Результат интеллектуальной деятельности: Рекомбинантный белок для иммунизации против холеры

Холера представляет собой острую кишечную инфекцию, возникающую при попадании в организм пищи или воды, зараженной бактерией Vibrio cholerae. Холера имеет короткий инкубационный период от менее одного дня до пяти дней. Попавшие в организм бактерии вырабатывают энтеротоксин, вызывающий обильную, безболезненную, водянистую диарею, которая, при отсутствии своевременного лечения, может быстро привести к тяжелому обезвоживанию организма и смерти. Число случаев заболевания холерой, сообщения о которых поступали в ВОЗ за последние несколько лет, остается по-прежнему высоким. По оценкам исследователей, во всем мире ежегодно происходит от 1,3 до 4,0 миллионов случаев заболевания холерой и 21000-143000 случаев смерти от холеры.

Для профилактики заболевания используется вакцинация. В настоящее время за рубежом широко применяются вакцины Dukoral и OraVax, содержащие в качестве действующих веществ инактивированные V cholerae различных сероваров и рекомбинантную субъединицу В холерного токсина, а также вакцины mORC-VAX, Shanchol, Euvichol, Vaxchora, которые содержат инактивированные V. cholerae и не содержат компоненты холерного токсина [Горяев А.А., Саяпина Л.В., Обухов Ю.И., Бондарев В.П. Эффективность и безопасность вакцин для профилактики холеры // БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение 2018; 18(1): 42-49]. После двукратной пероральной вакцинации с интервалом 1-6 недель длительность защиты составляет от 0,5 до 2-5 лет.

В Российской Федерации применяется вакцина холерная бивалентная химическая, представляющая собой смесь холерогена-анатоксина V. cholerae классического биовара O1, О-антигена V. cholerae O1 и вспомогательных веществ. Данная вакцина обеспечивает противохолерный иммунитет длительностью 6 месяцев [Горяев А.А., Саяпина Л.В., Обухов Ю.И., Бондарев В.П. Эффективность и безопасность вакцин для профилактики холеры // БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение 2018; 18(1): 42-49].

Одним из основных антигенов V. cholerae является О-специфический полисахарид (OSP) липо полисахарида. К сожалению, полисахариды являются слабыми иммуногенами, возможно, вследствие отсутствия активации Т-клеток [Weintraub A. Immunology of bacterial polysaccharide antigens // Carbohydr Res. 2003; 338(23): 2539-2547]. Ни одна из существующих в настоящее время вакцин не обеспечивает 100% эффективность вакцинации [Kabir S. Critical analysis of compositions and protective efficacies of oral killed cholera vaccines // Clin Vaccine Immunol. 2014; 21(9): 1195-1205], кроме того, актуальной проблемой является увеличение продолжительности иммунитета после вакцинации, что может быть достигнуто, в частности, применением в составе вакцин рекомбинантных белков, содержащих последовательности белков V. cholerae в сочетании с последовательностями белков, обеспечивающих стимуляцию иммунного ответа.

В статье: Sharma М.K., Singh N.K., Jani D., et al. Expression of toxin co-regulated pilus subunit A (TCPA) of V. cholerae and its immunogenic epitopes fused to cholera toxin В subunit in transgenic tomato (Solarium lycopersicum) II Plant Cell Rep. 2008 Feb; 27(2):307-318 описан слитый белок, состоящий из В-субъединицы холерного токсина и одного из эпитопов белка токсинкорегулируемых пилей Тсра (Р4 или Р6), плазмидный экспрессионный вектор, содержащий ДНК, кодирующую этот слитый белок, для введения в томат (Solarium lycopersicum).

В статье: Price G.A., Holmes R.K. Immunizing adult female mice with a TcpA-A2-CTB chimera provides a high level of protection for their pups in the infant mouse model of cholera // PLoS Negl Trop Dis. 2014; 8(12): e3356 раскрыт слитый белок, состоящий из белка токсинкорегулируемых пилей Тсра, А2- и В-субъединицы холерного токсина. Трехкратная иммунизация мышей этим слитым белком приводила к защитному иммунитету у их потомства. Однако введение в вакцину токсикогенной субъединицы А может привести к возникновению побочных эффектов. Кроме того, иммуногенность вакцины была показана после парентерального введения слитого белка, тогда как в случае холерной вакцины предпочтительный путь введения, учитывая особенности жизнедеятельности патогена, пероральный.

В публикации: Базарнова Ю.Г., Болотникова Т.А., Аронова Е.Б. Получение штамма-продуцента рекомбинантного белка TBF, содержащего антигены V. cholerae, на основе клеток Е. coli II Наука и инновации в технических университетах, Материалы XII всероссийского форума студентов, аспирантов и молодых ученых, 2018, с. 45-41 раскрыт способ получения штамма-продуцента рекомбинантного слитого белка TBF, содержащего антигены холерного вибриона Тсра, В-субъединицу холерного токсина и лиганд к Fc-рецепторам в стенке желудка (FcL). Этот слитый белок имеет молекулярную массу 74,3 кДа и изоэлектрическую точку pi 8,82. В публикации нет сведений об иммуногенности полученного белка, однако на основании расчетной изоэлектрической точки этого белка можно сделать предположение, что при пероральном введении его растворимость и биодоступность в щелочной среде кишечника будет низкой.

Технической задачей, на решение которой направлено настоящее изобретение, является создание нового рекомбинантного белка для пероральной иммунизации против холеры.

Поставленная задача решается тем, что создан рекомбинантный белок, который содержит слитые последовательности аминокислот В-субъединицы холерного токсина, белка холерных пилей А (ТсрА), соединенных с Fc-фрагментом IgG1 человека и с тиоредоксином A Escherichia coli, причем все домены связаны между собой гибкими пептидными мостиками, содержащими глицин и серии. Последовательность аминокислот заявленного белка представлена на SEQ ID NO: 1.

В-субъединица холерного токсина отвечает за связывание токсина с клетками и не обладает токсичностью. Вместе с тем, СТВ обладает сильным адъювантным действием, в частности, обладает способностью к усилению продукции секретируемых иммуноглобулинов А и системных иммуноглобулинов G, специфичных к белкам или пептидам, слитым с СТВ в составе рекомбинантных белков [Holmgren J., Czerkinsky С., Lycke N, Svennerholm A.M. Strategies for the induction of immune responses at mucosal surfaces making use of cholera toxin В subunit as immunogen, carrier, and adjuvant // Am J Trop Med Hyg. 1994; 50(5 Suppl): 42-54]. С ТВ успешно применяется в составе некоторых холерных вакцин (Dukoral, OraVax). В настоящем изобретении СТВ используется в качестве как антигена, так и адъюванта.

Белок ТсрА (компонент пили V. cholerae) является важным фактором колонизации [Herrington D.A., Hall R.H., Losonsky G., Mekalanos J.J., Taylor R.K., Levine M.M. Toxin, toxin-coregulated pili, and the toxR regulon are essential for V. cholerae pathogenesis in humans // J Exp Med. 1988; 168(4): 1487-1492]. Показано, что иммунизация данным белком вызывает образование защитного иммунитета против V. cholerae у мышей [Rollenhagen J.E., Kalsy A., Cerda F., John M., Harris J.B., Larocque RC, et al. Transcutaneous immunization with toxin-coregulated pilin A induces protective immunity against V. cholera O1 E1 Tor challenge in mice. Infect Immun. 2006; 74 (10): 5834-5839].

Тиоредоксин А, обладающий иммуностимулирующим действием, применяется для конструирования слитых белков-иммуногенов [Saupe F., Reichel М., Huijbers E.J., Femel J., Markgren P.O., Andersson C.E., Deindl S., Danielson U.H., Hellman L.T., Olsson A.K. Development of a novel therapeutic vaccine carrier that sustains high antibody titers against several targets simultaneously // FASEB J. 2017; 31(3): 1204-1214; Bolchi A., Canali E., Santoni A., Spagnoli G., Viarisio D., Accardi R., Tommasino M., Miiller M., Ottonello S. Thioredoxin-Displayed Multipeptide Immunogens // Methods Mol Biol. 2015; 1348 (1): 137-151].

Константная область Fc иммуноглобулина G1 человека, которая содержит домены СН2 и СН3, введена в состав заявленного рекомбинантного белка для взаимодействия с рецептором FcRn. Рецептор FcRn может как опосредовать проникновение Fc-содержащего белка из просвета кишечника в кровоток (таким путем ребенок получает антитела матери при грудном вскармливании), так и определять продолжительность циркуляции белка в кровотоке, поскольку FcRn с помощью трансцитоза возвращает связывающиеся с ними белки, в частности, иммуноглобулины G1, из эндосомы макрофагов в кровоток, многократно увеличивая время циркуляции Fc-содержащих белков in vivo.

Гибкие пептидные мостики, содержащие глицин и серии, позволяют разнородным доменам заявленного рекомбинантного белка сохранять третичную структуру, близкую к нативной, оставляя иммуногенные и рецептор-связывающие эпитопы доменов открытыми для взаимодействия.

Рекомбинантный белок для иммунизации против холеры по настоящему изобретению характеризуется расчетной молекулярной массой 76,3 кДа и расчетным значением pI 6,24, что обеспечивает его высокую растворимость в щелочной среде кишечника, биодоступность и иммуногенность.

Иммунизация заявленным рекомбинантным белком дает умеренный защитный эффект, при двукратном введении сравнимый с защитным эффектом действующей и одобренной к применению на территории РФ пероральной вакцины холерной бивалентной химической (ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб» Роспотребнадзора, регистрационное удостоверение Р N001465/01). Заявленный рекомбинантный иммуногенный белок может быть использован при разработке противохолерной вакцины.

Изобретение иллюстрируется следующими графическими материалами:

На Фиг. 1. представлена аминокислотная последовательность рекомбинантного белка для иммунизации против холеры. Составные элементы белка (С-конец каждого элемента обозначен цифрой):

1 - Тиоредоксин А (1-109 ак)

2 - Гистидиновый таг (117-122 ак)

3 - Сайт протеолиза тромбином (126-131 ак)

4-S-таг (134-148 ак)

5 - Сайт протеолиза энтерокиназой (154-158 ак)

6 -Fc-фрагмент IgG1 человека (166-393 ак)

7 - ТсрА (403-600 ак)

8 - СТВ (609-711 ак),

аминокислоты 110-116, 123-125, 394-402, 601-608 представляют собой гибкие глицин-сериновые мостики.

На Фиг. 2. представлена очистка рекомбинантного белка для иммунизации против холеры на колонке с Q-Сефарозой FF.

На Фиг. 3 представлена электрофореграмма результатов очистки рекомбинантного белка для иммунизации против холеры в 10% полиакриламидном геле с 0,1% ДДС-Na. Дорожки:

А - маркер молекулярного веса Page Ruler Prestained Protein Ladder (Fermentas, Литва);

Б - лизат клеток штамма-продуцента до индукции с использованием 0,2% лактозы;

В - лизат клеток штамма-продуцента после индукции с использованием 0,2% лактозы;

Г - препарат рекомбинантного белка для иммунизации против холеры после анионообменной хроматографии;

Д - препарат рекомбинантного белка для иммунизации против холеры после гель-хроматографии.

Примеры осуществления изобретения.

Пример 1. Конструирование рекомбинантного белка для иммунизации против холеры.

Из последовательностей аминокислот тиоредоксина А Е. coli, Fc-фрагмента IgG человека, ТсрА V. cholera и СТВ V. cholerae составили последовательность рекомбинантного белка для иммунизации против холеры, в которую также включили последовательности 6-гистидинового тага и S-тага, которые могут применяться для очистки белка с помощью аффинной хроматографии, и сайты расщепления энтерокиназой и тромбином, обработка которыми позволяет при необходимости удалить последовательности тиоредоксина, 6-гистидинового тага и S-тага.

Элементы рекомбинантного белка для иммунизации против холеры связаны между собой гибкими пептидными мостиками, содержащими глицин и серии [Chakrabartty A., Schellman J.A., Baldwin R.L. Large differences in the helix propensities of alanine and glycine // Nature. 1991; 351(6327): 586-588]. Длина белка составляет 711 аминокислотных остатков. Расчетная молекулярная масса белка составляет 76,3 кДа, расчетное значение pi составляет 6,10. Полученная последовательность рекомбинантного белка для иммунизации против холеры представлена на Фиг. 1 и SEQ ID NO: 1.

Пример 2. Получение штамма - продуцента рекомбинантного белка для иммунизации против холеры.

На основании частоты использования кодонов в клетках Е. coli [Codon Usage Database http://www.kazusa.or.jp/codon] была составлена последовательность нуклеотидов, кодирующая рекомбинантный белок для иммунизации против холеры, длиной 2136 нуклеотидов, представленная в SEQ ID NO:2. Данная последовательность, фланкированная сайтами рестрикции BamHI и XhoI, была получена методом твердофазного химического синтеза и вставлена по данным сайтам в плазмидный вектор Рет32а(+) (Novagen, США). В результате была получена плазмида, содержащая вышеуказанную последовательность нуклеотидов. Плазмидой были трансформированы клетки Е. coli BL21(DE3). Трансформанты высевали на плотную питательную среду LB, содержавшую 25 мкг/мл канамицина. Из нескольких индивидуальных колоний выделяли плазмидные ДНК, в которых правильность синтеза заявленной последовательности сборки плазмиды проверяли секвенированием. Таким образом, был отобран штамм клеток Е. coli BL21(DE3)/pET32a/Fc-TcpA-native - продуцент рекомбинантного белка для иммунизации против холеры.

Пример 3. Наработка рекомбинантного белка для иммунизации против холеры.

Клетки штамма-продуцента, полученные в примере 2, культивировали в жидкой среде для автоиндукции PYP-5052 [Studier F.W. Stable expression clones and auto-induction for protein production in E.coli II Methods Mol Biol.: 2014, 1091(1): 17-32], содержащей 0,2% лактозы и канамицин в концентрации 25 мкг/мл, в термостатированном шейкере роторного типа при температуре 37°С и 250 об/мин в течение 15 часов. Контролем являлась культура, выращенная в течение 15 часов в среде, не содержавшей лактозу.

Клетки, выращенные в объеме среды 1 л, осаждали центрифугированием, ресуспендировали в 0,01 М натрий-фосфатном буферном растворе при рН 7,4 и обрабатывали ультразвуком в течение 20 мин на льду. Материал центрифугировали при скорости вращения ротора 14000 об/мин и температуре 4°С в течение 30 минут, супернатант наносили на колонку с анионообменным сорбентом Q-Сефарозой FF (GE-Healthcare Life Sciences, США), уравновешенную буферным раствором, содержащим 20 мМ Трис-HCl, 10 мМ ЭДТА, 5 мМ ДТТ, 10 мМ PMSF, рН 7,5. После промывки колонки избытком уравновешивающего буферного раствора, рекомбинантный белок для иммунизации против холеры элюировали градиентом концентрации NaCl под контролем электропроводности буферного раствора. Хроматограмма, представленная на Фиг. 2, показывает смыв с колонки посторонних белков и последующую элюцию рекомбинантного белка для иммунизации против холеры в виде острого симметричного пика. Доочистку рекомбинантного белка для иммунизации против холеры проводили с помощью гель-хроматографии на Сефакриле S-100 (колонка ХК 26/60, GE Life Sciences, США). Электрофоретический анализ в 10%-ном ПААГ в денатурирующих условиях [Laemmly U.K. Cleavage of Stractural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4 // Nature; 1970, 227: 680-685] с последующей денситометрией дорожек (Фиг. 3) показал, что содержание рекомбинантного белка для иммунизации против холеры в индуцированных лактозой клетках штамма-продуцента составило 25% белковой массы разрушенных клеток. После стадии анионообменной хроматографии чистота полученного рекомбинантного белка для иммунизации против холеры составила 94%, после гель-хроматографии - 98,8%. Выход составил 6 мг очищенного белка из 1 л культуры.

Пример 4. Иммунизация животных и изучение иммунного ответа на белок.

Мышам BALB/c весом 25 г внутрибрюшинно вводили 50 мкг полученного в примере 3 белка либо 50 мкг белка ТсрА, трижды, в 1, 14 и 28 дни. На 35 день с начала иммунизации из ретроорбитальных синусов получали образцы крови, из которых получали сыворотки. Образцы сывороток разводили в 5, 25, 125, 625 и 3125 раз в растворе PBS (0,89% раствор NaCl, 10 мМ натрий-фосфатный буфер, рН 7,2), содержавшем 0,1% овальбумина и 0,05% Твин-20 (Sigma-Aldrich, США).

Рекомбинантный белок ТсрА получали, как описано в работе [Kiaie S., Abtahi Н., Mosayebi G., Alikhani M., Pakzad I. Recombinant toxin-coregulated pilus A (TcpA) as a candidate subunit cholera vaccine. Iran J Microbiol. 2014; 6(2): 68-73]. Субъединицу В холерного токсина (СТВ) приобретали в Sigma-Aldrich (США).

Белки ТсрА и СТВ сорбировали на поверхность иммунологического планшета в количестве 50 нг на лунку в течение 18 часов, после чего блокировали 1% раствором овальбумина в течение 1 часа. Образцы разведенных сывороток крови иммунизированных животных инкубировали в лунках планшета при 37°С в течение 1,5 часов. Лунки планшета промывали раствором PBS и вносили раствор антител барана против IgG мыши, меченых пероксидазой хрена (Sigma-Aldrich, США) в PBS. После 1,5 часа инкубации лунки промывали раствором PBS, содержащим 0,05% Твин-20. В лунки добавляли раствор, содержащий 0,55 мг/мл 2,2'-азинобис(3-этилбензтиазолин-6-сульфоновой кислоты) (Sigma-Aldrich, США) и 0,03% H₂O₂. Далее определяли интенсивность развившейся окраски при длине волны А₄₀₅. Учитывали титр антител, который развивал окраску, превышавшую фоновую, не менее чем в 2 раза.

Результаты представлены в таблице 1.

Таким образом, внутрибрюшинная иммунизация мышей заявленным рекомбинантным белком позволяет получить высокие титры антител против белков ТсрА и СТВ V. cholerae в крови иммунизированных животных.

Пример 5. Пероральная иммунизация животных и изучение иммунного ответа на белок.

Белок, полученный в примере 3, вводили белым мышам внутрижелудочно в дозе 50 мкг/мышь однократно и двукратно с перерывом 14 дней. Через две недели после последней иммунизации, животные были внутрибрюшинно заражены летальными дозами вирулентного штамма возбудителя холеры: 4⋅10⁸ м.к. V. cholerae E1 Tor Inaba 19241 (ctx+, tcp+) (ЛД50 - 2⋅10⁸ м.к.). Животные контрольной группы получали перорально вакцину сравнения - действующую и одобренную к применению на территории РФ вакцину холерную бивалентную химическую, таблетки (ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб» Роспотребнадзора, регистрационное удостоверение Р N001465/01) - в дозе (0,25±0,05) мг/мышь (положительный контроль). Отрицательным контролем служили животные, которым вводили физиологический раствор перорально в объеме 0,5 мл/мышь.

Полученные результаты оценки выживаемости животных приведены в Таблице 2.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что однократная иммунизация заявленным белком давала слабо выраженный защитный эффект, двукратная иммунизация давала защитный эффект, сравнимый с эффектом вакцины сравнения.

Пример 6. Оценка иммуногенности рекомбинантного белка для иммунизации против холеры

Исследование иммуногенности проводили на мышах-гибридах F2 (CBAxC57b16), самцах (20-24 г, 8-10 недель, ФГУП ПЛЖ Рапполово). Белок, полученный в примере 3, вводили белым мышам внутрижелудочно в дозе 100 мкг/мышь однократно и двукратно с перерывом 14 дней, через 14 дней после последней иммунизации у животных отбирали образцы крови, в сыворотках крови определяли специфические антитела с помощью ИФА.

Раствор рекомбинантного белка для иммунизации против холеры, полученного в примере 3, с концентрацией 1 мкг/мл в 0,05 М натриевом карбонат-бикарбонатном буфере с рН 9,5-9,7 вносили в лунки планшета для ИФА (Costar, США) по 100 мкл в лунку. Сорбцию проводили в течение ночи при комнатной температуре на шейкере.

Разведения сывороток иммунных мышей готовили в промывочном буфере, содержащем 1,0 мг/мл бычьего сывороточного альбумина (БСА). Промывочный буфер содержал 0,05% Tween 20 и готовился на основе фосфатно-солевого буфере (ФСБ): 0,02 М фосфата, 0,15 М хлорида натрия, рН 7,2-7,4. Минимальное разведение сывороток было равным пятидесяти, а титрование проводили с шагом 5. В качестве контроля использовали пулированную сыворотку интактных мышей. После сорбции рекомбинантного белка для иммунизации против холеры, полученного в примере 3, проводили 3-кратную отмывку аналитических планшетов промывочным буфером, рабочий объем промывки 250 мкл в ячейку.

После отмывки в лунки планшета вносили по 100 мкл 1,0 мг/мл БСА в промывочном буфере и по 50 мкл анализируемых сывороток в разведениях. Для реакции взаимодействия антител с иммобилизованным антигеном планшеты инкубировали 2 часа на шейкере при комнатной температуре. После повторной отмывки в лунки планшетов вносили по 100 мкл рабочих растворов конъюгатов иммуноглобулинов кролика или козы с пероксидазой хрена к иммуноглобулинам мыши IgG, IgA, IgM или к иммуноглобулинам мыши изотипов IgG1, IgG2a, IgG3 (sigma-Aldrich, ISO2-1KT) в промывочном буферном растворе.

После часовой инкубации и отмывки проводили окрашивание в течение 10 мин, внося по 100 мкл ТМБ-содержащего цитратного буферного раствора. Реакцию останавливали добавлением 50 мкл 5% серной кислоты и измеряли оптическую плотность (ОД) при длине волны 450 нм.

Результаты опыта представлены показателями оптической плотности. Данные по параллельным образцам (дубликатам) усредняли. В таблицы вносили результаты оптических плотностей за вычетом фоновых значений сывороток интактных мышей в соответствующем разведении. Кроме того, степень выраженности иммунного ответа представлена условной величиной, представляющей собой произведение ОД на разведение.

Результаты определения суммарного иммунного ответа на однократное и двукратное введение заявленного рекомбинантного белка при внутрижелудочном пути введения представлены в Таблице 3.

Результаты показали, что титр общих иммуноглобулинов в сыворотке крови экспериментальных животных, определенный посредством ИФА, значительно повышается после второй иммунизации

Распределение иммунного ответа по изотипам специфических антител после внутрижелудочного введения при одно- и двукратной иммунизации представлено в Таблице 4.

Изучение распределения иммунного ответа по выработке субклассов и субтипов иммуноглобулинов показало, что большинство образовавшихся специфических антител принадлежит к G1 и М субклассам иммуноглобулинов.

Совокупность полученных данных свидетельствует о реализации функционального иммунного ответа на внутрижелудочное введение заявленного рекомбинантного белка животным.

Заявитель просит рассмотреть представленные материалы заявки «Рекомбинантный белок для иммунизации против холеры» на предмет выдачи патента РФ на изобретение.