Результат интеллектуальной деятельности: Биомедицинский клеточный продукт со специфической противоопухолевой активностью, представленный популяциями лимфокин-активированных киллеров и анти-HER2 CAR-γδΤ-ОИЛ и анти-HER2 CAR-T-NK

Изобретение относится к области онкологии, иммунологии, клеточных технологий и биоинженерии и может быть использовано для терапии солидных опухолей, в частности, рака молочной железы (далее РМЖ), яичников и остеогенной саркомы.

Гамма-дельта Т-клетки (далее γδ Т-клетки) являются Т-лимфоцитами неклассического типа, основное отличие которых от классических альфа-бета Т-клеток (αβ Т-клетки), помимо очевидного в типе составляющих их цепей, заключается в различных механизмах активации: γδ Т-клетки способны активироваться вне зависимости от присутствия рецепторов МНС, они реагируют активацией на некоторые фосфорилированные формы метаболитов, включая изопентинила пирофосфат, более интенсивное образование которого характерно для метаболизма злокачественных клеток. [Yazdanifar M, Barbarito G, Bertaina A, Airoldi I. γδ T Cells: The Ideal Tool for Cancer Immunotherapy. Cells. 2020;9(5):1305. Published 2020 May 24. doi:10.3390/cells9051305] Данная особенность γδ Т-клеток, наряду с другими, сделала их одним из перспективных направлений развития противоопухолевой терапии на основе клеточных технологий. [Kabelitz D, Serrano R, Kouakanou L, Peters C, Kalyan S. Cancer immunotherapy with γδ T cells: many paths ahead of us [published correction appears in Cell Mol Immunol. 2020;17(9):925-939. doi:10.1038/s41423-020-0504-x].

Из уровня техники известен биомедицинский клеточный продукт (далее БМКП), аналогичный заявляемому, описанный в статьях «Обладающие противоопухолевой активностью γδ T клеточные рецепторы дериваты из опухоль инфильтрирующих лимфоцитов рака молочной железы» [Janssen A, Villacorta Hidalgo J, Beringer DX, et al. γδ T-cell Receptors Derived from Breast Cancer-Infiltrating T Lymphocytes Mediate Antitumor Reactivity. Cancer Immunol Res. 2020; 8(4): 530-543. doi:10.1158/2326-6066.CIR-19-0513]. Описан способ получения белка, составляющего γδ Т-клеточный рецептор, из опухоль инфильтрирующих Т-лимфоцитов (далее ОИЛ), присутствующих в структуре и/или рядом с массой злокачественных клеток при раке РМЖ, также секвенирование мРНК, отвечающего за экспрессию данного рецептора на поверхности клеток. Основным недостатком способа является отсутствие концепции применения цельных γδ Т-клеток из пула ОИЛ наряду с натуральными киллерами (далее НК) и лимфокин-активированными клетками (далее ЛАКи) в качестве технологии терапии онкологических заболеваний, в частности, РМЖ, рака яичников и остеогенной саркомы.

Другой известный подход к клеточной терапии на основании γδ Т-клеток освещен в публикациях «Новая роль γδ Т-клеток в иммунотерапии злокачественных опухолей» [Nussbaumer О, Koslowski M. The emerging role of γδ T cells in cancer immunotherapy. Immuno-Oncology Technology, 2019;1:3-10, doi:10.1016/j.iotech.2019.06.002] и «Реактивность V{delta}2(neg) {gamma}{delta} Т-клеток в отношении клеток, инфицированных цитомегаловирусом, и эпителиальных клеток опухолей толстого отдела кишечника» [Halary F, Pitard V, Dlubek D, et al. Shared reactivity of V{delta}2(neg) {gamma} {delta} T cells against cytomegalovirus-infected cells and tumor intestinal epithelial cells. J Exp Med. 2005;201 (10): 1567-1578. doi:10.1084/jem.20041851]. В приведенных публикациях отображаются пути получения и применения γδ Т-клеток при терапии злокачественных опухолей. Основным недостатком аналога является отсутствие среди пула эффекторных клеток следующих популяций: ОИЛ, лимфокин-активированных киллеров и CAR-T-NK клеток.

Прототипом заявляемого изобретения является БМКП. описанный в патенте «Лечебные препараты на основе гамма-дельта Т-клеток и натуральных киллеров и методы их получения и применения» («Therapeutic preparations of gamma-delta t cells and natural killer cells and methods for manufacture and use», WO 202002104, 26.07.2018). Прототип описывает получение БМКП, состоящего из различных соотношений фракций γδ Т-клеток и НК различного фенотипа по экспрессии поверхностных маркеров CD16, CD57, CD4 и CD8, полученных из периферической крови, пуповинной крови, костного мозга, эпителиальной ткани или ткани печени любым методом, подразумевающим взаимодействие по типу антиген-антитело, включающим в себя инкубирование в целях активации и/или дифференцировки с любыми из полипептидов, взаимодействующих в том числе с рецепторами NKp30, NKp44, NKp46, KIR5, SIGLEC-7, KIR3D51, KIR2DL1, NKG2D, DNAM1, NTBA, CD2, KIR3DS1, CD3, PD1, OKT-3 и другими, а также с любыми из полипептидов, представляющих собой ИЛ-2, ИЛ-5, ИЛ-15, также полученных в присутствии фидерных клеток или при инкубировании с бифосфонатами, или полученных методом генетической модификации посредством системы CRISPR/cas9, или инкубирования с векторами на основании лентивирусов, или ретровирусов и несущих конструкцию одного или нескольких перечисленных далее в круглых скобках рецепторов: (а-фетопротеин (AFP), а-актинин-4, A3, специфическое к антигену А33 антитело, ART-4, В7, В7-Н3, Ва 733, BAGE, BrE3-антиген, СА125, CAMEL, САР-1, карбоангидраза IX, CASP-8/m, CCL19, CCL21, CD1, CD1a, CD2, CD3, CD4, CD5, CD8, CD11A, CD14, CD15, CD16, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD29, CD30, CD32b, CD33, CD37, CD38, CD40, CD40L, CD44, CD45, CD46, CD52, CD54, CD55, CD59, CD64, CD66a-e, CD67, CD70, CD70L, CD74, CD79a, CD79b, CD80, CD83, CD95, CD123, CD126, CD132, CD133, CD138, CD147, CD154, CDC27, CDK-4/m, CDKN2A, CTLA4, CXCR4, CXCR7, CXCL12. HIF-1a, колон-специфический антиген-р (CSAp), CEA (CEACAM-5), CEACAM-6, c-Met, DAM, EGFR, EGFRv111, EGP-1 (TROP-2), EG P-2, ELF2-M, Ep-CAM, фактор роста фибробластов (FGF), Flt-1, Flt-3, рецептор фолата, G250 антиген, GAGE, gp100, GRO-b, HLA-DR, HM1.24, человеческий хорионический гонадотропин (HCG) и его субъединицы, HER2/neu, HMGB-1, гипоксия индуцибельный фактор (HIF-1), HSP70-2M, HST-2, la, IGF-1R, IFN-g, IFN-a, IFN-b, IFN-1, IL-4R, IL-6R, IL-13R, IL-15R, IL-17R, IL-18R, IL-2, IL-6, IL-8, IL-12, IL-15, IL-17, IL-18, IL-23, IL-25, инсулиноподобный фактор роста-1 (IGF-1), KC4-антиген, KS-1-антиген, KS1-4, Le-Y, LDR/FUT, ингибирующий миграцию макрофагов фактор (MIF), GD2 (экспрессирующийся на поверхности опухолей нейроэктодермального происхождения дисиалоганглиозид), MAGE, MAGE-3, MART-1, MART-2, NY-ESO-1, T RAG-3, mCRP, MCP-1, MIP-1A, MIP-1B, MIF, MUC1, MUC2, MUC3, MUC4, MUC5ac, MUC13, MUC16, MUM-1/2, MUM-3, NCA66, NCA95, NCA90, муцин опухолей поджелудочной железы, PD1 рецептор, плацентарный фактор роста, р53, PLAGL2, фосфатаза простатической кислоты (prostatic acid phosphatase), PSA, PRAME, PSMA, PIGF, ILGF, ILGF-R, L-6, IL-25, RS5, RANTES, T101, SAGE, S100, сурвивин, сурвивин-2 В, TAC, TAG-72, тенасцин, TRAIL рецерторы, TNF-ct, Tn антиген, антигены Томсона-Фриденриха, антигены некроза опухоли, VEGFR, ED-B фибронектин, WT-1, 17-1А-антиген, факторы комплемента С3, С3а, C3b, С5а, С5, маркеры ангиогенеза. bcl-2, bcl-6, и Kras) для терапии широкого круга солидных опухолей и/или злокачественных новообразований кроветворной ткани.

Недостатком метода является выбор биологического материала-источника получения таргетных клеток: указанная в качестве источника получения таргетных клеток периферическая кровь не обладает таким же богатым пулом лейкоцитов для получения максимально обогащенной популяции НК и γδ Т-клеток, как отсутствующая в описании изобретения лейкомасса. Другим существенным недостатком метода является необходимость применения ряда нефармакопейных препаратов для активации клеток. Недостатком изобретения является также отсутствие среди действующего пула клеток и одновременно источника получения γδ T клеток ОИЛ, которые обладают выраженной опухоль специфической цитотоксичностью [Paijens ST, Vledder A, de Bruyn M, Nijman HW. Tumor-infiltrating lymphocytes in the immunotherapy era. Cell Mol Immunol. 2021;18(4):842-859. doi:10.1038/s41423-020-00565-9]. Недостатком также является использование в качестве векторной конструкции для индукции экспрессии химерного антигенного рецептора (далее CAR) на поверхности клетки лентивирусной и/или ретровирусной конструкции, которая известна риском эктопической вставки в структуру ДНК, что может привести к неэффективности экспрессии CAR. Помимо этого, характер экспрессии антигенной структуры на подобного типа векторах не ограничен во времени и может передаваться дочерним клеткам при делении, что, в свою очередь, может привести к замещению клона нативных аутологичных клеток химерным пулом Т-лимфоцитов.

Целью представляемого изобретения является получение БМКП со специфической противоопухолевой активностью, который может быть использован для терапии РМЖ, рака яичников и остеогенной саркомы.

Цель достигается тем, что получен БМКП со специфической противоопухолевой активностью, представленный двумя популяциями клеток: анти-HER2 CAR-γδT-ОИЛ с фенотипом CD4-, CD8-, CD3+, Vγ9 Vδ1 Vδ2 TCR+ и CAR-T-NK с фенотипом анти-HER2+CD16+CD56+, чья эффективность сопровождается одновременной активацией врожденного и адоптивного иммунного ответов, которые получают путем выделения опухоль-инфильтрирующих лимфоцитов из биоптата опухоли с последующей деплецией, αβT и В клеток и изоляцией субпопуляции γδT клеток и выделением периферических мононуклеарных лимфоцитов из донорской лейкотромбомассы / крови с получением из них пула T-NK и γδT клеток, последующей трансфекцией части клеток с целью экспрессии химерного антигенного рецептора HER2 для получения популяций анти-HER2 CAR-T-NK клеток и анти-HER2 CAR-γδT-ОИЛ-клеток.

Сходство прототипа с заявляемым изобретением заключается в выборе аутологичного биологического материала как источника эффекторных клеток, включение популяции цитокин-активированных клеток (в том числе, генетически модифицированных), использование HER2 в качестве мишени для конструкции химерного антигенного рецептора.

Преимущества заявленного изобретения заключаются в следующем: 1) используется доступный и богатый таргетными популяциями клеток биоматериал - лейкомасса; 2) в состав предлагаемого БКМП входят 2 клеточные эффекторные популяции - CAR-T-NK и CAR-γδТ-ОИЛ - которые формируют состав заявляемого продукта, обеспечивая его эффективность посредством прямого специфического противоопухолевого воздействия в условиях аберрации сигналлинга МНС системы и через активацию врожденного звена иммунитета; 3) отсутствие контаминации конечного продукта нефармакопейными препаратами (в частности, ОКТ3, рекомбинантными цитокинами и т.д.); 4) отсутствие необходимости в дополнительном контроле качества получения конечного продукта в виде секвенирования продукта перед его использованием, что требует увеличенного объема продукта в сравнении с заявляемым, временных затрат и дополнительно наличия определенного оборудования, реагентов и специалистов.

Техническим результатом заявленного изобретения является получение биомедицинского клеточного продукта (БМКП) со специфической противоопухолевой активностью, представленного двумя популяциями клеток: анти-HER2 CAR-T-NK и CAR-γδT-ОИЛ с ограниченным периодом экспрессии химерного антигенного рецептора (3-5 суток), чья эффективность сопровождается одновременной активацией врожденного и адоптивного иммунного ответов.

Заявляемый БМКП получают следующим образом: производят забор опухолевой ткани пациента методом биопсии, после чего выделяют ОИЛ, далее с помощью магнитных бидсов производят изоляцию γδT клеток, параллельно с этим производят забор крови и/или лейкомассы с последующим получением пула NK и γδT клеток за счет деплеции αβT и В клеток, затем проводят инкубирование полученных клеток с препаратом ряда бифосфонатов и интерлейкином-2, далее осуществляют трансфекцию клеток вектором, несущим конструкцию химерного антигенного рецептора к HER2/neu.

Заявляемый способ иллюстрируется таблицей «Уровни цитокинов в крови в контрольной группе и группе, получавшей терапию анти-HER2 CAR-γδT-ОИЛ и анти-HER2 CAR-T-NK»

В таблице приведены значения изменений уровня сывороточных цитокинов мышей инбредной линии BALB/nude в группе наблюдения (n=10), получавшей терапию анти-HER2 CAR-T-NK и CAR-γδT-ОИЛ в сравнении с группой контроля (n=10), отражающие влияние полученных пулов клеток на состояние врожденного звена иммунитета.

Заявляемый способ проиллюстрирован следующими примерами.

Пример 1. Получение БМКП с заявленными характеристиками

Пациенту была проведена биопсия опухолевого узла.

Полученную ткань гомогенизировали, после чего провели изоляцию γδT клеток на магнитных бидсах. Из донорской лейкотромбомассы были выделены периферические мононуклеарные лимфоциты, на вторые сутки были получены лимфокин-активированные киллеры, после чего была проведена деплеция αβT и В клеток и, таким образом, была получена обогащенная популяция T-NK. На третьи сутки с момента выделения провели трансфекцию лимфокин-активированных T-NK и γδT-ОИЛ вектором с химерным антигенным рецептором HER2.

На 4-5 сутки после выделения периферических мононуклеарных клеток и γδT клеток провели иммунофенотипическое исследование полученных популяций клеток методом проточной цитофлюориметрии (BD FACSCanto II, США), согласно которому 25% клеток были HER2 позитивными, из них γδT клеток составили 15%, NK 85%. Фенотип CAR-γδT клеток и CAR-γδT-ОИЛ был следующий: CD4-, CD8-, CD3+, Vγ9 Vδ1 Vδ2 TCR+; фенотип CAR-NK анти-HER2+CD16+CD56+. Повторно иммунофенотип клеток оценили спустя 5 суток после проведения трансфекции, при этом выявилось значительное снижение анти-HER2 CAR-T-NK и CAR-γδT-ОИЛ клеток (анти-HER2 положительных клеток): с 25% до 3%. Цитотоксическая способность полученных пулов клеток оценивалась на вторые сутки после проведения трансфекции с помощью МТТ-теста (Labsystems Multiscan MS, США, длина волны 540 нм) на Saos-2 (остесаркома) с индуцированной экспрессией HER2 и на HER2 позитивных культурах SKOV3 (рак яичника) и SkBr3 (рак молочной железы), клеточные линии остеогенная саркома. В соотношении клеток-эффекторов к опухолевым 5:1 цитотоксичность на культуре Saos-2 составила 86%, на SKOV3 составила 89%, на SkBr3 - 78%. Данный пример продемонстрировал наличие в продукте двух популяций клеток (анти-HER2 CAR-T-NK. CAR-γδТ-ОИЛ); ограниченный период экспрессии химерного антигенного рецептора анти-HER2 (5 суток); специфическую противоопухолевую активность на HER2 экспрессирующих опухолевых клеточных линиях (остеосаркома, РМЖ и рак яичников).

Пример 2. Влияние заявленного БМКП на показатели врожденного иммунитета у реципиента

Иммунодефицитные мыши модели инбредной линии BALB/nude с привитой опухолью SKOV3 (n=10) получали терапию анти-HER2 CAR-T-NK и CAR-γδT-ОИЛ в течение 15 дней в режиме 5*10^5 клеток каждый Зй день с момента привития опухоли. В результате в сравнении с контрольной группой наблюдалось торможение роста опухоли (ТРО) 41%. Сывороточные цитокины в группе наблюдения были повышены в сравнении с контрольной группой. Результаты представлены в таблице: ФНО-альфа на 45% (среднее значение 10 пг/мл (интервал 7-11 пг/мл) в контрольной группе и 14 пг/мл (12-15 пг/мл) в группе наблюдения); ИЛ6 на 52% (среднее значение 7 пг/мл (интервал 5-8 пг/мл) и 12,6 пг/мл (8-13 пг/мл) соответственно) и ИЛ1 на 87% (среднее значение 4,7 пг/мл (интервал 4-6 пг/мл) и 9,8 пг/мл (7,1-10 пг/мл) соответственно). Данный пример продемонстрировал специфическую противоопухолевую активность в виде ТРО 41% у мышей с привитой HER-2 положительной опухолью и активацию врожденного иммунитета в виде повышения концентрации сывороточных цитокинов.