Способ приготовления гистологических препаратов для выявления внутриклеточных липидных включений в тканях человека и животных

Изобретение относится к области медицины, конкретно к цитологии, гистологии и патологической анатомии и может быть использовано при приготовлении гистологических препаратов для выявления внутриклеточных липидных включений в тканях человека и животных.

Важность выявления клеточных липидных включений в патоморфологии как человека, так и экспериментальных животных сложно переоценить. Это связано с тем, что атеросклероз, гипертоническая болезнь и ишемическая болезнь сердца (ИБС) составляют печальную триаду XXI века. К этой триаде с полным правом можно добавить и тесно связанные с атеросклерозом неврологические заболевания - инсульт и сосудистую деменцию, учитывая их высокую социальную значимость и инвалидизирующие последствия [1]. Атеросклероз-ассоциированные цереброваскулярные заболевания (ЦВЗ) - вторая по частоте (20%) причина деменции в США и Европе после болезни Альцгеймера (БА) [2]. Отмечается существенный вклад ЦВЗ в патогенез ряда нейродегенеративных заболеваний: около 50% лиц, страдающих БА, имеют признаки ЦВЗ, выявляемые при патоморфологических исследованиях [3, 4, 5]. Липиды содержатся во всех клетках человека и животных [6]. Будучи одним из основных компонентов биологических мембран клеток, липиды влияют на проницаемость их мембран и активность многих клеточных ферментов, а также участвуют в передаче нервного импульса, в мышечном сокращении, в создании межклеточных контактов и иммунохимических процессах. Липиды образуют энергетический резерв организма человека и животных, участвуют в создании водоотталкивающих и термоизоляционных покровов живых существ и защищают различные органы от механических воздействий.

При определенных условиях (например, в полевых условиях) для целей окраски липидов невозможно использование замороженных срезов, приготовленных в криостате, или с использованием замораживающего микротома (учитывая громоздкость и сложность транспортировки этого оборудования, а также его дороговизну). В этом случае на помощь приходит применение альтернативных методик окраски тканей на липидные включения. Для этого удобно использовать окраски на парафиновых срезах, изготовленных из парафиновых блоков, фиксацию, проводку и заливку для которых можно выполнить в любых условиях, включая походные.

Актуальность предлагаемого способа для биологии, цитологии, гистологии и патологической анатомии обусловлена ролью фосфолипидов и цереброзидов в организме в норме и патологии.

Известен способ приготовления гистологических препаратов для выявления внутриклеточных липидных включений в животных тканях [7], включающий взятие образцов исследуемой ткани, фиксацию последних в течение 1-5 недель в 40% растворе формальдегида, содержащем соли кобальта и кальция, последующую обработку образцов 3% раствором бихромата калия (K₂Cr₂O₇) в течение 2 суток, обезвоживание образцов тканей в ацетоне комнатной температуры, погружение их в расплавленный парафин. Из полученных парафиновых блоков на микротоме изготавливались срезы и наносились на предметные стекла. В дальнейшем они обрабатывались по следующей схеме [8]: срезы переносились в 70% этиловый спирт, окрашивались в течение 30 мин. при комнатной температуре в насыщенном растворе Судана черного «В» в 70% этиловом спирте, избыток красителя удалялся ополаскиванием в 70% этиловом спирте, срезы промывались водопроводной водой, при необходимости, докрашивались квасцовым кармином Майера (в течение 16 часов), промывались водой, заключались в водную глицерин-желатиновую среду для хранения.

Недостатками известного способа являются длительность процесса фиксации образцов и окрашивания срезов, использование достаточно токсичных солей хрома и применение этанола.

Наиболее близким к заявляемому способу-прототипу является способ приготовления гистологических препаратов для выявления внутриклеточных липидных включений в животных тканях [9], включающий взятие образцов исследуемой ткани, фиксацию последних в 10% растворе формалина, приготовление, без заливки в парафин, из них срезов на замораживающем микротоме (или в криостате) и наклеивание последних на предметные стекла. В дальнейшем срезы, наклеенные на стекла (гистологический препарат), обрабатывались по следующей схеме: срезы окрашивались в растворе Судана черного «В» в пропиленгликоле в течение 5-7 мин. Краситель приготовлялся растворением 0,7 г. Судана черного «В» в 100 мл чистого пропиленгликоля, при нагревании до 100° в течение нескольких минут. Далее гистологические препараты переносились в 85% раствор пропиленгликоля на 2 мин., затем переносились в 50% раствор пропиленгликоля на 2 мин., далее промывались в теплой воде в течение 1 мин., при необходимости, докрашивались гематоксилином Майера в течение 4 мин., повторно промывались водой и заключались в водную глицерин-желатиновую среду.

Недостатками прототипа являются сложность и длительность способа, необходимость наличия специальных условий (криостат, или замораживающий микротом), и применение не всегда доступного пропиленгликоля, а также использование водной глицерин-желатиновой среды, требующей довольно трудоемкой окантовки покровного стекла валиком из специальной мастики для создания так называемой «влажной камеры», не удобной для длительного архивного хранения полученных гистологических препаратов.

Задачей изобретения является упрощение и удешевление известного способа, обеспечение возможности выполнения способа в полевых условиях, а также исключение применения водной глицерин-желатиновой среды для заключения окрашенных гистологических препаратов и их архивного хранения.

Технический результат: упрощение и удешевление известного способа, повышение качества гистологических препаратов.

Поставленная задача достигается предлагаемым способом, заключающимся в следующем.

После забора биоматериала, образцы изучаемой ткани заливают фиксирующим раствором (фиксатором) на основе 10% раствора формалина, содержащего соли нитрата кобальта и ацетата кальция, и выдерживают в течение 13-15 дней в темноте при температуре 10-15°С. Уплотненные в фиксаторе образцы изучаемой ткани при помощи бритвы нарезают на тонкие полоски, толщиной не более 2 мм, обсушивают при помощи фильтровальной бумаги, избегая нажима на исследуемую ткань. Полученные полоски ткани, без предварительной промывки в воде, быстро обезвоживают в трех порциях холодного чистого ацетона (при температуре 0-4°С), по 20 минут в каждой порции, при постоянном перемешивании. Из последней порции ацетона образцы изучаемой ткани переносят сразу же в расплавленный парафин, содержащий 5% пчелиного воска. Далее по стандартной методике выполняют изготовление парафиновых блоков, приготовление из них гистологических срезов толщиной от 7 до 15 микрометров на санном или ротационном микротоме, фиксацию расправленных парафиновых срезов на предметных стеклах, предварительно покрытых для лучшей адгезии тонким слоем яичного белка и высушенных в термостате.

После депарафинизации срезов в О-ксилоле, стекла со срезами «проводят» по водным растворам изопропилового спирта убывающей концентрации (от 100% до 70%, с шагом в 10%), споласкивают в двух порциях дистиллированной воды, а затем выдерживают в двух порциях 100% этиленгликоля. После этого приступают к процессу окраски срезов в растворе Судана черного «В» в этиленгликоле (концентрация раствора 15,3 ммоль/л) в течение 7-9 минут при комнатной температуре.

Далее стекла со срезами, без промывки, переносят в 85% водный раствор этиленгликоля и выдерживают в течение 2-3 минут. Затем стекла со срезами промывают в трех сменах дистиллированной воды в течение 3-4 минут, после чего заключают срезы в 16% водный раствор поливинилового спирта под покровные стекла для изучения препаратов под микроскопом и длительного архивного хранения полученных гистологических препаратов.

Определяющими отличиями предлагаемого способа от прототипа, являются:

- образцы исследуемой ткани обезвоживают в трех порциях ацетона при температуре 0-4°С, по 20 минут в каждой порции, при постоянном перемешивании, что позволяет упростить способ за счет исключения стадий их предварительной промывки в проточной воде и уплотнения в спиртах возрастающей концентрации (путем проводки материала по батарее, состоящей из растворов этилового спирта возрастающей концентрации: 50%, 60%, 70%, 80%, 96%, абсолютный (100% этанол) 1-й, абсолютный 2-й);

- для заливки образцов используют расплавленный парафин, содержащий 5% пчелиного воска, что позволяет улучшить пластические свойства парафина и получить более тонкие срезы на санном или ротационном микротоме;

- для окраски срезов используют раствор Судана черного «В» в этиленгликоле в концентрации 15,3 ммоль/л, который является более дешевым и легко доступным, обладающим лучшей проникающей способностью в ткани, чем раствор в пропиленгликоле, используемый в прототипе;

- после депарафинизации в О-ксилоле, стекла с наклеенными на них срезами (гистологические препараты) «проводят» по водным растворам изопропилового спирта убывающей концентрации, что позволяет упростить и удешевить способ за счет большей доступности и дешевизны изопропилового спирта, по сравнению с этиловым спиртом, используемым в прототипе;

- для целей архивного хранения, окрашенные Суданом черным «В», гистологические препараты помещают в 16% водный раствор поливинилового спирта, что позволяет исключить применение водной глицерин-желатиновой среды, требующей довольно трудоемкой окантовки покровного стекла валиком из специальной мастики для создания так называемой «влажной камеры», не удобной для длительного архивного хранения полученных гистологических препаратов.

Предлагаемый способ является более простым, чем способ-прототип, поскольку в нем отсутствуют стадии отмывки образцов тканей в проточной воде и уплотнение их в спиртах возрастающей концентрации, приготовление срезов на замораживающем микротоме или в криостате.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения.

Пример 1.

Образцы ткани печени мыши заливают фиксатором на основе 10% раствора формалина, содержащего соли нитрата кобальта и ацетата кальция, и выдерживают в течение 15 дней в темноте при температуре 10°С. Водный раствор фиксатора содержит в своем составе кальция ацетат безводный в концентрации 158,06 ммоль/л, кобальта нитрат безводный в концентрации 54,66 ммоль/л, растворенные при комнатной температуре в 10% (1:10) водном растворе свежего продажного формалина.

Уплотненные в фиксаторе образцы изучаемой ткани при помощи бритвы нарезают на тонкие полоски, толщиной не более 2 мм. Полученные полоски обсушивают при помощи фильтровальной бумаги, затем быстро обезвоживают в трех порциях холодного чистого ацетона (при температуре 0-4°С), по 20 минут в каждой порции, при постоянном перемешивании. Из последней порции ацетона образцы ткани переносят в расплавленный парафин, содержащий 5% пчелиного воска. Далее, выполняют изготовление парафиновых блоков, приготовление из них гистологических срезов толщиной от 7 до 15 микрометров на санном микротоме, фиксацию расправленных парафиновых срезов на предметных стеклах, предварительно покрытых для лучшей адгезии тонким слоем яичного белка и высушенных в термостате.

После депарафинизации в О-ксилоле, стекла со срезами «проводят» по водным растворам изопропилового спирта убывающей концентрации (от 100% до 70%, с шагом в 10%), споласкивают в двух порциях дистиллированной воды, а затем выдерживают в двух порциях 100% этиленгликоля.

Готовят красящий раствор путем растворения 0,7 г Судана черного «В» в 100 мл безводного этиленгликоля при нагревании на водяной бане (до 100°С) и постоянном помешивании в течение 3-5 минут, затем полученный раствор охлаждают до комнатной температуры и фильтруют под вакуумом. После этого приступают к процессу окраски срезов в растворе Судана черного «В» в этиленгликоле (в концентрации 15,3 ммоль/л) в течение 7 минут при комнатной температуре.

Далее срезы на стеклах переносят в 85% водный раствор этиленгликоля и выдерживают в течение 2-х минут. Затем срезы на стеклах промывают в трех сменах дистиллированной воды в течение 3-х минут, после чего заключают в 16% водный раствор поливинилового спирта под покровные стекла для изучения препаратов под микроскопом и длительного архивного хранения полученных гистологических препаратов.

Липиды в гепатоцитах и эритроцитах печени мыши окрашиваются в черный или темно-коричневый цвет, что зависит от содержания в них липидов.

В результате получают гистологические препараты высокого качества с сохраненной гистоструктурой, позволяющей быстро и достоверно провести исследование.

На фиг. 1 представлена фотография среза печени мыши (увеличение ×250). На фотографии видно значительное накопление липидов, жировой гепатоз с очаговой вакуольной, гидропической дистрофией гепатоцитов. На фоне неравномерно выраженного капиллярно-венозного полнокровия с эритростазами неравномерное расширение перисинусоидальных пространств Диссе.

Пример 2.

Образцы ткани печени мыши заливают фиксатором на основе 10% раствора формалина, содержащего соли нитрата кобальта и ацетата кальция, и выдерживают в течение 13 дней в темноте при температуре 15°С. Водный раствор фиксатора содержит в своем составе кальция ацетат безводный в концентрации 158,06 ммоль/л, кобальта нитрат безводный в концентрации 54,66 ммоль/л, растворенные при комнатной температуре в 10% (1:10) водном растворе свежего продажного формалина.

Уплотненные в фиксаторе образцы изучаемой ткани при помощи бритвы нарезают на тонкие полоски, толщиной не более 2 мм. Полученные полоски обсушивают при помощи фильтровальной бумаги, затем быстро обезвоживают в трех порциях ацетона (при температуре 0-4°С), по 20 минут в каждой порции, при постоянном перемешивании. Из последней порции ацетона образцы ткани переносят в расплавленный парафин, содержащий 5% пчелиного воска. Далее, по стандартной методике, выполняют изготовление парафиновых блоков, приготовление из них гистологических срезов толщиной от 7 до 15 микрометров на санном или ротационном микротоме, фиксацию расправленных парафиновых срезов на предметных стеклах, предварительно покрытых для лучшей адгезии тонким слоем яичного белка и высушенных в термостате.

После депарафинизации в О-ксилоле, стекла со срезами (гистологические препараты) «проводят» по водным растворам изопропилового спирта убывающей концентрации (от 100% до 70%, с шагом в 10%), споласкивают в двух порциях дистиллированной воды, а затем выдерживают в двух порциях 100% этиленгликоля.

После этого приступают к процессу окраски срезов в растворе Судана черного «В» в этиленгликоле (в концентрации 15,3 ммоль/л) в течение 9 минут при комнатной температуре.

Далее срезы на стеклах переносят в 85% водный раствор этиленгликоля и выдерживают в течение 3-х минут. Затем срезы на стеклах промывают в трех сменах дистиллированной воды в течение 4-х минут, после чего заключают гистологические препараты в 16% водный раствор поливинилового спирта под покровные стекла для изучения препаратов под микроскопом и длительного архивного хранения полученных гистологических препаратов.

На фиг. 2 представлена фотография среза печени мыши (увеличение ×400). Отмечается умеренно выраженное накопление липидов, очаговая вакуольная дистрофия гепатоцитов.

В результате выполнения предлагаемого способа были получены хорошие результаты окрашивания структур исследуемой ткани, содержащих липиды. Это позволяет рекомендовать данный способ для приготовления гистологических препаратов исследуемых тканей для выявления внутриклеточных липидных включений в полевых условиях при отсутствии криостата или замораживающего микротома.

Литература.

1. Яхно Н.Н., Захаров В.В., Деменции М.: Мед-пресс-информ. 2011. 272 с.

2. Fratiglioni L, Launer LJ, Andersen K, et al. Incidence of dementia and major subtypes in Europe: a collaborative study of population-based cohorts. Neurologic diseases in the elderly research group. Neurology 2000; 54(11 Suppl 5):S10-5.

3. Левин O.C., Трусова H.A. Сосудистые факторы риска болезни Альцгеймера // Журнал неврологии и психиатрии им. Корсакова. 2013. Т. 113. №7. С. 3-12.

4. Schneider J.A. High blood pressure and microinfarcts: a link between vascular risk factors, dementia, and clinical Alzheimer's disease. J. Am Geriatr Soc. 2009 Nov; 57(11):2146-7. doi: 10.1111/j.1532-5415.2009.02521.x.

5. Schneider J.A., Bennett D.A. Where vascular meets neurodegenerative disease. Stroke 2010; 41(10 Suppl): S144-6.

6. Fahy E. et al. A comprehensive classification system for lipids // J. Lipid. Res. 2005. V. 46, №5. P. 839-861.

7. McManus J.F.A. Granules of the human polymorphonuclear leucocyte // Nature. - 1945. - T. 156. - №.3954. - C. 173.

8. McManus J.F.A. The demonstration of certain fatty substances in paraffin sections // The Journal of pathology and bacteriology. - 1946. - T. 58. - №.1. - C. 93-95.

9. Chiffelle T.L., Putt F.A. Propylene and ethylene glycol as solvents for Sudan IV and Sudan black В // Stain technology. - 1951. - T. 26. - №.1. - C. 51-56.