Способ диагностики цирроза печени (стадии F4) в исходе хронического вирусного гепатита С

Изобретение относится к медицине, а именно к области диагностики инфекционных болезней и осложнений в исходе заболевания, и может быть использовано для диагностики стадии цирроза печени (стадии F4) у больных хроническим гепатитом С.

Известно, что наиболее частой причиной развития хронических диффузных заболеваний печени с развитием фиброза печени является ее поражение вирусом гепатита С. По данным отчета Всемирной организации здравоохранения в 2017 году 170 миллионов человек в мире живут с хронической инфекцией, вызванной вирусом гепатита C, при этом подавляющее большинство этих людей не имеют доступа к необходимому обследованию и лечению (Глобальный доклад ВОЗ о гепатите 2017 г. (WHO Globalhepatitisreport, 2017). Россия занимает 5-ое место в мире по числу инфицированных вирусом гепатита С. В то время как, из 5,7 млн. инфицированных лечение получают 29,6 тыс. человек (около 5%).

Учитывая, что хронический гепатит С (ХГС) сопровождается неуклонным прогрессированием развития фиброза печени, увеличивается число случаев цирроза печени и гепатоцеллюлярной карциномы. Определить критерии прогрессирования фиброза печени у больных ХГС - сложная и чрезвычайно актуальная задача, решение которой определяет выбор адекватной тактики ведения больного.

К настоящему времени известны различные способы прогнозирования течения хронического гепатита С и диагностики стадий фиброза печени, основанные на разных методах исследования.

Наиболее достоверным методом диагностики стадии фиброза печени остается биопсия печени. (Соринсон С.Н. Вирусные гепатиты в клинической практике, СПб.: ТЕЗА, 1998, 331 с.). Гистологическое исследование позволяет уточнить причину заболевания печени, а также оценить стадию фиброза и индекс гистологической активности, принять решение о тактике ведения больного, оценить естественное течение или эффективность проведенной терапии.

Выраженность индекса фиброза измеряется по шкале METAVIR (Poynard Т., Bedossa P., Opolon P., Natural history of liver fibrosis progression in patients with chronic hepatitis C, The OBSVIRC, METAVIR, CLINIVIR and DOSVIRC groups, Lancet. 1997; 349 (9055): 825-832). Согласно этой шкале выделяют 5 стадий фиброза (F0, F1, F2, F3 и F4), где F0 соответствует отсутствию фиброза, a F4 - циррозу печени.

Однако биопсия печени является инвазивным методом с определенным процентом осложнений, проводится в условиях стационара и имеет ряд противопоказаний. Трудности трактовки результатов исследования биоптатов печени связаны с малым объемом исследуемого материала, не обязательно характеризующим изменения печени в целом, а также с неоднозначными оценками одного и того же препарата, которые дают разные морфологи. Также значительно затруднено наблюдение в динамике за развитием фиброза печени с помощью биопсии в силу инвазивности метода.

Существуют также неинвазивные способы диагностики, которые обладают рядом существенных недостатков.

Неинвазивный способ диагностики стадии фиброза печени при ХГС основан на применении комплексного ультразвукового исследования печени и селезенки. (Патент RU 2422091, опубл. 2011). Дополнительно проводят дуплексное сканирование с цветным допплеровским картированием сосудов порто-печеночного региона и определяют количественные показатели гемодинамики скорости кровотока в сосудах, в том числе в селезеночной вене. Кроме того, исследуют количество тромбоцитов, АЛТ, ACT, ГГТП, холестерин, щелочную фосфотазу, время рекальцификации плазмы, продолжительность кровотечения, фибриноген, тромбиновое время, протромбиновый индекс. Проводят дискриминантный анализ полученных характеристик и показателей, а далее с учетом возраста и экспериментально полученных коэффициентов вычисляют канонические дискриминантные функции, по значению которых оценивается стадия фиброза печени. Большое количество диагностических тестов делает этот способ достаточно трудоемким и дорогостоящим, что ограничивает его применение в широкой клинической практике.

Известен способ мониторинга фиброзного процесса в печени у больных хроническим гепатитом (Патент RU 2557926, опубл. 2015). Он заключается в определении 2 раза в год уровней цитокинов сыворотки крови, на основе которых рассчитывают интегральный показатель цитокинового профиля (ИПЦП). Далее при исходной стадии F0 рост ИПЦП выше 8 свидетельствует о дебюте фиброзных изменений в печени (переход на стадию F1). При исходной стадии F1 падение ИПЦП ниже - 10 свидетельствует о переходе на стадию F2; при исходной стадии F2 рост ИПЦП выше - 3 свидетельствует о прогрессировании до стадии F3, а при исходной стадии F3 падение ИПЦП ниже - 3 свидетельствует о развитии цирроза печени.

В качестве ближайшего аналога выбран способ оценки фиброза печени у больных хроническим вирусным гепатитом С, включающий проведение иммунологического исследования крови пациента с целью выявления предцирротической стадии фиброза и перехода ее в цирроз (F4) путем изучения фенотипа CD56+лимфоцитов крови, заключающийся в определении фенотипа СD56+лимфоцитов крови и по диапазону значений процентного содержания CD3+/CD56+, CD3+/CD56+/CD4+, CD3+/CD56+/CD8+, CD56+/CD94+, CD56+/NKG2D+, CD56+/CD107a+ клеток в крови диагностирование третьей стадии фиброза (предцирротической) или цирроза печени. (Патент RU 2416794, опубл. 2009)

В способе диагностики согласно ближайшему аналогу используется только единственный маркер фенотипа СD56+ лимфоцитов со специфическим анализом различных его рецепторов. Отсутствует полный анализ иммунного статуса с оценкой Т-лимфоцитов, несущих рецепторы к интерферонам альфа, гамма, значимых в противовирусном противовоспалительном иммунитете.

Все известные способы не указывают прогностические критерии прогрессирования стадии фиброза печени до цирроза печени у больных ХГС без отягощенного преморбидного фона.

Задачей предлагаемого способа является разработка неинвазивного способа прогнозирования формирования цирроза печени (стадии F4) на основе иммунологического исследования больных ХГС без отягощенного преморбидного фона и определения иммунологических критериев прогноза цирроза печени.

В основу предложенного способа положено исследование наиболее значимых субпопуляций лимфоцитов периферической крови, участвующих в иммунопатогенезе ХГС - общего количества Т-хелперов (CD4+), цитотоксических Т-лимфоцитов (CD8+), NK-клеток (CD3+CD16+), активированных Т- лимфоцитов с маркерами NK-клеток (CD3+CD56+), Т-лимфоцитов, экспрессирующих цепь 2 рецептора ИФН-α/β (CD118+) и α-цепи рецептора ИФН-γ (CD119+, CD45+CD4+CD119+) и доли Т-хелперов, экспрессирующих рецепторы к ИФН-гамма (CD4+CD119+). С последующим установлением иммунологических критериев прогрессирования фиброза печени до стадии тяжелого фиброза печени (F-4) в исходе ХГС.

Технический результат заключается в возможности проведения быстрой, доступной, нетравматичной, точной и высокоэффективной диагностики цирроза печени (стадии F4) в исходе ХГС, что обеспечивает своевременный выбор оптимальной тактики ведения пациентов после противовирусной терапии.

Технический результат достигается за счет осуществления предложенного способа оценки прогрессирования фиброза печени в исходе хронического вирусного гепатита C у больных без отягощенного преморбидного фона путем иммунологического исследования крови пациента перед началом терапии, включающего определение показателей клеточного иммунитета с высоким коэффициентом информативности Кульбака (J). Выявление снижения количества клеток CD19+ с J=2,7 и клеток CD56+ с J=10,0 в сочетании с повышением количества клеток CD45+CD4+CD119+ с J=30,4 и клеток CD 119+ с J=8,2 позволяет диагностировать прогрессирование фиброза до цирроза печени (стадии F4).

Существенная роль иммунной системы в хронизации вирусного гепатита С и в процессе фиброгенеза остается непререкаемой и характеристика иммунного ответа может служить одним из критериев прогрессирования фиброза.

Прогрессирующие течение ХГС неуклонно приводит к формированию фиброза печени (ФП), а затем и цирроза печени. Механизм развития ФП вытекает из многогранности морфологической реакции печени на повреждение. Фиброгенез - универсальный процесс прогрессирования хронических заболеваний печени, не зависящий от этиологических факторов, связанный с заменой паренхиматозных клеток соединительной тканью. (Сторожаков Г.И., Ивкова А.Н., Патогенетические аспекты фиброгенеза при хронических заболеваниях печени, Клинические перспективы гастроэнтерологии, гепатологии, 2009, №2., С. 3-10).

Основу фиброгенеза составляет избыточное накопление протеинов внеклеточного матрикса и тканевых коллагеназ. В нормальных условиях в печени существует баланс между процессами образования и разрушения компонентов внеклеточного матрикса. При патологии многочисленные повреждающие факторы запускают процессы, приводящие к чрезмерному синтезу и накоплению продуктов распада внеклеточного матрикса, а также способствуют нарушению деградации молекул внеклеточного матрикса. Непосредственными факторами управления фиброгенезом являются универсальные, а в ряде случаев специфические цитокины, регулирующие воспалительный ответ на повреждение гепатоцитов. Кроме того, прогрессирование ФП при ХГС тесно связано с развитием иммунного воспаления в печени - HCV подавляет клеточное звено иммунной системы, непосредственно влияя на CD4- и CD8-лимфоциты. Основное значение в противовирусной защите при ХГС имеет Т-клеточное звено иммунитета - Т-хелперы 1-го типа (Th1), которые стимулируют цитотоксическую активность CD8-лимфоцитов и макрофагов и усиливают экспрессию антигенов первого класса гистосовместимости на клетках-мишенях.

От состояния клеточного иммунитета и интерфероновой системы зависит противовирусная и противовоспалительная способность организма. Вместе с тем полученные ранее результаты исследований взаимосвязи показателей клеточного иммунитета и степени фиброза печени при ХГС крайне противоречивы.

Настоящее изобретение позволяет повысить достоверность диагностики цирроза печени (стадии F4) и своевременно выбрать оптимальную тактику ведения пациента с ХГС.

Раннее выявление стадии фиброза и определение прогноза течения ХГС позволяет начать лечение, направленное на уменьшение темпов развития цирроза и рака печени. На фоне проводимой терапии существует возможность обратного развития фиброза печени. (Ismail М.Н., Pinzani М., Reversal of Liver Fibrosis, Saudi J. Gastroenterology, 2009; 15 (1): 72-79).

При разработке предлагаемого способа было проведено клинико-лабораторное обследование 117 пациентов с подтвержденным диагнозом ХГС без отягощенного преморбидного фона, находящихся на диспансерном учете более 3-х лет. Из них 69 мужчин (59%) и 48 женщин (41%). Средний возраст обследуемых пациентов составил 45,7±2,1. При этом достоверно преобладала возрастная группа от 31 до 50 лет.

Контрольную группу составили 30 здоровых лиц, у которых отсутствовали какие-либо жалобы и клинико-лабораторные отклонения на момент обследования.

Критериями включения в исследования являлись: подтвержденный диагноз хронического вирусного гепатита С (маркеры HCV-инфекции методом ИФА и наличие РНК HCV методом ПЦР); возраст пациентов от 18 до 80 лет; отсутствие других гепатитов; наличие информированного согласия на участие в исследовании.

Критериями исключения стали: возраст младше 18 и старше 80 лет; наличие ко-, суперинфекции, обострения сопутствующих заболеваний в момент исследования; наличие тяжелых сопутствующих заболеваний, таких как: ВИЧ-инфекция, туберкулез, сахарный диабет, ожирение 2-ой степени и выше, неалкогольная жировая болезнь печени (НЖБП), бронхиальная астма, заболевания щитовидной железы; злоупотребление алкоголем и употребление внутривенных наркотических веществ последние 6 месяцев до начала исследования.

Диагноз подтверждали определением маркеров ХГС методом ИФА: а-HCV-IgM, IgG при помощи диагностических тест-систем «Вектор Бест» (Россия). РНК HCV в сыворотке крови определяли методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием тест-системы «АмплиСенс HCV-Монитор-FL» ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора (Россия).

Исследование субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови проводили методом проточной цитофлюорометрии на цитометре EPICS XL («Beckman Coulter», США). Помимо стандартной панели, необходимой для определения количества основных субпопуляций лимфоцитов, были разработаны дополнительные панели окрашивания для определения числа циркулирующих лимфоцитов, экспрессирующих цепь 2 рецептора ИФН-α/β и α-цепи рецептора ИФН-γ (CD118+, CD119+ - лимфоциты), а также популяции клеток CD45+CD4+CD119+.

По длительности инфицирования вирусом гепатита С больные были разделены на группы: от 3 до 5 лет инфицирования - 25 человек (22%), от 6 до 10 лет - 46 больных (39%) и свыше 10 лет инфицирования - 46 пациентов (39%), то есть большинство пациентов имели длительный стаж инфицирования.

Клиническая картина ХГС у обследуемых больных характеризовалась малосимптомностью. Основные клинические проявления были неспецифичны, и проявлялись астеноневротичеким синдромом, дискомфортом в правом подреберье и умеренной гепатомегалией. Основная часть пациентов не предъявляла никаких жалоб.

На основании определения уровня РНК ВГС пациенты были разделены на следующие группы: больные с низкой вирусной нагрузкой (менее 800 тыс. МЕ/мл) - 74 человека (63%) и 43 пациента (37%) с высокой вирусной нагрузкой (более 800 тыс. МЕ/мл).

При генотипировании ВГС выявлены генотипы 1b - 66 пациентов (56%), 2 генотип - 8 больных (7%) и 3а - 43 человека (37%).

Всем обследованным проводилась фиброэластометрия печени на аппарате «Фиброскан 502» (Echosens, Франция). Стадия фиброза определялась по шкале МЕТАВИР: стадия фиброза F0-1 - 38 пациентов (33%), F2 - 25 человек (21%), стадия F3 -25 больных (21%) и стадия F4 - 29 человек (25%). Группа обследованных со стадией F4 включала больных с компенсированным циррозом печени класса А по Чайлд-Пью.

У больных ХГС на разных стадиях фиброзного процесса выявлены различные и разнонаправленные отклонения иммунологических показателей. В ходе корреляционного анализа у больных ХГС не выявлены взаимосвязи иммунологических показателей на стадии F0-1. Значимые положительные связи на стадии фиброза F2 обнаружены с уровнем CD3+, CD8+, CD19+, CD16+, CD119+ при отрицательных умеренных связях стадии F2 с ИРИ и со степенью активации лимфоцитов (акт. CD56+ и акт. HLA-DR) и CD45+CD4+CD119+. Корреляционный анализ выявил только одну положительную связь умеренной силы между F3 и уровнем CD4+CD119+ (r=0,463; p=0,040). В свою очередь, цирроз печени (стадия F4) характеризуется положительной корреляционной связью с показателями CD19+ и активацией Т-лимфоцитов (акт. цит. CD38+, акт. CD45+ и акт. HLA-DR).

Целый ряд иммунологических показателей, характеризующих адаптивный иммунный ответ, подвергался достоверным сдвигам на разных стадиях фиброза печени, в связи с чем, возникла необходимость их дополнительного анализа на пригодность использования в качестве иммунологических критериев стадий фиброзного процесса.

С этой целью проводилось определение диагностических коэффициентов (ДК) и коэффициента информативности Кульбака (J) для выявления значимости отклонений иммунограммы у больных ХГС в зависимости от стадии фиброза печени. Этот метод позволяет определить информативную значимость повышения и снижения иммунологических показателей.

В ходе исследования было проведено вычисление диагностических коэффициентов с использованием статистического последовательного анализа Вальда, информативность каждого из диагностических коэффициентов рассчитывалась по формуле Кульбака:

J = ДК × 1/2 × (Р1-Р2),

где J - информативность диагностического коэффициента, ДК - диагностический коэффициент, Р1 и Р2 - вероятности проявления данного признака в основной и контрольной группе.

Информативным считаются признаки при J>0,5. Умеренная информативность при J от 0,5 до 2, выраженная при коэффициенте от 2,1 до 10 и сильная - более 10,1. Высокий коэффициент информативности Кульбака составляет от 2 до 10 или более 10.

Как представлено в Таблицах 1-2 получены информативные диагностические коэффициенты для пациентов с различными отклонениями иммунного статуса на разных стадиях ФП. По результатам исследования установлено, что повышение уровня CD118+, CD4+CD119+ высокоинформативны на всех стадиях фиброза печени.

При F0-1 информативность диагностического коэффициента повышения и значимого коэффициента Кульбака (J=29,8) выявлена только по уровню CD118+. У пациентов на стадии F2 определена информативность диагностического коэффициента как в снижении, так и в повышении, а также коэффициента Кульбака CD19+ (J=2,4), CD56+ (J=2,4), при этом более значима информативность снижения этих показателей. На стадии F2 с диагностическим коэффициентом и коэффициентом Кульбака для повышенного уровня CD118+ (J=41,4), CD119+ (J=5,3) и CD4+CD119+ (J=28,9), СD45+CD4+CD119+ (J=7,6) самыми важными считаются уровни CD118+ и CD4+CD119+. Диагностическая значимость информативности коэффициента Кульбака для снижения уровня В-лимфоцитов и NKT-клеток (CD19+, CD56+) возрастает по мере прогрессирования фиброза печени. Получены особо значимые информативные диагностические коэффициенты и коэффициент Кульбака для повышенного уровня CD118+ (J=21,0) и CD4+CD119+ (J=5,0) у больных ХГС на стадии F3.

Для больных с циррозом печени (стадия F4) получены значимые информативные диагностические коэффициенты и коэффициент Кульбака для повышенного уровня CD118+ (J=15,8), CD119+ (J=8,2) и СD45+CD4+CD119+ (J=30,4), и сниженного уровня CD19+ (J=2,7) и CD56+ (J=10,0).

В результате проведенного исследования получены информативные диагностические коэффициенты для значимых параметров при прогрессировании фиброза до цирроза печени (стадии F4): на фоне возрастания общего количества Т-лимфоцитов нормализация уровня Т-хелперов (достоверно выше, чем при F3) и значимое снижение уровня NKT-клеток, активации CD56+ и CD4+ на фоне возрастания уровня CD118+, CD119+ и CD4+CD119+.

Согласно данным, приведенным в Таблице 1, информативность диагностического коэффициента снижения уровня CD19+, CD56+ была значимой у больных с фиброзом 2 и 4 степени по сравнению с повышением уровня данных показателей.

У пациентов с фиброзом 1-3 степеней получены информативные диагностические коэффициенты для повышенного уровня CD118+ по сравнению со снижением данного показателя.

У пациентов с фиброзом 1, 2 и 4 степеней получены информативные диагностические коэффициенты для повышенного уровня CD119+, CD45+CD4+CD119+ по сравнению со снижением данного показателя.

Согласно данным, приведенным в Таблице 2, информативность диагностического коэффициента повышения уровня CD4+CD119+ была значимой у больных с фиброзом 1-3 степени по сравнению со снижением уровня данного показателя.

Обобщая данные корреляционного анализа и расчета информативности диагностического коэффициента и коэффициента Кульбака, выявлена значимость снижения количества CD19+ клеток и CD56+ клеток в сочетании с повышением уровня Т-лимфоцитов, продуцирующих интерферон альфа и гамма, в зависимости от выраженности фиброза печени. Это дает возможность рассматривать данные иммунологические показатели как критерии прогноза течения и прогрессирования ХГС.

Примеры

Клинический пример №1. Больная М.Ф.С., 58 лет. Жалоб активно не предъявляла. Анамнез настоящего заболевания: Маркеры НСV-инфекции впервые выявлены более 10 лет назад при диспансерном обследовании, состоит на диспансерном учете. При настоящем обследовании: ПЦР качественный анализ положительный, определен генотип 3а, отмечалось повышение трансаминаз. ПВТ не получала.

Эпидемиологический анамнез: гемотрансфузии отрицает, оперативное лечение отрицает. Употребление инъекционных наркотиков отрицает, постоянный половой партнер - муж. Лечение зубов периодически по месту жительства в течение жизни.

При осмотре: кожа чистая, обычной окраски. Язык влажный, чистый. Живот мягкий, при пальпации безболезненный. Печень пальпируется под реберной дугой. Селезенка не пальпируется. Со стороны систем органов дыхания и кровообращения патологических изменений не выявлено.

При обследовании: AHCV сумм положительны. РНК ВГС - обнаружена от 22.01.2018, 3а генотип, количество ВГС - 1,8×10⁶ МЕ/мл.

Результаты исследования анализов крови пациента приведены в Таблице 3.

УЗИ органов брюшной полости: Увеличение и диффузные изменения паренхимы печени. Диффузные изменения паренхимы поджелудочной железы.

Эластография печени от 20.03.2018: эластичность печени 23,9 кПа, что может соответствовать F4 по Метавир.

Заключение: Хронический вирусный гепатит С (РНК HCV+), генотип 3а, в стадии репликации вируса. Фиброз печени стадия F4 по Metavir.

Выявленные достоверные отклонения в иммунном статусе: снижение CD19+ (J=2,7) и CD56+ (J=10,0) при повышении CD 45+CD4+CD119+ (J=30,4), CD 119+ (J=8,2), диагностируют фиброз печени F4 в исходе ХГС (что соответствует заключению и фиброэластометрии F-4).

После проведения терапии препаратами прямого противовирусного действия (софосбувир + велпатасвир) был достигнут устойчивый вирусологический ответ на фоне угнетения ИФН-статуса и сохранения фиброза печени F4 по данным эластометрии. В связи с чем был разработан персонифицированный подход к тактике ведения данного пациента с назначением определенного режима питания, оптимальной физической нагрузки, патогенетической терапии и антифибротической терапии, при условии диспансерного наблюдения для предотвращения дальнейшего угнетения функций печени.

Клинический пример №2. Больная А.К.Б., 40 лет. Жалоб активно не предьявляет.

Анамнез настоящего заболевания: Маркеры НСV- инфекции впервые выявлены более 5 лет назад.

Эпидемиологический анамнез: гемотрансфузии, оперативное лечение отрицает. Употребление инъекционных наркотиков отрицает. Лечение зубов периодически по месту жительства в течение жизни.

При осмотре: кожа чистая, обычной окраски. Язык влажный, чистый. Живот мягкий, при пальпации безболезненный. Печень пальпируется по краю реберной дуги, безболезненна при пальпации. Селезенка не пальпируется.

При обследовании: A-HCV положительны. РНК ВГС - обнаружена от 25.04.2013, 1в генотип, количество ВГС - 2,5×106 МЕ/мл, 17.06.14 - 1,19×107 МЕ/мл, 30.03.17 - 2,1×107 МЕ/мл.

Результаты исследования анализов крови пациента приведены в Таблице 4.

УЗИ органов брюшной полости: Увеличение и диффузные изменения паренхимы печени. Эластография печени от 10.06.2016: эластичность печени 5,2 кПа, что может соответствовать F0-1 по Метавир.

Заключение: Хронический вирусный гепатит С (РНК HCV+), генотип 1в, в стадии репликации вируса. Фиброз печени стадия F-0-1 по Metavir.

Выявленные отклонения в иммунном статусе не соответствуют значимым критериям отклонения указывают на отсутствие цирроза печени в исходе ХГС у данного пациента.

После проведения противовирусной терапии препаратами прямого противовирусного действия (софосбувир + ледипасвир) РНК ВГС - не обнаружена. Антифибротическая терапия не назначалась. Эластография печени от 20.07.2019 показала эластичность печени 5,7 кПа, что может соответствовать F-0-1 по Метавир.

Выявлена нормализация показателей иммунного статуса по уровню CD19+, CD118+, CD119+ и Т- лимфоцитов, продуцирующих интерферон альфа и гамма и нормализацию степени угнетения ИФН-статуса со 2 степени до 1 степени, что подтверждает благоприятный прогноз в отношении отсутствии цирроза печени в исходе ХГС.

Исходя из приведенных данных, представляется возможным использовать указанные иммунологические показатели как критерии возможности диагностирования стадии тяжелого фиброза печени - цирроза печени (стадии F4) при ХГС для последующего выбора тактики ведения пациента. Проведение быстрой, доступной, нетравматичной, точной и высокоэффективной диагностики цирроза печени (стадии F4) у больных ХГС без отягощенного преморбидного фона обеспечивает своевременный выбор оптимальной тактики ведения пациентов.

Таблица 3. Результаты исследования анализов крови пациента из клинического примера 1.

Таблица 4. Результаты исследования анализов крови пациента из клинического примера 2.