившуюся конструкцию, между сайтами Асс65I и AflII, был помещен фрагмент, содержащий левое плечо гомологии к локусу AAVS1 (HA-L) и ген устойчивости к пуромицину с сайтом полиаденилирования bGHpoly(A). Данный фрагмент также был получен при помощи ПНР с плазмиды Puro-Cas9 donor и праймеров HA-L-U 5'-GG7MCCTGCTTTCTCTGACCAGCATT-3' и HA-L-L 5'-CTTAAGCCATAGAGCCCACCGCAT-3'. Данная плазмида была использована в качестве основы для создания векторов, экспрессирующих белок альфа-синуклеин, содержащий искусственные эпитопы 3×FLAG и 2×Strep Tag II на С-конце. Графическая карта исходной плазмиды pSpCas9-HF1-donor, содержащей плечи гомологии к локусу AAVS1 человека, представлена на фиг.1.

Кодирующая область (кДНК) гена SNCA была получена методом ПЦР с использованием праймеров 5'-GTGTAAAGGAATTCATTAGCC-3' и 5'-AACTGGGAGCAAAGATATTTC-3'. В качестве матрицы для ПЦР использовали кДНК, синтезированную с тотальной РНК, выделенной из тканей мозга человека. ПЦР-продукт был клонирован в векторе pGEM-T Easy (Promega). Соответствие полученной последовательности гену SNCA и отсутствие однонуклеотидных замен было подтверждено секвенированием плазмидных клонов по методу Сэнгера. Затем вектор pGEM-T Easy с клонированной в него последовательностью гена SNCA использовали в качестве матрицы для ПЦР с праймерами, которые содержат сайты рестрикции NcoI и MluI (пара праймеров 5'-TATCCATGGGGCTTCAGGTTCGTAGTCTTG-3' и 5'-AGGACGCGTTTAGCGATGGATGTATTCATG-3'). Таким образом, полученный ПЦР-продукт (после обработки соответствующими нуклеазами) содержал липкие концы, необходимые для его дальнейшего клонирования в плазмидные конструкции.

Вектор pSpCas9-HF1-donor гидролизовали эндонуклеазами рестрикции MluI и NcoI. Фрагмент, содержащий плечи гомологии к локусу AAVS1, доксициклин-регулируемый промотор и ген устойчивости к пуромицину, был отделен и очищен из агарозного геля. Затем кДНК альфа-синуклеина с липкими концами лигировали между сайтами МluI и NcoI очищенного фрагмента вектора pSpCas9-HF1-donor.

Фрагмент, содержащий эпитопы 3×FLAG и 2×Strep Tag II был получен с помощью ПЦР с использованием в качестве матрицы плазмиды AAVS1_Puro_PGK1_3×FLAG_Twin_Strep (Addgene plasmid # 68375; http://n2t.net/addgene:68375; RRID: Addgene_68375). Для ПЦР были использованы праймеры 5'-TCCCCATGGGACTACAAGGACCACGACGG-3' и 5'-CTCACCGGTTCACTTTTCGAACTGGGGGTG-3'. Эти пары праймеров содержат сайты эндонуклеаз рестрикции NcoI и AgeI, по которым ПЦР-продукты, содержащие 3×FLAG-2×Strep Tag II были клонированы в плазмиду pSNCA-C-3×FLAG-2XST-donor. Правильность сборки конструкций проверяли с помощью секвенирования по Сэнгеру.

Полученная в результате плазмида pSNCA-C-3XFLAG-2XST-donor, имеющая нуклеотидную последовательность SEQ ID NO 2, несущая трансген химерного белка альфа-синуклеина с эпитопами 3×FLAG и 2×Strep-Tag, фланкированный плечами гомологии к локусу AAVS1 человека (фиг.2), характеризуется следующими признаками:

- имеет размер 6705 п.н.;

- кодирует химерный белок альфа-синуклеин с эпитопами 3×FLAG и 2×Strep-Tag под контролем доксициклин-управляемого промотора;

- состоит из следующих элементов:

а) плечей гомологии к локусу AAVS1 человека размером 837 п.н. и 804 п.н., фланкирующих генетическую конструкцию из 7 подряд расположенных последовательностей связывания тетрациклинового трансактиватора tet operator (19 п.н. каждый), минимального промотора CMV (39 п.н.), кодирующей части гена альфа-синуклеина (420 п.н.), эпитопов 3×FLAG (65 п.н.) и двух Strep-Tag II (24 п.н. каждый), сигналов полиаденилирования транскрипта SV40 (122 п.н.) и bGH (225 п.н.), гена устойчивости к пуромицину PuroR (600 п.н.), последовательности, кодирующей 2А-пептид Т2А (54 п.н.) и акцепторного сайта сплайсинга SA (26 п.н.).

б) фрагмента плазмиды pBluescript SK (1511 п.н.), содержащего ген устойчивости к ампицилину AmpR, необходимый для селекции целевых плазмид на этапе клонирования, ориджины репликации плазмиды ori и fl ori, а также промотор и оператор lac-оперона бактерий.

в) последовательности Т3 (19 п.н.) и Т7 (19 п.н.) промоторов, а также сайты отжига универсальных праймеров М13 fwd (17 п.н.) и М13 rev (17 п.н.) по обе стороны от генетической конструкции, фланкированной плечами гомологии к локусу ААVS1 человека.

В результате трансфекции культуры клеток человека плазмидой pSNCA-C-3XFLAG-2XST-donor совместно с плазмидой, экспрессирующей компоненты системы CRISPR-Cas9 (например, рХ458 (Addgene plasmid # 48138; http://n2t.net/addgene:48138; RRID:Addgene_48138)) или РНП-комплексом Cas9 с гидовой РНК, спейсерная последовательность которой гомологична участку локуса AAVS1, генетическая конструкция SNCA-C-3XFLAG-2XST, а также ген устойчивости к пуромицину PuroR вносятся в локус AAVS1, расположенный на хромосоме 19 человека. Плазмида pSNCA-C-3XFLAG-2XST-donor при этом служит матрицей для гомологичной рекомбинации в процессе CRISPR-Cas9-oпocpeдoвaннoгo редактирования генома.

Экспрессия трансгена SNCA-C-3XFLAG-2XST контролируется доксициклин-управляемым промотором, для активации которого необходим трансактиватор M2rtTA, который также должен экспрессироваться в клетке с внесенного трансгена (например, с использованием плазмиды AAVS1-Neo-M2rtTA (Addgene plasmid # 60843; http://n2t.net/addgene:60843; RRID: Addgene 60843)). Трансактиватор в комплексе с доксициклином взаимодействует с последовательностями tet operator в районе промотора трансгена SNCA-C-3XFLAG-2XST, тем самым запуская его экспрессию.

Химерный белок альфа-синуклеин, содержащий эпитопы 3×FLAG и 2×Strep-Tag II, служит инструментом изучения состава интерактома альфа-синуклеина в клетках человека при помощи выделения и очистки белковых комплексов с использованием аффинных смол, специфично связывающих стрептактиновый эпитоп (StrepTactin Sepharose High Performance (Cytiva, cat.No. 28935600)) и FLAG-пептид (ANTI-FLAG® M2 Affinity Gel (Sigma-Aldrich, cat.No. A2220)).

Изобретение иллюстрируется следующими фигурами: Фиг. 1. Графическая карта исходной плазмиды pSpCas9-HF1-donor, содержащей плечи гомологии к локусу ААVS1 человека.

Фиг. 2. Графическая карта оригинальной рекомбинантной плазмидной ДНК pSNCA-C-3XFLAG-2XST-donor, обеспечивающей стабильную доксициклин-управляемую экспрессию химерного белка альфа-синуклеина с эпитопами 3×FLAG и 2×Strep-Tag II в локусе AAVS1 клеток человека.

Фиг. 3. Проверка работоспособности предложенной системы методом вестерн-блот анализа тотальных белковых экстрактов клеток линии НЕK293A-Cpf1 -ТА, трансфицированных плазмидой pSNCA-C-3xFLAG-2XST-donor. 1-, 2-: без индукции доксициклином, 1+, 2+: после индукции доксициклином.

Фиг.4. Электрофореграмма ПЦР-продуктов, полученных при анализе субклонов линии m6.7 (ICGi015-B). SNCA_In - скрининг на наличие ДНК плазмиды pSNCA-C-3×FLAG-2XST-donor, TA_In - скрининг на наличие ДНК плазмиды AAVS1-Neo-M2rtTA, SNCA_HAL - скрининг на встройку целевого трансгена (кДНК гена SNC4+эпитопы,) в локус AAVS1, TA_HAL - скрининг на встройку трансгена с транс-активатором в локус AAVS1, K - отрицательный контроль, М - маркер (100 bp DNA ladder, Thermo Fisher Scientific).

Фиг. 5. Вестерн-блот анализ тотальных белковых экстрактов субклонов №1, 2, 5, 7, 9, 10, 14, 16, культивируемых в присутствии (+dox) или отсутствии (-dox) доксициклина. В качестве негативного контроля (K) использовались белковые экстракты из линии индуцированных плюрипотентных стволовых клеток здорового человека K7-4Lf (ICGi022-А).

Для лучшего понимания сущности предлагаемого изобретения, оно иллюстрируются следующими примерами конкретного осуществления.

Пример 1. Подтверждение синтеза белкового продукта pSNCA-C-3XFLAG при активации работы трансгена доксициклином.

Провели временную трансфекцию клеток линии НЕK293А-Срf1-ТА созданной плазмидной конструкцией pSNCA-C-3XFLAG (фиг.2), в двух повторностях. Эти клетки уже несут в своем геноме трансактиватор M2rtTA, который должен обеспечивать экспрессию альфа-синуклеина в присутствии доксициклина. Через 48 часов после трансфекции выделили белковые экстракты, чтобы с помощью Вестерн-блот анализа определить, экспрессируется ли альфа-синуклеин с плазмиды и управляется ли его экспрессия доксициклином. В случае, если альфа-синуклеин синтезируется, мы ожидали увидеть продукт молекулярной массой около 18 кДа. Подтвердили, что система действительно работает для плазмид, кодирующих ген SNCA с эпитопами 3×FLAG и 2×Strep Tag II на С-конце белка (фиг.3). В присутствии 2 мкг/мл доксициклина альфа-синуклеин с эпитопами действительно нарабатывается, а в отсутствии доксициклина синтез белка отсутствует или значительно снижен.

Таким образом, доказано, что созданная плазмидная конструкция действительно обеспечивает управляемую экспрессию альфа-синуклеина в присутствии доксициклина. Значит, их можно использовать для исследования спектра взаимодействий альфа-синуклеина в культурах клеток человека.

Пример 2. Интеграция трансгена SNCA-C-3×FLAG-2XST в локус AAVS1 индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека с помощью СRISPR/Саs9-опосредованной гомологичной рекомбинации.

Клетки были трансфицированы смесью плазмид pSNCA-C-3×FLAG-2XST-donor, AAVS1 -Neo-M2rtTA и pX458-AAVS1. Таким образом, мы произвели доставку, во-первых, компонентов системы CPISPR/Cas9, необходимых для встройки трансгенов в локус AAVS1, а во-вторых, донорных молекул ДНК, необходимых для встройки тетрациклинового трансактиватора (в один аллель локуса AAVS1) и кДНК гена SNCA, имеющего 3xFLAG-3nnTon и 2xStrep-Tag II-эпитоп на С-конце белка (в другой аллель локуса AAVS1). После трансфекции линии m6.7 (ICGi015-B), описанной в [3], была проведена селекция в течение 4 суток с использованием пуромицина (конечная концентрация 200 мкг/мл), ген устойчивости к которому встраивается в локус AAVS1 совместно с геном SNCA, затем с помощью неомицина (конечная концентрация 75 мкг/мл) в течение 7 суток (ген устойчивости к нему встраивается совместно с трансактиватором, обеспечивающим управляемую экспрессию). После селекции выжившие колонии клеток механически переносили на новую культуральную посуду (каждую колонию в отдельную лунку). Полученные субклоны культивировали в течение нескольких дней, пассировали 1-2 раза, затем проводили повторную селекцию. Выжившие субклоны анализировали с помощью ПЦР на наличие необходимых встроек в геном (фиг.4). Для проведения ПЦР-скрининга ДНК из клеток выделяли с помощью реагента Quick Extract (Epicentre) по протоколу производителя. Затем проводили полимеразную цепную реакцию с помощью реагента Биомастер HS-Taq ПЦР-Color (Биолабмикс). Реакционные смеси готовили согласно инструкции производителя. Использовали следующие пары праймеров:

1. Для проверки наличия встройки трансгена SNCA-C-3×FLAG-2XST в локус AAVS1 5'-CCGGACCACTTTGAGCTCTAC-3' и 5'-CATGTTCGGGTGCCACGCGGA-3'; размер продукта - 1023 п.н.

2. Для проверки наличия встройки трансгена M2rtTA в локус AAVS1 5'-CCGGACCACTTTGAGCTCTAC-3' и 5'-CTACCTAACGTGCGTCCAAGA-3'; размер продукта - 1042 п.н.

3. Для проверки наличия нецелевой встройки ДНК донорной плазмиды pSNCA-C-3×FLAG-2XST-donor 5'-CGGTGGGAGGCCTATATAAGC-3' и 5'-GAAATTTGTGATGCTATTGC-3'; размер продукта - 916 п.н.

4. Для нецелевой встройки ДНК донорной плазмиды AAVSl-Neo-M2rtTA 5' -CTGTGG ATTCGGGTC АССТС-3' и 5'-CTACCTAACGTGCGTCCAAGA-3'; размер продукта-461 п.н.

Реакцию проводили на амплификаторе С1000 Touch Thermal Cycler (Bio-Rad) по следующей программе: 95°С - 5 мин, далее 34 цикла: 95°С -30 с, 61°С - 30 с, 72°С - 30 с (для пары праймеров №4) или 1 мин (для пар праймеров №№1-3), затем 72°С - 5 мин. ПЦР-анализ показал, что 8 субклонов из 9 содержат обе целевые встройки именно в целевом участке генома - локусе АА VS1.

Пример 3. Детекция экспрессии белка альфа-синуклеина и 3×FLAG-2×Strep-Tag II эпитопов с помощью Вестерн-блот анализа Детекцию синтеза белка альфа-синуклеина и 3×FLAG-2×Strep-Tag II эпитопов с внесенного в геном клеток трансгена в субклонах, полученных в Примере 2, проводили с помощью вестерн-блот анализа (фиг.5). В качестве негативного контроля использовали белковые экстракты из линии индуцированных плюрипотентных стволовых клеток здорового человека линии K7-4Lf (ICGi022-A), охарактеризованной в [4].

При анализе образцов с использованием антител на альфа-синуклеин (Anti-a-Synuclein antibody produced in rabbit, Merck, Cat.# S3063), детектировали сигналы, соответствующие белкам с молекулярной массой 18 и 30 кДа. Молекулярная масса белка альфа-синуклеина - 14,5 кДа, а суммарная молекулярная масса эпитопов 3×FLAG и 2×Strep tag II - около 3,5 кДа. Сигналы, соответствующие белкам молекулярной массы 18 кДа, довольно ярко детектируются в образцах белковых экстрактов, выделенных из клеток после добавления доксициклина, но практически не детектируются в образцах, в которых индукции трансгена доксициклином не производилось. В связи в этим, можно предположить, что эти сигналы соответствуют белкам, синтезированным с внесенного в геном клеток трансгена. Продукты с молекулярной массой около 30 кДа соответствуют димерной форме альфа-синуклеина, которая может существовать в клетке в равновесии с мономерной формой [5].

При использовании антител на 3×FLAG-эпитон (Purified anti-DYKDDDDK Epitope Tag, BioLegend Cat.# PRB-132P), были также обнаружены белковые продукты молекулярной массой 30 кДа. Данный факт подтверждает то, что химерный альфа-синуклеин, к которому присоединен эпитоп, тоже участвует в формировании димеров альфа-синуклеина, и наличие 3×FLAG-2×Strep-Tag II эпитопов не препятствует димеризации альфа-синуклеина.

Так как в контрольных образцах отсутствуют сигналы, соответствующие белкам, молекулярной массой 30 кДа, можно предположить, что формированию димеров альфа-синуклеина в наших субклонах способствует повышенное количество белка в клетке (в связи с увеличением копийности гена).

Таким образом, впервые получена плазмида pSNCA-C-3XFLAG-2XST-donor, обеспечивающая доксициклин-управляемую экспрессию химерного белка альфа-синуклеина с эпитопами 3×FLAG и 2×Strep-Tag II, в локус ААVS1 клеток человека с помощью гомологичной рекомбинации.

Использование рекомбинантной плазмиды pSNCA-C-3XFLAG-2XST-donor позволит решить одну из фундаментальных проблем изучения механизмов развития синуклеинопатий - отсутствие тестовых клеточных систем для изучения определенных аспектов развития патогенеза. Экспрессия химерного белка SNCA-C-3XFLAG-2XST позволит изучить спектр белок-белковых взаимодействий альфа-синуклеина в культурах клеток человека при помощи выделения и очистки белковых комплексов с использованием аффинных смол, специфично связывающих стрептактиновый эпитоп и FLAG-пептид в составе химерного белка с последующим анализом состава выделенных комплексов.

ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ

1. Gloeckner CJ, Boldt К, Schumacher A, Roepman R, Ueffing M. A novel tandem affinity purification strategy for the efficient isolation and characterisation of native protein complexes. Proteomics. 2007 Dec;7(23):4228-34. doi: 10.1002/pmic.200700038. PMID: 17979178.

2. Ran FA, Hsu PD, Wright J, Agarwala V, Scott DA, Zhang F. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 2013 Nov;8(l 1):2281-2308. doi: 10.1038/nprot.2013.143. Epub 2013 Oct 24. PMID: 24157548; PMCID: PMC3969860.

3. Sharipova DV, Kovalenko VR, Bairamova EM, Vartanova VA, Grigor'eva EV, Vyatkin YV, Khabarova EA, Rzaev DA, Zakian SM, Medvedev SP. Generation of two iPSC lines, (КХИ015-А and ICGi015-B), by reprogramming peripheral blood mononuclear cells from a patient with Parkinson's disease. Stem Cell Res. 2019 Dec;41:101652. doi: 10.1016/j.scr.2019.101652. Epub 2019 Nov 9. PMID: 31733442.

4. Malakhova AA, Grigor'eva EV, Pavlova SV, Malankhanova ТВ, Valetdinova KR, Vyatkin YV, Khabarova EA, Rzaev JA, Zakian SM, Medvedev SP. Generation of induced pluripotent stem cell lines ICGi021-A and ICGi022-A from peripheral blood mononuclear cells of two healthy individuals from Siberian population. Stem Cell Res. 2020 Oct;48:101952. doi: 10.1016/j.scr.2020.101952. Epub 2020 Aug 8. PMID: 32805537.

5. Marmolino D, Foerch P, Atienzar FA, Staelens L, Michel A, Scheller D. Alpha synuclein dimers and oligomers are increased in overexpressing conditions in vitro and in vivo. Mol Cell Neurosci. 2016 Mar;71:92-101. doi: 10.1016/j.mcn.2015.12.012. Epub 2015 Dec 19. PMID: 26711807.

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3"

fileName="pSNCA-C-3XFLAG-2XST-donor.xml" softwareName="WIPO Sequence"

softwareVersion="2.0.0" productionDate="2022-06-07">

<ApplicantName languageCode="ru">Федеральное государственное

бюджетное научное учреждение Федеральный исследовательский центр

«Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской

академии наук» (ИЦиГ СО РАН)</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>Institute of Cytology and Genetics, Siberian

Branch of Russian Academy of Sciences</ApplicantNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Рекомбинантная плазмидная ДНК

pSNCA-C-3XFLAG-2XST-donor, обеспечивающая стабильную

доксициклин-управляемую экспрессию химерного белка альфа-синуклеина в

культурах клеток человека</InventionTitle>

<INSDSeq_length>10325</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..10325</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>cacctaaattgtaagcgttaatattttgttaaaattcgcgttaaatttt

tgttaaatcagctcattttttaaccaataggccgaaatcggcaaaatcccttataaatcaaaagaataga

ccgagatagggttgagtgttgttccagtttggaacaagagtccactattaaagaacgtggactccaacgt

caaagggcgaaaaaccgtctatcagggcgatggcccactacgtgaaccatcaccctaatcaagttttttg

gggtcgaggtgccgtaaagcactaaatcggaaccctaaagggagcccccgatttagagcttgacggggaa

agccggcgaacgtggcgagaaaggaagggaagaaagcgaaaggagcgggcgctagggcgctggcaagtgt

agcggtcacgctgcgcgtaaccaccacacccgccgcgcttaatgcgccgctacagggcgcgtcccattcg

ccattcaggctgcgcaactgttgggaagggcgatcggtgcgggcctcttcgctattacgccagctggcga

aagggggatgtgctgcaaggcgattaagttgggtaacgccagggttttcccagtcacgacgttgtaaaac

gacggccagtgaattgtaatacgactcactatagggcgaattgggtacctgctttctctgaccagcattc

tctcccctgggcctgtgccgctttctgtctgcagcttgtggcctgggtcacctctacggctggcccagat

ccttccctgccgcctccttcaggttccgtcttcctccactccctcttccccttgctctctgctgtgttgc

tgcccaaggatgctctttccggagcacttccttctcggcgctgcaccacgtgatgtcctctgagcggatc

ctccccgtgtctgggtcctctccgggcatctctcctccctcacccaaccccatgccgtcttcactcgctg

ggttcccttttccttctccttctggggcctgtgccatctctcgtttcttaggatggccttctccgacgga

tgtctcccttgcgtcccgcctccccttcttgtaggcctgcatcatcaccgtttttctggacaaccccaaa

gtaccccgtctccctggctttagccacctctccatcctcttgctttctttgcctggacaccccgttctcc

tgtggattcgggtcacctctcactcctttcatttgggcagctcccctaccccccttacctctctagtctg

tgctagctcttccagccccctgtcatggcatcttccaggggtccgagagctcagctagtcttcttcctcc

aacccgggcccctatgtccacttcaggacagcatgtttgctgcctccagggatcctgtgtccccgagctg

ggaccaccttatattcccagggccggttaatgtggctctggttctgggtacttttatctgtcccctccac

cccacagtggggcaagcttctgacctcttctcttcctcccacagggcctcgagagatctggcagcggaga

gggcagaggaagtcttctaacatgcggtgacgtggaggagaatcccggccctaggctcgagatgaccgag

tacaagcccacggtgcgcctcgccacccgcgacgacgtccccagggccgtacgcaccctcgccgccgcgt

tcgccgactaccccgccacgcgccacaccgtcgatccggaccgccacatcgagcgggtcaccgagctgca

agaactcttcctcacgcgcgtcgggctcgacatcggcaaggtgtgggtcgcggacgacggcgccgcggtg

gcggtctggaccacgccggagagcgtcgaagcgggggcggtgttcgccgagatcggcccgcgcatggccg

agttgagcggttcccggctggccgcgcagcaacagatggaaggcctcctggcgccgcaccggcccaagga

gcccgcgtggttcctggccaccgtcggcgtctcgcccgaccaccagggcaagggtctgggcagcgccgtc

gtgctccccggagtggaggcggccgagcgcgccggggtgcccgccttcctggagacctccgcgccccgca

acctccccttctacgagcggctcggcttcaccgtcaccgccgacgtcgaggtgcccgaaggaccgcgcac

ctggtgcatgacccgcaagcccggtgcctgatctagagggcccgtttaaacccgctgatcagcctcgact

gtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgcca

ctcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattct

ggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggattgggaagacaatagcaggcatgctggggatgcg

gtgggctctatggcttaagtaagatacattgatgagtttggacaaaccacaactagaatgcagtgaaaaa

aatgctttatttgtgaaatttgtgatgctattgctttatttgtaaccattataagctgcaataaacaagt

tggggtgggcgaagaactccagcatgagatccccgcgctggaggatcatccagccggcgtcccggaaaac

gattccgaagcccaacctttcatagaaggcggcggtggaatcgaaatctcgtaccggtcatcctgcagcc

ttgtcatcgtcatccttgtaatcgatgtcatgatctttataatcaccgtcatggtctttgtagtcgctcg

agactttcctcttcttcttgggggatccgtcacccccaagctgtgacaaatctatccgagtttcatataa

tcccgtgatggattggtgaatcagtgtcgcgtctagcacctccttggtagaagtgtatcgtttgcgatct

atcgttgtgtcaaaatacttgaatgcggctggagcgccgaggttggtaagagtaaacaaatggataatat

tttccgcctgctcacgtatgggtttatccctgtgcttgttgtatgcgcttaatactttgtccagattggc

atcagctaggatgactctcttactgaattccgaaatttgctctatgatttcgtcgagataatgtttgtgc

tgctcaacaaaaagttgcttctgttcgttatcttcaggtgaacctttcaacttctcgtaatgggacgcta

aatacaggaaattcacgtatttagacggtagtgcgagttcgttccccttttgaagctctccggcgctagc

caacatccgttttcggccattttctaactcaaacagactatactttggtagtttaattatgagatccttt

tttacttccttgtaacctttcgcctcaaggaagtcgatggggttcttttcaaaagacgagcgctccataa

tcgttatccccaataattctttgactgacttcagtttcttggattttcccttctcaacttttgccactac

taggacagaataggcaactgtagggctatcgaagccaccgtactttttcgggtcccagtcctttttacga

gcgatgagcttatcactattcctttttggaagaatcgattcctttgaaaaccctccggtctgcacctcag

ttttctttactatgttgacttggggcatggacaaaacttttctcaccgtcgcgaagtcccggcccttatc

ccatacgatttcacctgtctccccattggtttcaattaaaggtcgtttgcgtatctctccgtttgccaga

gtgatttccgtcttaaagaaattcataatgttagaataaaagaagtatttggctgtagccttgcctatct

cctgttcgcttttcgcgatcatcttacggacgtcataaactttgtaatcaccatacacaaactcactttc

tagcttcgggtatttcttaatgagtgcggtccctacgacggcattaagataagcgtcgtgcgcatggtgg

tagttatttatctccctaactttatagaattgaaaatcctttctgaagtccgacaccaattttgacttta

aagtgattactttgacttcccgaatcagcttatcgttctcgtcgtatttcgtattcattcgggaatctag

tatctgcgcaacatgctttgtgatggcgcgggtttccacgagctgacgtttaataaatccggccttgtca

agttcagacaagccacccctctcagctttagttaagttatcgaactttctttgcgttatcagtttcgcat

ttaggagctgccgccaatagttcttcattttctttacgacttcctcgcttggaacattgtcacttttccc

tcggttcttatccgagcgtgtaagcactttattgtcgattgaatcgtccttcaaaaaggattggggtaca

atgtgatcgacgtcgtaatcagataaacggtttatgtccagttcctgatcaacatacatgtcccttccat

tttgtaggtaatagaggtaaagtttctcgttctgcaattgggtattttccacaggatgctcctttaagat

ctggctgcccagttctttaataccctcttctattctcttcatccgctctcgactgtttttttgccccttc

tgagtcgtttgattttcgcgtgccatctcgattacaatgttttccggtttgtgacgtcccatgaccttaa

ctagctcatccactactttgactgtctggagtatgccctttttgatggctggcgaaccagcaagattcgc

aatatgttcgtgcaatgagtccccttgtccggaaacctgtgccttttgtatatcctctttgaaggttaaa

gagtcatcatggatcagggccataaagttcctattggcgaagccgtcgctctttagaaaatcgagaatag

ttttaccactttgcttgtctcttatcccgttgataagtttccgcgacaaggctccccagcccgtatagcg

acgcctctttaactgtttcataaccttatcgtcgaacaggtgagcgtatgtttttagtctttcctcaatc

atttcccgatcttcaaagagggtaagagtcaacactatatcttctaagatatcttcattctcttcgttat

ccaggaagtccttatctttaattatctttaggaggtcatgatacgtaccaagtgacgcattaaatcgatc

ttctaccccggagatctcgacagaatcgaagcattcaattttcttaaagtagtcctctttcaattgctta

actgtcactttgcggttggtcttgaataacagatctactattgctttcttctgttctccgcttagaaagg

cgggtttacgcatgccctcagtgacatacttaactttcgtgagttcattgtacactgtgaaatactcgta

aagtaaactgtgcttaggcaatactttttcgttcggtaaattcttgtcaaaggcggtcatcctctcgatg

aacgattgagctgacgcacctttatcgacaacttcctcaaaattccagggagtaatcgtttcttcggact

ttcttgtcatccatgcgaaccgagagttccctcgggccaggggtcccacatagtaaggtatgcgaaaggt

taggattttctcaatcttttcacgattgtctttgaggaacggataaaaatcctcctgccttctaagtata

gcatgcaattcgcctaagtggatttgatgtggaatgctaccgttgtcgaaagtccgctgctttcgcagta

gatcttcgcgattgagttttacaagcaactcttccgtcccatccatcttctctaatatgggtttgataaa

cttgtagaattcctcttgactcgctccgccgtcaatataacctgcgtacccgtttttcgactgatcaaag

aatatttccttatatttctcaggcagttgctgacggactagggccttgagaagtgtcaagtcttggtgat

gttcatcgtaccttttgatcattgaagcggataacggcgccttggtaatctcagtattaactctcagtat

gtcagataggaggattgcatcgctaaggtttttggcagccaaaaataagtccgcatactgatctccaatt

tgtgccagtagattgtcgagatcgtcatcgtacgtgtccttactaagctgcaatttggcatcttcagcta

agtcgaagttcgacttaaaatttggtgtcaggcctagtgagagcgctataaggttaccgaacaacccatt

tttcttctctccgggtaattgtgcgatcaggttttctagccgtcgggatttagagaggcgggcgctaaga

atagccttcgcatccacgccacttgcatttatagggttctcttcaaacaactgattataggtttgtacta

actggatgaacagtttgtcgacatccgagttgtccggatttagatcaccctcaatgagaaagtgcccacg

gaactttatcatatgggcaagagccaagtagattaacctcaggtccgctttatcagttgagtcaactagc

ttttttctgaggtgataaatcgttgggtacttttcatgatatgccacctcatctactatgtttccaaaga

tggggtgccgttcatgtttcttgtcctcttcgacaaggaaggactcttccaaacggtgaaagaaagaatc

gtcaactttggccatctcattgctaaaaatttcttgtaagtaacatattcggttcttgcgacgtgtatac

cttctccgagcggttcgtttcaggcgagtcgcctctgccgtttcgccactatcgaataggagggcaccga

taagattctttttaatcgaatgacggtctgtgttccccaacaccttaaatttctttgaaggtactttgta

ttcatcggttatgacagcccatccaacggaattagtgccgatgtctaaaccaatagaatactttttatcc

atggtggcacgcgtggcgatctgacggttcactaaacgagctctgcttatataggcctcccaccgtacac

gcctacctcgacatacgttctctatcactgatagggagtaaactcgacatacgttctctatcactgatag

ggataaactcgacatacgttctctatcactgatagggagtaaactcgacatacgttctctatcactgata

gggagtaaactcgacatacgttctctatcactgatagggagtaaactcgacatcgttctctatcactgat

agggagtaaactcgacatacgttctctatcactgatagggagtaaactcgacagtactaagctttactag

ggacaggattggtgacagaaaagccccatccttaggcctcctccttcctagtctcctgatattgggtcta

acccccacctcctgttaggcagattccttatctggtgacacacccccatttcctggagccatctctctcc

ttgccagaacctctaaggtttgcttacgatggagccagagaggatcctgggagggagagcttggcagggg

gtgggagggaagggggggatgcgtgacctgcccggttctcagtggccaccctgcgctaccctctcccaga

acctgagctgctctgacgcggctgtctggtgcgtttcactgatcctggtgctgcagcttccttacacttc

ccaagaggagaagcagtttggaaaaacaaaatcagaataagttggtcctgagttctaactttggctcttc

acctttctagtccccaatttatattgttcctccgtgcgtcagttttacctgtgagataaggccagtagcc

agccccgtcctggcagggctgtggtgaggaggggggtgtccgtgtggaaaactccctttgtgagaatggt

gcgtcctaggtgttcaccaggtcgtggccgcctctactccctttctctttctccatccttctttccttaa

agagtccccagtgctatctgggacatattcctccgcccagagcagggtcccgcttccctaaggccctgct

ctgggcttctgggtttgagtccttggcaagcccaggagaggcgctcaggcttccctgtcccccttcctcg

tccaccatctcatgcccctggctctcctgccccttccctacaggggttcctggctctgctctactagttc

tagagcggccgccaccgcggtggagctccagcttttgttccctttagtgagggttaatttcgagcttggc

gtaatcatggtcatagctgtttcctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacacaacatacgagcc

ggaagcataaagtgtaaagcctggggtgcctaatgagtgagctaactcacattaattgcgttgcgctcac

tgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaatcggccaacgcgcggggagagg

cggtttgcgtattgggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcgg

cgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaaga

acatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccatag

gctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggacta

taaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccg

gatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcag

ttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgcc

ttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactg

gtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacgg

ctacactagaaggacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggt

agctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgc

gcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaa

ctcacgttaagggattttggtcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttaaattaaaaa

tgaagttttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaacttggtctgacagttaccaatgcttaatcagtg

aggcacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatccatagttgcctgactccccgtcgtgtagataac

tacgatacgggagggcttaccatctggccccagtgctgcaatgataccgcgagacccacgctcaccggct

ccagatttatcagcaataaaccagccagccggaagggccgagcgcagaagtggtcctgcaactttatccg

cctccatccagtctattaattgttgccgggaagctagagtaagtagttcgccagttaatagtttgcgcaa

cgttgttgccattgctacaggcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatggcttcattcagctccggt

tcccaacgatcaaggcgagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaagcggttagctccttcggtcctc

cgatcgttgtcagaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggttatggcagcactgcataattctct

tactgtcatgccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagtactcaaccaagtcattctgagaatag

tgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaatacgggataataccgcgccacatagcagaactt

taaaagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggcgaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagatc

cagttcgatgtaacccactcgtgcacccaactgatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttctggg

tgagcaaaaacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagggaataagggcgacacggaaatgttgaatactca

tactcttcctttttcaatattattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcggatacatatttga

atgtatttagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacatttccccgaaaagtgc</INSDSeq_sequ

ence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<INSDSeq_length>6705</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..6705</INSDFeature_location>