Способ прогнозирования течения хронического гепатита С 1 генотипа у нелеченных больных с высокой вирусной нагрузкой

Изобретение относится к медицине, а именно к инфекционным болезням, и может быть использовано для более простого, доступного, быстрого и неинвазивного прогнозирования течения хронического гепатита С 1 генотипа у нелеченных больных с высокой вирусной нагрузкой.

Большое количество больных ХГС, хронизация инфекционного процесса, преимущественно молодой возраст инфицированных, неблагополучный прогноз на ближайшие десятилетия обусловливают серьезную значимость этой проблемы, переросшей из медицинской в социальную и представляющей угрозу для национальной безопасности страны (Мукомолов С.Л. Вирусные гепатиты в Российской Федерации / Аналитический обзор. 9 выпуск. СПб: ФБУН НИИЭМ им. Пастера. 2013. С. 168).

Вопрос прогнозирования течения хронического гепатита С актуален с точки зрения оценки динамики патологического процесса и выбора тактики лечения.

Известен способ прогнозирования течения хронических вирусных гепатитов В и С (RU 2482786, 27.05.2013). Способ основан на том, что выделяют прогностические признаки (путь заражения, длительность заболевания, возраст, когда произошло инфицирование, наличие сопутствующих заболеваний, жалобы больного, данные клинического осмотра, результаты лабораторных и инструментальных методов исследования: общий анализ крови, биохимический анализ крови, уровень вирусной нагрузки, УЗИ, фиброэластометрия печени), которые оцениваются в баллах по «Карге прогнозирования течения хронических вирусных гепатитов В и С». Полученные баллы суммируют и по общей сумме набранных баллов оценивают активность хронического вирусного гепатита. При минимальной степени активности: от 1 до 8 баллов и слабовыраженной степени активности: от 9 до 16 баллов - прогноз благоприятный. При умеренно выраженной степени активности: от 17 до 30 баллов и выраженной степени активности: более 30 баллов - прогноз неблагоприятный. Недостатком этого способа является большое количество измеряемых лабораторных, ультразвуковых и эластометрических показателей, что делает способ громоздким.

Известен способ прогнозирования тяжести течения хронических вирусных гепатитов В и С у детей и подростков (RU 2477072, 10.03.2013), включающий использование формулы: ПП=0,813995-А*0,008488+В*0,015113+С*0,53823+D*0,006234- Е*0,295161-F*0,049228, где ПП - это прогностический коэффициент риска развития тяжелого гепатита, 0,813995 - константа математических расчетов, А - возраст ребенка, подростка (целое число лет); В - уровень аланинаминотрансферазы в единицах; С - концентрация ДНК и концентрация РНК, принимающая значение 1 или 2: С=1, если ДНК или РНК отрицательный, С=2, если ДНК или РНК положительный; D - каудовертикальный размер правой доли печени в мм; Е - определение сосудистого рисунка печени: Е=1, если сосудистый рисунок ослаблен, Е=2, если сосудистый рисунок усилен; F - пальпаторное определение наличия лимфатических узлов при пальпации: F=1 - I степень - лимфатический узел размером с просяное зерно, F=2 - II степень - лимфатический узел размером с чечевицу, F=3 - II степень - III степень - лимфатический узел размером с горошину, F=4 - IV степень - лимфатический узел размером с фасоль, F=5 - V степень - лимфатический узел размером с лесной орех, F=6 - лимфатический узел не лоцируется; рассчитывают прогностический показатель и при его значении менее 1,5 прогнозируют низкий риск развития тяжелого хронического вирусного гепатита В и С у детей и подростков, а при его значении более 1,5 - высокий риск развития тяжелого течения хронического вирусного гепатита В и С у детей и подростков.

Известен способ прогнозирования быстрого прогрессирования заболевания у больных хроническим гепатитом С (RU 2354975, 10.05.2009). Способ заключается в изучении показателей индекса массы тела (ИМТ); количественного содержания в крови лимфоцитов, экспрессирующих маркеры CD3/CD25+-, CD3/CD95+- и CD118+- лимфоцитов; концентрации в крови инсулиноподобного фактора роста (IGF-1) и трансформирующего фактора роста (TGF-lb), генотипа HCV и антигенов HLA-системы. На основании полученных данных рассчитывают суммарный показатель ПК, исходя из значения которого прогнозируют течение заболевания.

Первоочередное значение при ХГС имеет количественная оценка уровня РНК (вирусная нагрузка) вируса гепатита С (ВГС) в плазме крови (Ведерников В.Е. Количественное определение вируса гепатита С методом ПЦР в реальном времени и его генотипирование с использованием флуорогенных бинарных зондов. Дисс. канд. мед. наук. Новосибирск. 2011). Вирусная нагрузка (ВН) это количество единиц генетического материала, которое присутствует в организме человека в определенном объеме крови. Концентрация вируса влияет на результативность терапии и планирование длительности курса, тяжесть заболевания, его хронизацию, а также важна в плане прогнозирования и мониторинга эффективности лечения. Определение ВН проводится с применением количественной ПЦР (Коновалова А.А., Протас В.В., Ли К.Г., Жуманбаева Г.К. Теоретические и прикладные аспекты современной науки. 2014. №4-1. С. 35-40).

Несмотря на то, что этот способ получил широкое распространение в клинической практике, он также не лишен некоторых существенных недостатков. Так, для его выполнения требуется дорогостоящая аппаратура и специально подготовленные врачи-лаборанты, что возможно только в крупных научно-практических центрах. Набор реагентов предполагает проведение исследований одновременно достаточно большого количества проб. Для лабораторий с небольшим количеством анализов это требует накопления определенного количества образцов, что определяет большие временные затраты. Однако в клинической лабораторной диагностике большое значение имеет актуальность ответа (получение результата в кратчайшие сроки). К тому же методика проведения исследований в режиме реального времени не предусматривает хранение готовых реакционных смесей, что также создает определенные трудности, в значительной степени, экономические. Особенно важно для оценки достоверности данных ПЦР-анализа и отсутствие ложноположительных результатов. Помимо опасности получения ложноположительных результатов, существует и обратная проблема, связанная со снижением чувствительности ПЦР, следствием чего являются ложноотрицательные результаты. На практике вопрос о соотношении теоретической (то есть максимально возможной) и реальной чувствительности ПЦР не всегда решается однозначно. Чувствительность ПЦР может быть снижена вследствие многих причин, наиболее важной из которых является ингибирование реакции компонентами биологических образцов.

Задачей предлагаемого способа является разработка недорогостоящего и простого в исполнении способа прогнозирования течения ХГС у нелеченых больных с 1 генотипом и высокой вирусной нагрузкой.

Техническим результатом изобретения является возможность своевременного начала противовирусной терапии, динамического наблюдения за эффективностью лечения при доступности и экономичности способа.

Технический результат достигается за счет исследования активности определенных цитохимических ферментов (лактатдегидрогеназы (ЛДГ), глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г-6-ФДГ) и никотинамидадениндинуклеотид (НАД)) в нейтрофилах и моноцитах крови.

К достоинствам цитохимических реакций следует отнести возможность изучать распределение ферментов в тех или иных структурных компонентах крови, исследовать физиологическую функцию отдельных субклеточных структур, используя при этом минимальное количество материала. Цитохимические методы исследования обладают большой чувствительностью, высокой информативностью и экономичностью, в некоторых условиях они превосходят по информативности морфологический анализ крови. Проведение исследований на субклеточном уровне способствует пониманию механизмов адаптации и компенсации, возникающих в результате действия патологических факторов, а также создает предпосылки для диагностики доклинических стадий заболевания (Нагоев Б.С. Метаболическая активность нейтрофилов и моноцитов периферической крови при гепатите // Эпидемиология и инфекционные болезни. - 2006. - №5. - С. 41-45).

Особенно перспективно изучение с помощью методов цитохимии ферментного статуса клетки, благодаря чему становится возможным подойти к оценке ее функционального состояния. Отличительной чертой и достоинством цитохимического анализа является то, что можно сопоставить активность ферментов, относящихся не только к единой полиферментной системе, но и в принципе к разным циклам. Таким образом, оценивается координированность активности ферментов и внутренняя сопряженность метаболизма клетки в целом.

Использование в клинической практике цитохимических данных расширяет возможности клинического анализа. В условиях уже поставленного клинического диагноза рациональность применения цитохимических методов заключается в определении степени отклонения метаболического статуса клеток крови от нормы или диагностике различных стадий заболевания. В этом случае заключение по ферментному статусу должно либо увеличить, либо дать возможность расчленить представляющуюся единой группу больных с целью изучения особенностей заболевания в подгруппах, признаки которых расположены вокруг определенной границы.

Известны исследования по цитохимическим исследованиям нейтрофилов и моноцитов крови при различных инфекционных заболеваниях (Нагоев Б.С. Метаболическая активность нейтрофилов и моноцитов периферической крови при гепатите В. Эпидемиология и инфекционные болезни. - 2006. - №5. - С. 41-45). Однако практически отсутствуют исследования по цитохимическому анализу фагоцитов крови у больных ХГС естественного течения. Данные клетки играют огромную роль в неспецифическом иммунитете организма и при комплексном исследовании активности различных цитохимических ферментов в нейтрофилах и моноцитах крови в зависимости от генотипа вируса и вирусной нагрузки можно получить новую информацию об их значении в патогенезе ХГС естественного течения.

При разработке предлагаемого способа было проведено клинико-лабораторное обследование 140 больных ХГС 1 генотипа, ранее не леченных, как с высокой, так и с низкой вирусной нагрузкой. В качестве контрольной группы было обследовано 82 практически здоровых людей-доноров.

Диагноз подтверждали определением маркеров ХГС методом ИФА: антитела к HCV класса IgM, IgG и спектр антител к Ag HCV-core, NS3, NS4, NS5. РНК HCV в сыворотке крови определяли методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием тест-системы «АмплиСенс HCV-Монитор», генотипирование ВГС проводили методом ПЦР с помощью коммерческой тест-системы «АмплиСенс HCV-генотип».

Проведено цитохимическое исследование ферментативной активности нейтрофилов и моноцитов крови. Материалом для исследования являлась венозная кровь. Нейтрофилы определяли в мазке из цельной крови. Выделение моноцитов проводили по методике И.С. Фрейдлин [Фрейдлин И.С. Иммунная система и ее дефекты СПб.: НТФФ «Полисан», 1998. 112 с.]. 5 мл крови из локтевой вены получали в пробирку с 1 мл гепарина, разведенного в 0,9%-ном растворе хлорида натрия (10 ед. в 1 мл). Остальная кровь отстаивалась в течение 1 часа в термостате при 37°С. Надосадочная жидкость наслаивалась пастеровской пипеткой на 3 мл градиента фиколлпак (фирма "Pharmacia", Швеция) и центрифугировалась в течение 20 мин при 1500 об/мин. В результате на градиенте плотности образовалось белое кольцо, состоящее из мононуклеарных клеток. Клетки кольца забирались пастеровской пипеткой и готовили мононуклеарный мазок.

Исследовали следующие ферменты: активность окислительно-восстановительных ферментов: сукцинатдегидрогеназы (СДГ), лактатдегидрогеназы (ЛДГ), глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г-6-ФДГ); активность ферментов транспорта электронов кислорода: НАД (НАД) и НАДФ (НАДФ). Определяли эстеразную активность: альфанафтилацетатэстеразы (АЭ) и альфанафтилбутиратэстеразы (БЭ). Исследования дегидрогеназ и диафораз проводили по методике Р.П. Нарциссова, активность эстераз определяли методом Вачштейна-Вольфа.

При генотипировании был выявлен 1 генотип вируса. Анализ ферментативной активности иммунокомпетентных клеток крови у больных ХГС в зависимости от степени вирусной нагрузки показал, что у больных ХГС с высокой ВН наблюдалось достоверное, по сравнению с контролем, снижение активности цитохимических ферментов - сукцинатдегидрогеназы (СДГ), лактатдегидрогеназы (ЛДГ), глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г-6-ФДГ) и никотинамидадениндинуклеотида (НАД).

Исследование выявило, что у больных ХГС с высокой ВН достоверно (р<0,001), по сравнению с нормой, была снижена активность следующих ферментов при 1 генотипе - в нейтрофилах: СДГ, ЛДГ, Г-6-ФДГ, НАД, и в моноцитах крови: СДГ, ЛДГ, Г-6-ФДГ, НАД.

В результате проведенного исследования выявлено, что у больных ХГС с 1 генотипом имеет место взаимосвязь между уровнем вирусной нагрузки и активностью определенных ферментов. Так, при высокой вирусной нагрузке происходило угнетение ряда ферментов, а именно, СДГ, ЛДГ, Г-6-ФДГ, НАД, что свидетельствовало об истощении адаптационных клеточных механизмов. В то же время при низкой вирусной нагрузке у пациентов с 1 генотипом активность ферментов была достоверно высокой по сравнению с нормальными значениями. Выявленная дисфункция, очевидно, связана непосредственно с действием вируса на клетки.

При анализе взаимосвязи между выраженностью фиброза печени и вирусной нагрузкой выявлено, что при высокой вирусной нагрузке достоверно чаще регистрировали больных с фиброзом печени. У больных ХГС с 1 генотипом и высокой ВН в нейтрофилах крови активность исследуемых ферментов определялась достоверно ниже по сравнению с нормой и при минимальном фиброзе печени. Сравнительный анализ в группах с различной степенью фиброза печени показал наличие достоверных различий по активности СДГ, ЛДГ, Г-6-ФДГ и НАД относительно минимального и выраженного фиброза печени.

^Np<0,05 по сравнению с нормой

¹р<0,05 между минимальной и умеренной степенью фиброза печени

²р<0,05 между умеренной и выраженной степенью фиброза печени

³p<0,05 между минимальной и выраженной степенью фиброза

В моноцитах крови у пациентов с 1 генотипом и высокой ВН наблюдалась достоверно, по сравнению с контрольной группой, низкая активность ферментов в группах с различной степенью выраженности фиброза печени при минимальном фиброзе печени. Анализ активности ферментов, показал наличие достоверной разницы между минимальным и выраженным фиброзом печени по активности Г-6-ФДГ, НАД, между умеренным и выраженным фиброзом - СДГ, ЛДГ, НАД, а также между минимальным и выраженным - СДГ, ЛДГ, Г-6-ФДГ, НАД.

Таким образом, у обследуемых с естественным течением ХГС при 1 генотипе и высокой ВН выявлена взаимосвязь между степенью фиброза печени и активностью определенных ферментов. Так, при выраженном фиброзе печени наблюдалось более значимое угнетение исследуемых ферментов, а различия были достоверны при сравнении с минимальным фиброзом печени по активности СДГ, ЛДГ, Г-6-ФДГ, НАД.

Поскольку неблагоприятное течение ХГС определяется именно степенью фиброза печени, то выявленная взаимосвязь позволяет использовать количественные критерии изменений названных ферментов в качестве индикаторов для прогнозирования неблагоприятного течения заболевания, в том числе у больных с установленным ранее диагнозом, но не получавших лечение из-за различных причин, включая экономические.

Способ осуществляют следующим образом. У пациентов с ХГС естественного течения с 1 генотипом и высокой вирусной нагрузкой, ранее не получавших лечение, в нейтрофилах и моноцитах периферической крови определяют активность цитохимических ферментов - сукцинатдегидрогеназы (СДГ), лактатдегидрогеназы (ЛДГ), глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г-6-ФДГ) и никотинамидадениндинуклеотида (НАД). При снижении активности, по сравнению с нормальными показателями, в нейтрофилах - СДГ и НАД более чем в два раза, ЛДГ и Г-6-ФДГ более чем в три раза, в моноцитах - снижении активности СДГ, ЛДГ, Г-6-ФДГ более чем в два раза и НАД более чем в два раза прогнозируют неблагоприятное течение заболевания.

Клинический пример 1. Больная И.М.А., 51 год, впервые обратилась в мае 2010 года. Во время осмотра предъявляла жалобы на слабость и тяжесть в правом подреберье.

Из анамнеза болезни: в течение 3 лет больную беспокоят слабость, чувство тяжести в правом подреберье, периодически тошнота, снижение аппетита. К врачу не обращалась. В феврале 2010 г. при обследовании у гинеколога по поводу заболевания органов малого таза выявлены антитела к вирусу гепатита С. На диспансерном учете не находилась. Не лечилась.

Эпидемиологический анамнез: в 2008 г. было переливание препаратов крови (эритроцитарной массы, плазмы) в связи с травмой органов брюшной полости. Страдает хроническим аднекситом, миомой матки. В августе 2009 г. лечилась амбулаторно у гинеколога, получала инъекции.

Объективно: Состояние удовлетворительное. Кожные покровы физиологической окраски. Желтухи нет. Умеренная пальмарная эритема. На коже плечевого пояса единичные сосудистые звездочки. Тоны сердца приглушены, ритмичные. Пульс 78 в 1 минуту удовлетворительного наполнения. А/Д - 110/70 мм рт.ст. Язык влажный, умеренно обложен белым налетом. Живот мягкий чувствительный в правом подреберье и в эпигастральной области. Печень: верхняя граница - VI межреберье; нижняя по краю реберной дуги. Размеры печени по Курлову: 9-8-7 см. Селезенка не увеличена. Моча светло-желтая. Кал окрашен.

Лабораторные данные: анализ крови: эритроциты 4,2*10¹² /л, Нв - 115 г/л, тромбоциты 210,5*10⁹/л, лейкоциты 5,3*10⁹/л, СОЭ - 10 мм/час. Билирубин крови 11,8 мкмоль/л; АлАТ 3,05 млмоль/л; тимоловая проба 6,36 ед. Общий белок крови 56.2 г/л, альбумины 36.5 г/л, глобулины 19,7 г/л. Маркеры ВГ: РНК-HCV полож., генотип 1а, вирусная нагрузка 256 700 MF/мл, низкая ВН, анти-HCV (к Ag core, NS3, NS4, NS5) положительный; HBsAg отрицательный; на НВс IgM отрицат. УЗИ: печень - правая доля 127 мм; левая - 53 мм. Структура однородная, эхогенность нормальная. Желчный пузырь грушевидной формы, стенки уплотнены, толщина - 4 мм, селезенка 120*60 мм. Больному проведена фиброэластометрия: Фиброз F₁ по Metavir. ср. кПа - 6,9.

Клинический диагноз. Хронический вирусный гепатит С, 1 генотип, умеренная биохимическая активность, Фиброз - F₁.

Заключение: у больной ХГС с 1 генотипом при низкой вирусной нагрузке активность цитохимических ферментов как в нейтрофилах, так и моноцитах крови значимо не отличалась от показателей здоровых лиц.

При низкой вирусной нагрузке в сочетании с малозначимыми изменениями активности цитохимических ферментов противовирусную терапию можно не проводить. На данном этапе прогноз благоприятный. Достаточно назначить симптоматическое лечение. Рекомендовано в дальнейшем периодически повторять определение активности цитохимических ферментов и при снижении показателей проводить повторное обследование для выбора тактики ведения.

Клинический пример 2. Больной А.Е.О., 29 лет, впервые обратился в октябре 2009 года. Во время осмотра жалоб не предъявлял.

Из анамнеза болезни: при прохождении медицинской комиссии по поводу трудоустройства в крови были обнаружены антитела к вирусу гепатита С. На учете не стоял, лечение не получал.

Эпидемиологический анамнез: в 2007 г. - удаление зуба с последующим протезированием.

Объективно: Состояние удовлетворительное. Кожные покровы физиологической окраски. Желтухи нет. Умеренная пальмарная эритема. Тоны сердца приглушены, ритмичные. Пульс 74 в 1 минуту удовлетворительного наполнения. А/Д - 110/70 мм. рт.ст. Язык влажный, умеренно обложен белым налетом. Живот мягкий чувствительный в правом подреберье и в эпигастральной области. Печень: верхняя граница - VI межреберье; нижняя - на 1 см ниже края реберной дуги. Размеры печени по Курлову: 10-8-7 см. Селезенка не увеличена. Моча светло-желтая. Кал окрашен.

Лабораторные данные: анализ крови: эритроциты 4,40*10¹² /л, Нв 140 г/л, тромбоциты 190*10⁹/л, лейкоциты 6,3*10⁹/л, СОЭ 8 мм/час. Билирубин крови 10.8 мкмоль/л; АлАТ 1,16 млмоль/л; тимоловая проба 4,21 ед. Общий белок крови 58,1 г/л, альбумины - 38,4 г/л, глобулины 19,7 г/л. Маркеры ВГ: PHK-HCV полож., генотип 1в, вирусная нагрузка 1 063 654 МЕ/мл. - высокая ВН, анти-HCV (к Ag core, NS3, NS4, NS5) - положительный; HBsAg - отрицательный; НВс IgM - отрицат. УЗИ: печень - правая доля 129 мм; левая - 54 мм. Структура однородная, эхогенность нормальная. Желчный пузырь грушевидной формы, стенки уплотнены, толщина 3 мм. Селезенка 110*55 мм.

Клинический диагноз. Хронический вирусный гепатит С, 1 генотип, высокая вирусная нагрузка, умеренная биохимическая активность.

Заключение: У больного ХГС с 1 генотипом при высокой вирусной нагрузке определялось резкое снижение активности всех исследуемых ферментов. В нейтрофилах крови активность ЛДГ снижена в 3,4 раза, Г-6-ФДГ - в 4,4 раза и НАД - в 4,3 раза, а в моноцитах крови СДГ и ЛДГ более чем в 2 раза, Г-6-ФДГ в 5,2 раза. Прогноз неблагоприятный.

Данному больному рекомендовано как можно более раннее проведение активной терапии, в первую очередь, противовирусной.

Предложенный способ является простым, экономичным дополнительным способом прогнозирования течения ХГС у нелеченных больных с 1 генотипом с целью определения дальнейшей тактики лечения пациентов.