Результат интеллектуальной деятельности: Способ дифференциальной диагностики актинического кератоза и плоскоклеточного рака кожи

Изобретение относится к области медицины, а именно дерматовенерологии и онкологии. Известен способ дифференциальной диагностики актинического кератоза и плоскоклеточного рака с применением гистологического исследования N.Engin Histopathological subtyping of actinic keratosis and it's coexistence with nonmelanotic skin cancers in Gaziantep and Malatya regions. Arch Turk Dermatol Venerology 2016;50 DOI: 10.4274/turkderm.53765). Недостатком этого метода является необходимость полного иссечения очага поражения и изготовление множества серийных срезов для получения достоверного результата, поскольку возможна трансформация актинического кератоза в плоскоклеточный рак. Известен метод дифференциальной диагностики актинического кератоза и рака in situ, основанный на выявление в биоптате иммуногистохимически пролиферирующих клеток в различных слоях эпидермиса (A.D. Bordbar, A. Cabral, S. Beck, М.Е. Boon. Assesment of cell proliferation in benign, premalignant and malignant skin lesions. Applied Immunohistochem. Mol. Morphol. 2007,15: 229-235). Недостатком этого метода является его трудоемкость, а также субъективизм в определение границ слоев эпидермиса, что может отрицательно влиять на результаты.

Наиболее близким является метод дифференциальной диагностики актинического кератоза и рака in situ, основанный на выявление в биоптате с помощью иммуногистохимического исследования пролиферирующих клеток и определения индекса пролиферации (Хлебникова А.Н., Гуревич Л.Е., Селезнева Е.В, Обыденова К.В., Седова Т.Г., Кунцевич Ж.С. Особенности пролиферации и межклеточной адгезии в предраковых и злокачественных эпителиальных опухолях кожи. Альманах клинической медицины 2016, 44(1), с. 58-63). Недостатком этого способа является его трудоемкость, связанная с необходимостью подсчета индекса пролиферирующих клеток, кроме того, пролиферативная активность клеток при некоторых гистологических типах актинического кератоза достаточно высокая, а индекс пролиферации актинического кератоза достоверно не отличается от рака in situ.

Технический результат: повышение точности дифференциальной диагностики актинического кератоза и плоскоклеточного рака за счет выявления с помощью иммуногистохимии локализации в клетках адгезивной молекулы Клаудина-1.

Клаудины - семейство белков являющихся составной частью плотных контактов клеток эпителия, основная функция которых заключается в формировании клеточного барьера и регуляции межклеточного взаимодействия. Клаудин-1 экспрессируется в эпидермисе и в норме локализуется на мембране эпителиальных клеток, обеспечивая их четкую адгезию. При доброкачественном росте клаудин-1 сохраняется на мембране клеток. В случаях атипичного роста происходит снижение интенсивности экспрессии клаудина-1 на мембране вплоть до полного исчезновения, появление его в цитоплазме. Таким образом, определение локализации клаудина-1 в клетке высокоинформативно для выявления атипичного роста. Клаудины играют роль в межклеточной адгезии, активируют сигнальные белки, контролирующие клеточную пролиферацию, дифференцировку и полярность, действуя как многофункциональный комплекс. Нарушение экспрессии клаудинов в эпителии может приводить к снижению контроля за пролиферацией, снижению межклеточной адгезии, что способствует неконтролируемому росту клеток и усилению их подвижности. В нормальном эпидермисе и при доброкачественных процессах клаудин-1 экспрессируется строго на мембране, отрицательная иммунореактивность наблюдается только в базальном слое и не превышает 10% клеток. В злокачественных опухолях мембранная экспрессия ослабевает, резко возрастает количество клеток с отрицательной иммунореактивностью, появляется экспрессия в цитоплазме. Грубая аномальная экспрессия (цитоплазматическая, отсутствие иммунореактивности) усиливается в инвазивном раке, по сравнению с прераковым процессом. Вследствие чего, использование экспрессии Клаудина-1 как показателя явной атипии эпителиальных клеток вполне обосновано. Это позволяет на ранних этапах злокачественной трансформации выявлять атипичные клетки и проводить дифференциальную диагностику между предраковым процессом и инвазивным раком.

Способ осуществляется следующим образом. У больного под местной анестезией 2% раствором лидокаина проводят биопсию очага размером 0,5×0,5 см, биоптат фиксируют в 10% растворе формалина. Материал заливают в парафин по обычной методике. Серийные срезы депарафинируют по стандартной схеме. Парафиновые срезы наносят на стекла с адгезивным покрытием, депарафинируют по стандартному протоколу. Срезы, погружают в цитратный буфер инкубируют в микроволновой печи при мощности 690 Вт 2 раза по 5 минут. Срезы охлаждают 20 минут при комнатной температуре, подсушивают и наносят первичные антитела. Для определения характера адгезии клеток используют антитела к Клаудину-1 (Клон 36 В5, разведение 1:50, Novocastra). Используют соответствующие позитивные и негативные контроли -иммунные и не иммунные сыворотки. Срезы промывают в буфере, подсушивают, затем на них наносят EnVision (anti-mouse и anti-rabbit, фирмы DAKO, Дания) на 30-40 минут. Для визуализации реакции наносят DAB+ , что позволяет получать специфическую коричневую окраску. Затем срезы докрашивают гематоксилином Майера.

Для оценки локализации экспрессии Клаудина-1 выделят следующие типы:

- Мембранный - равномерное распределение маркера по всей клеточной мембране;

- Мембранно-редуцированный - распределение маркера на отдельных участках клеточной мембраны;

Цитоплазматический - распределение маркера в цитоплазме (мелкогранулярный в виде мелких гранул);

- Отсутствие иммунореактивности (отрицательная иммунореактивность)

На микроскопе МИКМЕД-5 (ЛОМО, Россия) оценивают экспрессию Клаудина-1. Для решения поставленной задачи при проведении дифференциальной диагностики актинического кератоза и плоскоклеточного рака, включающей иммуногистохимическое исследование биоптата очага поражения, проводят исследование по определению локализации экспрессии молекулы клеточной адгезии Клаудина-1 в клетке актинического кератоза. При выявлении отрицательной иммунореактивности до 30% и мембранной экспрессии Клаудина-1 в пределах 70-93%, отсутствии мембранно-редуцированной и цитоплазматической экспрессии диагностируют актинический кератоз.

При выявлении отрицательной иммунореактивности в пределах 31-80% и мембранной экспрессии Клаудина-1 менее 41%, при отсутствии мембранно-редуцированной и цитоплазматической экспрессии диагностируют плоскоклеточный рак.

При выявлении отрицательной иммунореактивности в пределах 31-80% и мембранной экспрессии Клаудина-1 менее 41%, наличие мембранно-редуцированной экспрессии в пределах 10-40% и цитоплазматической в пределах 10-70% диагностируют плоскоклеточный рак.

Предлагаемый способ дифференциальной диагностики позволяет по диагностической биопсии части очага проводить дифференциальный диагноз, не прибегая к полному иссечению элемента. Это значительно повышает информативность исследования. Метод более специфичен и менее трудоемок, поскольку подсчет индекса пролиферации не всегда достоверно отличается при предраковом и злокачественном процессе, а определение локализации пролиферирующих клеток в разных слоях эпидермиса имеет субъективный характер. Метод позволяет диагностировать трансформацию актинического кератоза в плоскоклеточный рак на ранних этапах и соответственно своевременно выбрать адекватную тактику лечения.

Пример 1.

Больной К., 50 лет, обратился с жалобами на образование на коже виска. Болен в течение 10 лет. 10 лет назад появилось пятно красного цвета, постепенно пятно увеличивалось в размере. Последние два года на поверхности пятна стали появляться гиперкератотические наслоения.

При осмотре на коже левого виска гиперемированный очаг округлой формы размером 1,0×1,7 см, на поверхности наслоение корок желтого цвета. Субъективных ощущений нет.

Предварительный диагноз: актинический кератоз гипертрофическая форма.

По предлагаемому способу было проведено иммуногистохимическое исследование с антителами к Клаудину-1 биоптата очага поражения. Отрицательная иммунореактивность была выявлена в 15% клеток, мембранная экспрессия в 85% клеток. Установлено отсутствие мембранно-редуцированной и цитоплазматической экспрессии молекулы Клаудина-1. На основании исследования был выставлен диагноз актинический кератоз, что позволило рекомендовать в качестве лечения химическую деструкцию. Через три месяца на месте патологического очага - белесоватое пятно.

На фиг. 1. представлена отрицательная иммунореактивность молекулы Клаудина-1 в 15% клеток и мембранная в 85% клеток актинического кератоза, отсутствие мембранно-редуцированной и цитоплазматической экспрессии. Иммуногистохимическое окрашивание с антителами к Клаудину-1, ПАП-метод, докрашивание гематоксилином Майера. Ув. х 100.

Пример 2.

Больной 67 лет предъявляет жалобы на образование на коже щеки. Болен в течение 5 лет. Постепенно очаг увеличивался в размере. Последний год на поверхности очага появилась корка.

При осмотре на коже правой щеки округлый очаг розового цвета размером 1,7×2,2 см, инфильтрированный. На поверхности очага определяется корка темного цвета. Субъективных ощущений нет.

Предварительный диагноз: плоскоклеточный рак.

По предлагаемому способу было проведено иммуногистохимическое исследование с антителами к Клаудину-1 биоптата очага поражения. Отрицательная иммунореактивность была выявлена в 65% клеток, мембранная экспрессия определялась в 20% клеток. Установлено отсутствие мембранно-редуцированной и цитоплазматической экспрессии. На основании исследования был выставлен диагноз плоскоклеточный рак, что позволило рекомендовать в качестве лечения лучевую терапию. Через три месяца на месте патологического очага образовался рубец.

На фиг. 2. представлена отрицательная иммунореактивность молекулы Клаудина-1 в 65% клеток и мембранная экспрессия определалась в 20% клеток плоскоклеточного рака. Установлено отсутствие мембранно-редуцированной и цитоплазматической экспрессии. Иммуногистохимическое окрашивание с антителами к Клаудину-1, ПАП-метод, докрашивание гематоксилином Майера. Ув. х 50.

Пример 3.

Больной 62 года предъявляет жалобы на образование на коже лба. Болен в течение 7 лет. Постепенно очаг увеличивался в размере. Последний год на поверхности очага появилась корки.

При осмотре на коже лба округлый очаг розового цвета размером 1,5×2,0 см, на поверхности наслоение корок желтого цвета. При удаление корок обнажается эрозия. Субъективных ощущений нет.

Предварительный диагноз: плоскоклеточный рак.

По предлагаемому способу было проведено иммуногистохимическое исследование с антителами к Клаудину-1 биоптата очага поражения. Отрицательная иммунореактивность Клаудина-1 была выявлена в 50% клеток, мембранная экспрессия в 35% клеток, мембранно-редуцированная экспрессия в 25% клеток и цитоплазматическая в 40% клеток. На основании исследования был выставлен диагноз плоскоклеточный рак, что позволило рекомендовать в качестве лечения хирургическую эксцизию. Через три месяца на месте очага рубец.

На фиг. 3. представлена отрицательная иммунореактивность Клаудина-1 в 50% клеток, мембранная экспрессия в 35% клеток, мембранно-редуцированная экспрессия в 25% клеток и цитоплазматической экспрессии в 40% клеток плоскоклеточного рака. Иммуногистохимическое окрашивание с антителами к Клаудину-1, ПАП-метод, докрашивание гематоксилином Майера. Ув. х 100.