Результат интеллектуальной деятельности: Набор реагентов для выявления РНК вируса SARS-CoV-2, возбудителя нового коронавирусного заболевания COVID-2019, методом обратной транскрипции-полимеразной цепной реакции в реальном времени

Изобретение относится к области вирусологии и биотехнологии, а именно - к разработке средств выявления и идентификации возбудителей опасных инфекционных заболеваний вирусной этиологии, и может быть использовано для выявления РНК вируса SARS-CoV-2 в клинических биологических пробах.

Случаи пневмонии неясной этиологии были зарегистрированы в начале декабря 2019 г. в г. Ухань (КНР), власти КНР известили ВОЗ о вспышке нового заболевания 31 декабря 2020 г. [Shih G., Sun L.H. Specter of possible new virus emerging from central China raises alarms across Asia // Washington Post, 8 January 2020 [Электронный ресурс] URL: https://flipboard.com@WashPost/specter-of-possible-new-virus-emerging-from-central-china-raises-alarms-across-a/a-LVUQPrl5Qi6rS4m5HImRlg%3Aa%3A419161690-66088e4a98%2Fwashingtonpost.com. (дата обращения: 09.01.2020); The continuing COVID-2019 epidemic threat of novel coronaviruses in global health - The latest 2019 novel coronavirus outbreak in Wuhan China / D.S. Hu, E.I. Azhar, T.A. Madani et al. // Intern. J. Infect. Dis. - 2020. - Vol. 91. - P. 264-266].

Большинство подтвержденных случаев заболевания были зарегистрированы у рабочих и покупателей Южно-китайского оптового рынка морепродуктов в г.Ухань, поэтому с высокой долей вероятности вспышка заболевания, в дальнейшем получившего название COVID-2019 (англ. COrona VIrus Disease), была ассоциирована с указанным рынком морепродуктов. Рынок был закрыт только 1 января 2020 г., однако, как показали дальнейшие события, это не предотвратило распространение инфекции по всему миру.

Согласно решению ВОЗ, ситуация со всемирным распространением COVID-2019 была признана пандемией [ВОЗ объявила пандемию коронавируса [Электронный ресурс] URL: https//ruslan.rtcom/world/news/72746/ (дата обращения 11.03.2020)].

Коронавирусы образуют подсемейство Coronavirinae в пределах семейства Coronaviridae, порядка Nidovirales. Согласно классификации Международного комитета по таксономии вирусов (ICTV), в настоящее время семейство Coronaviridae включает 4 рода: Alphacoronavirus, Betacoronavirus, Gammacoronavirus и Deltacoronavirus. Коронавирусы распределены на роды на основе принципов филогении и определения степени гомологии для семи высококонсервативных доменов репликазного полипротеина [De GrootRJ. Family Coronaviridae // King AMQ. Virus taxonomy, the 9th report of the international committee on taxonomy of viruses / ed. by M.J. Adams, E.B. Cartens, E.J. Lefkowitz. - Academic Press: San Diego, CA - 2012. - P. 806-828].

Заболевание человека вызывают представители родов Alphacoronavirus и Betacoronavirus. Генетическое разнообразие короновирусов и их изменчивость обеспечивается за счет высокой частоты рекомбинации их геномной РНК и способностью геномов коронавирусов приобретать и утрачивать домены [De Groot R.J. Family Coronaviridae // King AMQ. Virus taxonomy, the 9th report of the international committee on taxonomy of viruses / ed. by M.J. Adams, E.B. Cartens, E.J. Lefkowitz. - Academic Press: San Diego, CA - 2012. - P. 806-828; Nidovirales: evolving the largest RNA virus genome / A.E Gorbalenya, L. Enjuanes, J. Ziebuhr, E.J. Snijder // Virus Res. -2006. - Vol. 117. - P. 17-37; Masters P.S. The molecular biology of coronaviruses // Adv. Virus Res. - 2006. - Vol. 66. - P. 193-292; Snijder E.J. Unique and conserved features of genome and proteome of SARS-coronavirus, an early split-off from the coronavirus group 2 lineage // J. Mol. Biol. - 2003. - Vol.331. - P. 991-1004].

Именно эти факторы способствуют спонтанному появлению новых коронавирусов, которые способны адаптироваться к новым хозяевам и экологическим нишам, что потенциально может быть причиной возникновения вспышек вызываемых ими заболеваний.

Полногеномное секвенирование геномной РНК нового коронавируса проведено в первой половине января 2020 г. Размер генома составил 29903 нуклеотидных остатка (и.о.), структура его генома сходна со структурой генома других коронавирусов: 5' - нетранслируемый регион (№№ позиций генома 1-265), открытые рамки считывания OFR-1A (266-13468) и OFR-1B (13468-21555), ген S (21563-25384), ген OFR-3A (25393-26220), ген Е (26245-26472), ген М (26523-27191), ген OFR-6 (27202-27387), ген OFR-7 (27394-27759), ген OFR-8 (27894-28259), генЫ (28274-29533), ген OFR-10 (29556-29674), нетранслируемый регион (29675-29903) - 3' [CDC Novel coronavirus, (COVID-2019) Wuhan, China [Электронный ресурс] URL: https://www.cdc.gov/coronavirus/COVID-2019/summary.html. (дата обращения 29.01.2020); Qin A., Hernández J.C. China Reports First Death From New Virus //_The New York Times, 10 January 2020 [Электронный ресурс]. URL: htttps://www.wikizero.com/2019%E2%80%9320_outbreak_of_novel_coronavirus_(2019-nCoV) (дата обращения: 12.01.2020); China reports 136 more cases in two days (in Chinese) // Wuhan Municipal Health Commission [Электронный ресурс] Archived from the original on 20 January 2020 (дата обращения 20.01.2020)].

Изучение молекулярно-генетических характеристик коронавируса SARS-CoV-2 имеет важное значение при создании эффективных средств выявления и идентификации возбудителя и диагностики COVID-2019.

Последовательность геномной РНК SARS-CoV-2 сходна с таковой у коронавирусов, выделенных от летучих мышей (уровень гомологии более 90%) и отличается от MERS-CoV и SARS-CoV. Уровень гомологии с SARS-CoV не более 80% [CDC Novel coronavirus, (COVID-2019) Wuhan, China [Электронный ресурс] URL: https://www.cdc.gov/coronavirus/COVID-2019/summary.html. (дата обращения 29.01.2020)].

Анализ структуры генома позволяет предположить, что с большой долей вероятности коронавирус SARS-CoV-2 является продуктом положительной селекции вследствие мутационной изменчивости коронавируса панголинов [On the origin and evolution of SARS-CoV-2 / X. Tang, C. Wu, X. Li et al. [Электронный ресурс] URL: https://acadimic/oup.com/nsr/advance-article-abstract/doi/10.1093/nsr/nwaa 038/57775463 (дата обращения 09.03.2020)].

Особенностью SARS-CoV-2 является высокая аффинность рецептор-связывающего S-белка к ангеотензин-превращающему ферменту 2 (АПФ2) человека, что может быть использовано для входа в чувствительные клетки также, как и в случае инфицирования вирусом SARS-CoV [Uncanny similarity of unique insert in the COVID-2019 spike protein to EQV-1 gpl20 and Gag / P. Pradhan, A.K. Pandey, A. Mishra et al. // bioRxiv preprint firs posted online 31.01.2020 [Электронный ресурс] URL: http://dx.doi.org/10.1101/2020/0130.927871 (дата обращения 06.02.2020); Snijder E.J. Unique and conserved features of genome and proteome of SARS-coronavirus, an early split-off from the coronavirus group 2 lineage // J. Mol. Biol. - 2003. - Vol. 331. - P. 991-1004].

Генетический анализ 103 проанализированных изолятов вируса SARS-CoV-2 позволил выявить линию L, более вирулентную для человека, и менее вирулентную линию S, являющуюся предком линии L. Полногеномное секвенирование показало, что геномы данных линий различаются заменами в позициях 8782 (ген OFR-1A) и 28144 (ген OFR-8). Замена в позиции 8782 (линия S-T, линия L-C) является синонимической. Замена в позиции 28144 (линия S-C, линия L-T) приводит к замене серина (для линии S) в позиции 84 аминокислотной последовательности белка, кодируемого геном OFR-8 на лейцин (для линии L) [On the origin and evolution of SARS-CoV-2 / X. Tang, C. Wu, X. Li et al. [Электронный ресурс] URL: https://acadimic/oup.com/nsr/advance-article-abstract/doi/10.1093/nsr/nwaa 038/57775463 (дата обращения 09.03.2020)].

При отсутствие средств профилактики и лечения заболевания, вызванного SARS-CoV-2, приоритетным направлением совершенствования системы биологической защиты населения Российской Федерации при возникновении чрезвычайной ситуации биологического характера в результате возможного возникновения вспышки на ее территории является разработка средств выявления и идентификации возбудителя. Ведущее положение при создании такого рода средств занимают методы молекулярной биологии и молекулярной генетики.

Важное значение имеет такой показатель используемого метода, как чувствительность. Чем выше чувствительность используемого метода исследования, тем меньше возможность получения ложноотрицательных результатов. Для COVID-2019 этот показатель является особо актуальным, поскольку у ряда инфицированных (особенно вирусом SARS-CoV-2, относящимся к линии S) заболевание протекает без выраженных симптомов, но трансмиссия возбудителя осуществляется.

Целью настоящего изобретения является разработка олигонуклеотидных праймеров и создание набора реагентов для выявления РНК вируса SARS-CoV-2, возбудителя нового коронавирусного заболевания COVID-2019, методом обратной транскрипции-полимеразной цепной реакции в реальном времени (ОТ-ПЦР-РВ), включающего разработанные олигонуклеотидные праймеры в качестве специфических компонентов для постановки реакции при исследовании клинических и биологических проб.

Для этого были проведены следующие исследования:

- изучена структура генома вируса SARS-CoV-2, проведено ее сравнение со структурами геномов вирусов SARS-CoV и MERS-CoV, выявлены вариабельные и консервативные участки геномов патогенных для человека коронавирусов;

- на основе проведенного анализа обоснован выбор амплифицируемой области генома;

- разработаны олигонуклеотидные праймеры и зонд, используемые в качестве специфических компонентов набора реагентов;

- обоснован состав специфических и неспецифических компонентов набора;

- обоснованы параметры проведения реакции амплификации;

- определена чувствительность, специфичность, воспроизводимость метода ОТ-ПЦР-РВ при использовании разработанных нами специфических компонентов набора реагентов;

- при использовании разработанного набора реагентов продемонстрирована возможность воспроизводимого выявления РНК вируса SARS-CoV-2 в клинических пробах, полученных от больных COVID-2019, при ее концентрации не менее 1⋅10³ геном-эквивалентов (Г-Э) в 1 см³.

Сущность изобретения заключается в том, что выявление РНК вируса SARS-CoV-2, возбудителя нового коронавирусного заболевания COVID-2019, осуществляется методом ОТ-ПЦР-РВ с использованием разработанных олигонуклеотидных праймеров, обладающих активностью прямого и обратного праймеров в полимеразной цепной реакции, и олигонуклеотидного зонда, имеющих специфическую область гибридизации (позиции нуклеотидных остатков 5327-5518) в составе генома вируса SARS-CoV-2 в области гена OFR-1A, находящихся в лиофильно высушенном состоянии, и являющимися специфическими компонентами набора реагентов для выявления; и позволяет осуществлять воспроизводимое выявление РНК вируса SARS-CoV-2 в клинических биологических пробах с концентрацией РНК не менее 1⋅10³ Г-Э в 1 см³.

Следует отметить, что использование лиофильно высушенных компонентов (олигонуклеотидных праймеров и зонда) допускает возможность транспортировки набора реагентов без соблюдения требований «холодовой цепи».

Набор реагентов для выявления РНК коронавируса SARS-CoV-2 - возбудителя COVID-2019, разработанный в ГНЦВБ «Вектор», зарегистрированный Росздравнадзором (11.02.2020 г., рег. №РЗН/2020/9677) имеет аналогичное предназначение и может считаться аналогом представляемого изобретения [Клещенко Е., ТоргашевА. Тест на коронавирус для России [Электронный ресурс] URL: https://pcr.neus//state/test-na-koronavirus-dlya-rossii (дата обращения 17.03.2020)].

К признакам представляемого изобретения, отличающимся от аналога, следует отнести:

- комплектность набора. В заявляемом нами наборе присутствуют все специфические и неспецифические компоненты, необходимые для исследования проб. В наборе-аналоге отсутствуют реагенты для экстракции вирусной РНК и проведения обратной транскрипции, что создает неудобства в процессе лабораторной диагностики;

- в заявляемом наборе реагентов в качестве положительного контрольного образца (ПКО) используется синтетическая РНК, нуклеотидная последовательность которой соответствует фрагменту последовательности гена OFR-1A генома вируса SARS-CoV-2, что позволяет контролировать стадию обратной транскрипции. В качестве ПКО в наборе-аналоге используется рекомбинантная плазмида с вставкой кДНК геномной РНК, причем в наборе-аналоге отсутствуют: реагент, позволяющий контролировать стадию обратной транскрипции, и внутренний контрольный образец (ВКО);

- олигонуклеотидные праймеры и зонд заявляемого набора находятся в лиофильно высушенном состоянии, тогда как в наборе-аналоге - в жидком, что существенно осложняет условия хранения и транспортировки;

- чувствительность заявляемого набора составляет 1⋅10³ Г-Э⋅см^-3. Согласно паспортным данным, чувствительность метода ОТ-ПЦР-РВ набора-аналога составляет 1⋅10 Г-Э⋅см^-3. Меньшая чувствительность набора-аналога может привести к гиподиагностике заболевания вследствие получения ложноотрицательных результатов.

Структура олигонуклеотидных праймеров и зонда, специфичных по отношению к указанному участку генома вируса SARS-CoV-2, представленная в данной заявке, в мире аналогов не имеет.

Техническим результатом изобретения является воспроизводимое выявление РНК коронавируса SARS-CoV-2 в клинических и биологических пробах, при ее концентрации не менее 1⋅10³ Г-Э⋅см^-3 без соблюдения требований «холодовой цепи» при транспортировке набора.

Указанный технический результат изобретения достигается за счет:

- выбора олигонуклеотидных праймеров, имеющих специфические области гибридизации в составе открытой рамки считывания OFR-1A коронавируса SARS-CoV-2, синтеза олигонуклеотидных праймеров, обладающих активностью прямого и обратного праймеров в ПЦР;

- комплектности набора, включающего специфические и неспецифические компоненты, необходимые для исследования проб;

- лиофильного высушивания синтезированных олигонуклеотидных праймеров и зонда.

Подбор олигонуклеотидных праймеров проводился с использованием программного обеспечения Vector NTI. Разработанные праймеры являются видоспецифичными в отношении коронавируса SARS-CoV-2.

Праймеры были синтезированы путем твердофазного химического синтеза с последующей очисткой методами электрофореза в полиакриламидном геле и высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Для повышения сохраняемости указанных специфических компонентов набора реагентов и обеспечения возможности транспортировки набора реагентов без соблюдения требований «холодовой цепи» проведено лиофильное высушивание синтезированных олигонуклеотидных праймеров и зонда, что позволяет осуществлять гарантийное хранение набора реагентов при температуре плюс 4°С в течение 12 месяцев.

Состав заявляемого нами набора реагентов, представлен в таблице 1.

Предлагаемое техническое решение является новым, поскольку в общедоступных источниках в Российской Федерации неизвестен набор реагентов, включающий все необходимые специфические и неспецифические компоненты, обеспечивающие воспроизводимое выявление РНК вируса SARS-CoV-2 методом ОТ-ПЦР-РВ, при ее концентрации в исследуемых пробах не менее 1⋅10³ Г-Э⋅см^-3 без соблюдения требований «холодовой цепи» при транспортировке набора.

Предлагаемое техническое решение имеет изобретательский уровень, поскольку предлагаемые олигонуклеотидные праймеры и зонд для выявления РНК вируса SARS-CoV-2 методом ОТ-ПЦР-РВ были разработаны в результате выбора и синтеза праймеров, имеющих ген OFR-1A в качестве области гибридизации в составе генома вируса SARS-CoV-2, что обеспечивает выявление РНК указанного вируса методом ОТ-ПЦР-РВ с получением воспроизводимых результатов в препаратах, с концентрацией РНК не менее 1,0⋅10³ Г-Э⋅см^-3.

Предлагаемое техническое решение промышленно применимо, поскольку для его реализации может быть использовано типовое биотехнологическое оборудование, а также широко распространенные в биотехнологической промышленности реактивы и материалы.

Заявляемый набор реагентов, на основе разработанных праймеров и олигонуклеотидного зонда целесообразно использовать при исследовании материала от больных, а также при подозрениях на COVID-2019 и индикации вируса SARS-CoV-2 в пробах окружающей среды, для проведения эпидемиологического мониторинга.

Возможность осуществления заявляемого изобретения показана следующим примерами.

Пример 1. Оценка специфичности разработанных олигонуклеотидов в отношении близкородственных гетерологичных коронавирусов

Для оценки специфичности разработанных олигонуклеотидов в отношении близкородственных гетерологичных коронавирусов с помощью программы AlignX пакета VectorNTIv.11 было подготовлено множественное выравнивание генома коронавируса, и гетерологичных коронавирусов. Результаты теоретического анализа специфичности представлены в таблице 2.

Результаты, представленные в таблице 2, позволяют сделать вывод, что в связи со значительным количеством нуклеотидных замен амплификация гетерологичных коронавирусов с помощью разработанных праймеров и зонда невозможна.

Пример 2. Экспериментальное исследование аналитической чувствительности и воспроизводимости метода ОТ-ПЦР-РВ при использовании разработанного набора реагентов

Чувствительность, специфичность, воспроизводимость метода ОТ-ПЦР-РВ при использовании разработанных нами специфических компонентов набора реагентов определяли с помощью искусственно созданной ГИК, представляющей собой синтетическую РНК, характеризующуюся следующей первичной структурой:

Определение аналитической чувствительности биологическим (вирусологическим) методом проводили следующим образом. Путем разведений, выполненных двукратным шагом приготовляли пробы, содержащие различные количества Г-Э. Полученные препараты подвергали анализу с помощью в ОТ-ПЦР-РВ при использовании разработанных нами олигонуклеотидных праймеров и зонда. Результаты анализа представлены в таблице 3.

Результаты расчетов, представленные в таблице 3, позволяют сделать вывод, что использование разработанных нами олигонуклеотидных праймеров и зонда ОТ-ПЦР-РВ позволит специфично выявлять РНК вируса SARS-CoV-2 в препаратах РНК, с концентрацией не менее 1,0⋅10³ Г-Е⋅см^-3. Суммарное количество положительных определений для концентрации 1,0⋅10³ Г-Е⋅см^-3 составляет 20 из 20, что соответствует воспроизводимости не менее 95% [Генес B.C. Некоторые простые методы кибернетической обработки данных диагностических и физиологических исследований. - М.: Наука, 1967. - 208 с.].

Таким образом, значение аналитической чувствительности составляет 1,0⋅10³ Г-Е⋅см^-3 с воспроизводимостью не менее 95%.

Пример 3. Экспериментальное исследование специфичности ОТ-ПЦР-РВ при использовании разработанного набора реагентов

Для экспериментального исследования специфичности ОТ-ПЦР-РВ при использовании разработанного набора реагентов оценивали препараты нуклеиновых кислот, полученные из вирусов, представляющих различные таксономические группы возбудителей острых респираторных заболеваний: коронавирусы SARS-CoV, MERS-CoV, CoV-OC43, CoV-229E, вирусы гриппа А (антигенные подтипы H1N1, H2N3, H5N1). Аналиты предоставлены Институтом им. Н.Ф. Гамалеи.

Критерием специфичности служило наличие флуоресцентного сигнала по каналу R6G при анализе препаратов РНК вируса SARS-CoV-2 и отсутствие сигнала по данному каналу при анализе гетерологичных РНК и ДНК.

Анализ проводили в трех повторностях с использованием критерия «единственного различия» - аналит обнаружен / аналит не обнаружен.

Результат считали истинно положительным в случае обнаружения аналита во всех пробирках с ГИК SARS-CoV-2 вируса MERS по каналу ROX.

Результат считали ложноотрицательным в случае отсутствия обнаружения аналита в любой из пробирок с ГИК SARS-CoV-2 по каналу ROX.

Результат считали истинно отрицательным в случае отсутствия обнаружения аналита во всех пробирках с РНК остальных мишеней по каналам R6G и ROX.

Результат считали ложноположительным в случае обнаружения аналита в любой из пробирок с РНК остальных мишеней по каналам R6G или ROX.

Критерием, согласно которому набор реагентов считали выдержавшим испытания на аналитическую специфичность, считали истинно положительный результат в отношении РНК вируса SARS-CoV-2 при истинно отрицательном результате в отношении всех остальных аналитов.

Результаты экспериментов, представленные в таблице 4, подтверждают специфичность испытываемого набора реагентов в отношении вируса SARS-CoV-2. Штаммы гетерологичных микроорганизмов не выявляются.

Пример 4. Анализ клинических проб, полученных от больных COVID-2019 и лиц с подозрением на COVID-2019 с помощью ОТ-ПЦР-РВ при использовании разработанного набора реагентов

В эксперименте определяли наличие РНК вируса SARS-CoV-2 в клинических пробах больных COVID-2019 и лиц с подозрением на COVID-2019 (сыворотки крови и носоглоточные смывы). Результаты исследований представлены в таблице 5.

Таким образом, разработанный в ФГБУ «48 ЦНИИ» Минобороны России набор реагентов, предназначенный для проведения диагностики заболевания COVID-2019, позволяет проводить воспроизводимое выявление РНК вируса SARS-CoV-2 при ее концентрации в исследуемых пробах не менее 1⋅10³ геном-эквивалентов в 1 см³ без соблюдения требований «холодовой цепи» при транспортировке набора.