Результат интеллектуальной деятельности: Способ определения биологического возраста трупа

Изобретение относится к судебной медицине, а именно к судебно-медицинской экспертизе, криминалистике и предназначено для определения биологического возраста трупа при фрагментации тела.

По литературным данным проблема судебно-медицинской идентификации личности всегда была объектом особого внимания, и значительную актуальность она приобретает в случаях массовых жертв при техногенных чрезвычайных ситуациях, сопровождающихся фрагментацией тел. Вследствие глубоких термических поражений кожи особые приметы (рубцы, татуировки) утрачивают свое диагностическое значение. При этом визуальное опознание погибшего зачастую невозможно (Баринов Е.Х., Щербаков В.В., Федулова М.В., Гончарова Н.Н. Идентификация личности при чрезвычайных ситуациях с массовыми человеческими жертвами / под ред. Ю.И. Пиголкина. - М.: «Медицинский информационно-аналитический центр», 2008. - 235 с.).

Наиболее близким является способ определения биологического возраста трупа по фрагменту мозжечка, взятому в верней полулунной дольке, и подсчету высоты грушевидных нейронов, расстоянию между их телами и количеству иммунопозитивных к S-100 тел грушевидных нейронов (Баландин А.А., Железнов Л.М., Баландина И.А., Косарева П.В., Бородулин Д.В. Способ определения биологического возраста трупа. - Патент на изобретение РФ №2623141 от 22.06.2017).

Недостатки: выявление небольших возрастных периодов (20-30 лет и 60-70 лет), трудоемкость способа (подсчет высоты каждого грушевидного нейрона и расстояния между их телами).

Технический результат: расширение возрастных периодов до 60 лет и от 70 лет и упрощение способа при высокой точности.

Поставленная задача решается способом определения биологического возраста трупа, заключающимся в том, что в коре нижней полулунной дольки неповрежденного мозжечка определяют толщину молекулярного слоя, толщину зернистого слоя и их соотношение; определяют количество иммунонегативных к белку S-100 тел грушевидных нейронов и суммируют это значение с соотношением слоев; при результате, равном 2,07 и менее, делают вывод о биологическом возрасте трупа 70 лет и старше; при результате, превышающем 2,3, делают вывод о биологическом возрасте трупа 60 лет и моложе.

Практически способ осуществляют гистологическим исследованием тканей (Саркисов Д.С., Перов Ю.Л. Микроскопическая техника. - М.: Медицина. - 1996. - С. 4-50, 339-445) следующим образом:

Исследуют участки коры мозжечка в нижней полулунной дольке на вершине извилины в обоих полушариях.

Кусочки фиксируют в 10% растворе забуференного по Лилли формалина (рН-7,2) в течение 24 часов (Петров, С.В., Киясов А.П. Иммуногистохимическая диагностика опухолей человека: руководство для врачей-морфологов. - Казань, 1998. - 165 с).

Материал промывают в проточной воде в течение 30 минут, а затем подвергают обезвоживанию и заливке в парафин по следующей схеме: спирт 60,0% - 2 часа, спирт 70,0% - 2 часа, спирт 96,0% - 2 часа, спирт 96,0% - 2 часа, спирт + ксилол (1:1) - 2 часа, ксилол + парафин (1:1) - 2 часа, парафин I 56° - 2 часа, парафин II 56° - 1 час.

Кусочки заливают в парафиновые блоки.

На ротационном микротоме изготавливают гистологические срезы толщиной 4-6 микрон.

Часть срезов окрашивают методом Ниссля (по Снесареву) (Хонин Г.А., Барашкова С.А., Семченко В.В. Морфологические методы исследования в ветеринарной медицине: Учебное пособие. - Омск: Омская областная типография, 2004. - С. 93-94). Приготавливают красящий раствор: 0,2 г тионина растирают в ступке, постоянно добавляя дистиллированную воду (100 мл). Доводят до кипения, тщательно перемешивают, фильтруют через мелкопористый фильтр.

Собранные в 96% спирте целлоидиновые срезы толщиной 8-9 мкм прогревают до появления пузырьков и охлаждают.Также прогревают и охлаждают срезы в красящем растворе. Промывают дистиллированной водой - 2-кратно.

Проводят через 96% спирт (под контролем микроскопа до исчезновения фонового окрашивания) - 2-кратно. Просветляют, заключают срезы.

Количественный (морфометрический) анализ исследуемых гистологических образцов проводят с использованием программного пакета BioVision, version 4,0 (Австрия). Захват изображений обеспечивают использованием цифровой камеры для микроскопа САМ V200, Vision (Австрия). Размеры гистологических объектов выражают в мкм.

Морфометрический анализ включает измерение толщины молекулярного слоя и толщины зернистого слоя при расположении этих слоев по диаметру объектива (объектив х 10). В каждом препарате проводят от 5 до 10 измерений, после чего вычисляют средние величины и стандартные отклонения для каждого случая, а также средние величины в группе.

Иммуногистохимические исследования выполняют по стандартным протоколам. Используют концентрированные первичные моноклональные мышиные антитела к S-100 протеину клон 4С4.9 (Lab Vision США). Рабочее разведение 1:100. Система визуализации KP50L (Diagnostic BioSystems, USA). Парафиновые срезы наклеивают на предметные стекла с адгезивным полилизиновым покрытием (Thermo Scientific, Menzel-Glaser Polysine® Slides 25×75×1,0 mm, Gerhard Menzel GmbH).

С целью восстановления антигенных детерминант после формалиновой фиксации депарафинизированные срезы подвергают нагреванию: срезы помещают в 0,01 М цитратный буфер (рН-6,0) и кипятят в течение 20-30 минут, затем - в трис-буфер (рН-7,5) на 5 минут, обрабатывают 0,3% раствором перекиси водорода (пероксидазный блок), после чего проводят инкубацию с первичными антителами в течение 10-30 минут во влажной камере (Петров, С.В., Киясов А.П. Иммуногистохимическая диагностика опухолей человека: руководство для врачей-морфологов. - Казань, 1998. - 165 с). Перед использованием концентрированные антитела разводят растворителем антител (Primary Antibody Diluent, Diagnostic BioSystems, USA) в титре 1:100, согласно инструкции фирмы-производителя антител. При проведении иммуногистохимических исследований используют позитивные контроли, рекомендованные фирмой-производителем.

Затем срезы трехкратно промывают в трис-буфере, после чего подвергают экспозиции с вторичными антителами (мышиные и кроличьи биотинилированные антитела) (Diagnostic BioSystems, USA) в течение 10 минут, промывают в трис-буфере, обрабатывают конъюгированным с пероксидазой стрептавидином в течение 10 минут и подвергают окрашиванию DAB+ (3,3'-диаминобензидин) (Diagnostic BioSystems, USA) в течение 1-2 минуты, не допуская появления фонового окрашивания. Промывают в 2-3 порциях дистиллированной воды в течение 10-15 минут и докрашивают гематоксилином Майера. Срезы заключают в канадский бальзам и исследуют в проходящем свете микроскопа при увеличении ×400.

При просмотре препаратов на светооптическом уровне антиген-позитивные грушевидные нейроны идентифицируют по появлению коричневого окрашивания. Подсчитывают все грушевидные нейроны в срезе. Определяют процент иммунонегативных клеток.

С помощью данных методов изучались ткани коры мозжечка, полученные при судебно-медицинском исследовании 215 трупов (105 лиц мужского пола и 110 лиц женского пола) в возрасте от 18 до 90 лет, не имеющих повреждений и патологических изменений мозжечка.

Проведенный статистический анализ установил, что изменение толщины молекулярного и зернистого слоев коры мозжечка, и иммуногистохимический маркер белок S-100 можно использовать для определения биологического возраста трупа человека.

Примеры конкретного выполнения.

Пример 1.

Согласно акту судебно-медицинского исследования на месте происшествия были обнаружены фрагменты трупа мужчины с ожоговой травмой обеих ступней, кистей, лица и шеи III-IV степени. Ожоговая травма не позволяла определить биологический возраст трупа.

Следственные органы интересовал биологический возраст трупа.

При микроскопическом исследовании коры мозжечка выявили, что толщина молекулярного слоя в среднем составила 350,8 мкм, толщина зернистого слоя в среднем составила 244,0 мкм, а количество иммунонегативных грушевидных нейронов к белку S-100 равна 86% - 0,86.

Составлена формула:

Пример: 350,8/244,0+0,86=2,3 - т.е. биологический возраст погибшего младше 60 лет.

На основании указанных признаков был сделан вывод, что расчлененные фрагменты трупа принадлежат лицу, биологический возраст которого составляет менее 60 лет (нормативные данные для этой возрастной группы включают: соотношение между молекулярным и зернистым слоем + процентное соотношение иммунонегативных грушевидных нейронов к белку S-100 - более 2,3).

Пример 2.

Согласно акту судебно-медицинского исследования в заброшенном здании недостроенного жилого многоэтажного дома был обнаружен труп мужчины с химическими и травматическими повреждениями мягких тканей лица, костей лицевого отдела черепа и огнестрельной раной передней стенки грудной клетки. Травматическое повреждение мягких тканей лица и костей лицевого отдела черепа затрудняло определение возраста пострадавшего.

Следственные органы интересовал вопрос о биологическом возрасте трупа.

При микроскопическом исследовании коры мозжечка выявили, что толщина молекулярного слоя в среднем равна 296,6 мкм, толщина зернистого слоя в среднем достигает 240,1 мкм, а количество иммунонегативных грушевидных нейронов к белку S-100 составляет 84% - 0,84.

Составлена формула:

Пример: 296,6/240,1+0,84=2,07 - т.е. биологический возраст погибшего старше 70 лет.

На основании указанных признаков был сделан вывод, что труп принадлежит лицу, биологический возраст которого составляет 70 лет и старше (нормативные данные для этой возрастной группы включают: соотношение толщины молекулярного слоя к зернистому + количество иммунонегативных грушевидных нейронов к белку S-100 - 2,07 и менее).

Способ по изобретению позволяет определять биологический возраст человека и более объективно решать задачи, поставленные перед судебно-медицинским экспертом следственными органами.