Результат интеллектуальной деятельности: Способ выделения белков из костного мозга животных

Изобретение относится к биохимии, а именно к выделению белков из клеток костного мозга трубчатых костей животных.

Описан способ получения белка, RU 2298939 С2, A61K 35/28, 20.05.2007, путем выделения клеток из костного мозга лисиц, их суспендирование, фильтрация, центрифугирование фильтрата, после которого осадки вместе с надосадочными жидкостями в центрифужных пробирках подвергают трехкратному замораживанию и оттаиванию в холодильной камере, фильтрации через капроновые фильтры и осаждению 10% раствором трихлоруксусной кислоты и последующему диализу проточной водой.

Предложен также способ получения белка, RU 2553334 С2 A61K 35/28, 10.06.2015, предусматривающий извлечение костного мозга из трубчатых костей сибирской косули, его суспендирование, фильтрацию суспензии, центрифугирование фильтрата, гомогенизацию, фильтрацию через капроновые фильтры, высаливание с помощью сульфата аммония с последующим центрифугированием, осаждение 1% раствором трихлоруксусной кислоты, центрифугирование с последующим диализом проточной водой.

Недостатки данных способов заключаются в трудоемкости, длительности во времени и соблюдении особых условий белкового синтеза. Использование указанных концентраций трихлоруксусной кислоты не обеспечивает максимальный выход белка из раствора. Кроме того, конечный продукт получается недостаточно чистым.

Задача изобретения заключается в упрощении способа выделения общего белка из костного мозга трубчатых костей, увеличение объема выхода белка из того же количества клеток костного мозга и повышение чистоты целевого продукта.

Способ осуществления задачи изобретения достигается тем, что клетки костного мозга берут у сельскохозяйственных животных, трубчатые кости отделяют от плоти, в верхней и нижней части кости делают распил. Клетки костного мозга из бедренной или плечевой кости суспендируют путем вымывания через созданные отверстия с помощью шприца средой Игла М (средой 199) в колбу. Содержимое колбы тщательно перемешивают до однородного состава. Для тщательной очистки от желтого костного мозга суспензию пропускают через капроновые фильтры и отмывают 3 раза охлажденной средой Игла М (средой 199). Суспензию подвергают трехкратному замораживанию-оттаиванию в холодильной камере, в результате чего достигается разрушение клеточных стенок осадка из костного мозга, происходит дополнительное высвобождение белковых молекул в надосадочную жидкость, что влияет на выход конечного продукта. Для выделения белка и освобождение от обломков клеток содержимое пробирок фильтруют через капроновые фильтры. Из осадка делают мазки, окрашивают по общепринятым методикам и просматривают под микроскопом - клетки в них не обнаруживаются (гомогенная масса), следовательно, все биологически активные вещества переходят в раствор. Выделение белка проводят следующим образом.

В пробирки для центрифугирования с раствором белка добавляют раствор 20% раствор трихлоруксусной кислоты из расчета 2 капли раствора кислоты на 5 капель раствора белка. Для ретракции белков пробирки с содержимым оставляют на 12 ч в холодильнике при температуре +4°С. Для полного осаждения белка к надосадочной жидкости добавляют 0,5% раствор трихлоруксусной кислоты из того же расчета. Белок от раствора отделяют центрифугированием при 3000 об/мин в течение 5 мин - все приемы, их экспозиции и режимы установлены экспериментально, благодаря которым осуществляется наиболее полноценно данный способ и конечный результат, т.е. полное осаждение и отделение белка костного мозга из раствора. Осадки смывают небольшим количеством спирта, а затем эфира и переносят на часовое стекло для высушивания. Полученные таким образом белки для дальнейшей очистки подвергают диализу с целью удалению трихлоруксусной кислоты и восстановления гидратных оболочек протеина.

Для перевода сухого кристаллического белка в раствор берут 0,05 г белка и добавляют 0,45 мл 0,9% раствора хлорида натрия, тщательно перемешивают. Раствор белка помещают в емкость, отделенную от низкомолекулярного раствора (проточная либо дистиллированная вода) целлофановой мембраной. Диализ проводят проточной водой в течение 1-2 суток при непрерывной подаче и дистиллированной водой в течение 1 часа. Отсутствие кислоты контролируют нейтральной реакцией с индикатором. Раствор центрифугируют при 2000 об/мин в течение 5 мин, полученные осадки смывают спиртом и эфиром, затем высушивают на часовом стекле.

Пример 1.

Трубчатые кости от 3 голов крупного рогатого скота отделяют от плоти, затем производят распил с двух сторон и вымывают костное содержимое средой Игла М (среда 199) в колбу. Клеточные суспензии фильтруют через капроновые фильтры, которые предварительно стерилизуют. Суспензию подвергают трехкратному замораживанию-оттаиванию. В процессе проводят подсчет клеток суспендированного осадка средой Игла М (среда 199) в разведении 1:10 в камере Горяева. При последнем оттаивании в осадке обнаруживается гомогенная масса. Белки осаждают из раствора 20% трихлоруксусной кислотой из расчета 2 капли кислоты на 5 капель раствора белка, оставляют отстаиваться на 12 ч при температуре +4°С. Для дополнительного осаждения белка к надосадочной жидкости добавляют 0,5% раствор трихлоруксусной кислоты из того же расчета. Белок выделяют из раствора центрифугированием при 3000 об/мин в течение 5 мин. Осадки смывают спиртом и эфиром, высушивают на часовом стекле, взвешивают.

Вес общего белка, выделенного из костного мозга крупного рогатого скота, составляет 479±1,23 мг. Белок представляет собой аморфный порошок буро-коричневого цвета.

Пример 2.

Бедренные кости от 6 коз отделяют от плоти. Подготовку костного содержимого к выделению белка проводят, как описано в предыдущем примере. Белки из раствора осаждают 20% раствором трихлоруксусной кислоты. Содержимое пробирок оставляют в холодильнике на 12 ч при температуре +4°С. Для дополнительного выделения белка в пробирки вносят 0,5% раствор трихлоруксусной кислоты. Осадок обрабатывают и высушивают, как описано выше. Вес общего белка из костного мозга коз составляет 259±0,58 мг. Белок представляет собой аморфный порошок красно-коричневого цвета.

(В примерах 1 и 2, так же как и в примере 3, технические операции по получению белков костного мозга одинаковы и процесс диализа в них также осуществляется для дополнительной очистки при их дальнейшем использовании, однако как проводится диализ описано только в третьем примере, чтобы не повторяться и разнообразить пример).

Пример 3.

Бедренные кости от 5 поросят отделяют от плоти. Вымывание клеточных популяций, избавление от жировых прослоек и выделение белка проводят, как описано в предыдущих примерах. Вес общего белка, выделенного из костного мозга поросят, составляет 165±0,62 мг. Сухой кристаллический переводят в раствор. Для этого берут 0,05 г белка и добавляют 0,45 мл 0,9% раствора хлорида натрия, тщательно перемешивают. Раствор белка подергают диализу, поместив в емкость с целлофановой мембраной. Данную емкость ставят в чашу с проточной водой, которая подается непрерывно через шланг. Диализ в проточной воде проводят сутки. Затем в дистиллированной воде диализ протекает в течение часа. Раствор центрифугируют при 2000 об/мин в течение 5 мин, полученные осадки смывают спиртом и эфиром, затем высушивают на часовом стекле.

Отличительным преимуществом предлагаемого способа выделения белков из костного мозга трубчатых костей является доступность, сокращение времени экстракции белка, использование новых технологий, увеличение веса целевого продукта.