Результат интеллектуальной деятельности: Способ определения биологического возраста трупа

Изобретение относится к судебной медицине, а именно к судебно-медицинской экспертизе, криминалистике, и предназначено для определения биологического возраста трупа при фрагментации тела.

По литературным данным проблема судебно-медицинской идентификации личности всегда была объектом особого внимания, и значительную актуальность она приобретает в случаях массовых жертв при техногенных чрезвычайных ситуациях, сопровождающихся фрагментацией тел. Вследствие глубоких термических поражений кожи особые приметы (рубцы, татуировки) утрачивают свое диагностическое значение. При этом визуальное опознание погибшего зачастую невозможно (Баринов Е.Х., Щербаков В.В., Федулова М.В., Гончарова Н.Н. Идентификация личности при чрезвычайных ситуациях с массовыми человеческими жертвами / под ред. Ю.И. Пиголкина. - М.: «Медицинский информационно-аналитический центр», 2008. - 235 с.).

Известен способ определения биологического возраста трупа при длительной кровопотере по экспрессии иммуногистохимических маркеров Ki67, р53 и bcl-2 в базальном слое эпидермиса (Пиголкин Ю.И., Должанский О.В. Способ определения биологического возраста трупа при длительной кровопотере. - Патент на изобретение РФ №2013152075/15 от 25.11.2013).

Недостатки: необходимость исследования участков кожи в семи областях тела: шеи, груди, спины, ягодиц, передневнутренней поверхности бедра, передней поверхности предплечья и подошвенной поверхности стопы и невозможность использования способа при обширных повреждениях кожи либо отсутствии некоторых фрагментов тела.

Известен способ определения биологического возраста трупа при повторной кровопотере по экспрессии иммуногистохимических маркеров elastin, fibrillin, amyloid Р, vitronectin, fibulin-5 в сосочковом слое дермы неповрежденной кожи (Пиголкин Ю.И., Должанский О.В. Способ определения биологического возраста трупа при повторной кровопотере. - Патент на изобретение РФ №2013152076/15 от 25.11.2013).

Недостатки: необходимость исследования участков кожи в семи областях тела: шеи, груди, спины, ягодицы, передневнутренней поверхности бедра, передней поверхности предплечья и подошвенной поверхности стопы и невозможность использования способа при обширных повреждениях кожи либо отсутствии фрагментов тела.

Технический результат: возможность определения биологического возраста трупа по одному фрагменту - мозжечку - при высокой точности способа.

Поставленная задача решается способом определения биологического возраста трупа, заключающимся в том, что в коре полушарий неповрежденного мозжечка определяют расстояние между грушевидными нейронами, их высоту при расположении ганглионарного слоя по диаметру объектива и процентное содержание иммунопозитивных грушевидных нейронов к белку S100, и при расстоянии, равном 160-200 мкм, высоте, равной 40 мкм и более, и количестве иммунопозитивных грушевидных нейронов к белку S100 15% и менее делают вывод о биологическом возрасте трупа 20-30 лет; при расстоянии, равном 201-230 мкм, высоте, равной 38 мкм и менее, и количестве иммунопозитивных грушевидных нейронов к белку S100 более 15% делают вывод о биологическом возрасте трупа 60-70 лет.

Практически способ осуществляют гистологическим исследованием тканей (Саркисов Д.С., Перов Ю.Л. Микроскопическая техника. - М.: Медицина. - 1996. - С. 4-50, 339-445) следующим образом:

Исследуют участки коры мозжечка, например, в верхней полулунной дольке на вершине извилины в обоих полушариях.

Кусочки фиксируют в 10% растворе забуференного по Лилли формалина (рН-7,2) в течение 24 часов (Петров, С.В., Киясов А.П. Иммуногистохимическая диагностика опухолей человека: руководство для врачей-морфологов. - Казань, 1998. - 165 с.).

Материал промывают в проточной воде в течение 30 минут, а затем подвергают обезвоживанию и заливке в парафин по следующей схеме: спирт 60,0% - 2 часа, спирт 70,0% - 2 часа, спирт 96,0% - 2 часа, спирт 96,0% - 2 часа, спирт + ксилол (1:1) - 2 часа, ксилол + парафин (1:1) - 2 часа, парафин I 56° - 2 часа, парафин II 56° - 1 час.

Кусочки заливают в парафиновые блоки.

На ротационном микротоме изготавливают гистологические срезы толщиной 4-6 микрон.

Часть срезов окрашивают методом Ниссля (по Снесареву) (Хонин Г.А., Барашкова С.А., Семченко В.В. Морфологические методы исследования в ветеринарной медицине: Учебное пособие. - Омск: Омская областная типография, 2004. - С. 93-94). Приготавливают красящий раствор: 0,2 г тионина растирают в ступке, постоянно добавляя дистиллированную воду (100 мл). Доводят до кипения, тщательно перемешивают, фильтруют через мелкопористый фильтр.

Собранные в 96% спирте целлоидиновые срезы толщиной 8-9 мкм прогревают до появления пузырьков и охлаждают. Также прогревают и охлаждают срезы в красящем растворе. Промывают дистиллированной водой - 2-кратно.

Проводят через 96% спирт (под контролем микроскопа до исчезновения фонового окрашивания) - 2-кратно. Просветляют, заключают срезы. В результате ядра, ядерные структуры нейронов и глиальных клеток, тигроид (вещество Ниссля) окрашиваются в сине-фиолетовый цвет.

Количественный (морфометрический) анализ исследуемых гистологических образцов проводят с использованием программного пакета BioVision, version 4,0 (Австрия). Захват изображений обеспечивают использованием цифровой камеры для микроскопа САМ V200, Vision (Австрия). Размеры гистологических объектов выражают в мкм.

Морфометрический анализ включает измерение расстояния между грушевидными нейронами при расположении ганглионарного слоя по диаметру объектива (объектив ×10) и их высоту (объектив ×40). В каждом препарате проводят от 5 до 10 измерений, после чего вычисляют средние величины и стандартные отклонения для каждого случая, а также средние величины в группе.

Иммуногистохимические исследования выполняют по стандартным протоколам. Используют концентрированные первичные моноклональные мышиные антитела к S100 протеину клон 4С4.9 (Lab Vision США). Рабочее разведение 1:100. Система визуализации KP50L (Diagnostic BioSystems, USA). Парафиновые срезы наклеивают на предметные стекла с адгезивным полилизиновым покрытием (Thermo Scientific, Menzel-Glaser Polysine® Slides 25×75×1,0 mm, Gerhard Menzel GmbH).

С целью восстановления антигенных детерминант после формалиновой фиксации депарафинизированные срезы подвергают нагреванию: срезы помещают в 0,01 М цитратный буфер (рН-6,0) и кипятят в течение 20-30 минут, затем - в трис-буфер (рН-7,5) на 5 минут, обрабатывают 0,3% раствором перекиси водорода (пероксидазный блок), после чего проводят инкубацию с первичными антителами в течение 10-30 минут во влажной камере (Петров, СВ., Киясов А.П. Иммуногистохимическая диагностика опухолей человека: руководство для врачей-морфологов. - Казань, 1998. - 165 с.). Перед использованием концентрированные антитела разводят растворителем антител (Primary Antibody Diluent, Diagnostic BioSystems, USA) в титре 1:100, согласно инструкции фирмы-производителя антител. При проведении иммуногистохимических исследований используют позитивные контроли, рекомендованные фирмой-производителем.

Затем срезы трехкратно промывают в трис-буфере, после чего подвергают экспозиции с вторичными антителами (мышиные и кроличьи биотинилированные антитела) (Diagnostic BioSystems, USA) в течение 10 минут, промывают в трис-буфере, обрабатывают конъюгированным с пероксидазой стрептавидином в течение 10 минут и подвергают окрашиванию DAB+(3,3'-диаминобензидин) (Diagnostic BioSystems, USA) в течение 1-2 минуты, не допуская появления фонового окрашивания. Промывают в 2-3 порциях дистиллированной воды в течение 10-15 минут и докрашивают гематоксилином Майера. Срезы заключают в канадский бальзам и исследуют в проходящем свете микроскопа при увеличении ×400.

При просмотре препаратов на светооптическом уровне антиген-позитивные грушевидные нейроны идентифицируют по появлению коричневого окрашивания. Подсчитывают все грушевидные нейроны в срезе. Определяют процент иммунопозитивных клеток.

С помощью данных методов изучались ткани коры мозжечка, полученные при судебно-медицинском исследовании 240 трупов (120 лиц мужского пола и 120 лиц женского пола) в возрасте от 18 до 85 лет, не имеющих повреждений и патологических изменений мозжечка.

Проведенный статистический анализ установил, что расстояние между грушевидными нейронами, их высоту и иммуногистохимический маркер белок S100 можно использовать для определения биологического возраста трупа человека.

Примеры конкретного выполнения.

Пример 1.

Согласно акту судебно-медицинского исследования на месте происшествия были обнаружены фрагменты расчлененного трупа мужчины с ожоговой травмой лица и шеи III-IV степени. Ожоговая травма не позволяла определить биологический возраст трупа.

Следственные органы интересовал биологический возраст трупа.

При микроскопическом исследовании коры мозжечка выявили, что расстояние между грушевидными нейронами варьирует от 160 до 198 мкм, высота грушевидных нейронов при расположении ганглионарного слоя по диаметру объектива составляет от 42 до 54 мкм, а количество иммунопозитивных грушевидных нейронов к белку S100 составляет 8%.

На основании указанных признаков был сделан вывод, что расчлененные фрагменты трупа принадлежат лицу, биологический возраст которого составляет 20-30 лет (нормативные данные для этой возрастной группы включают: расстояние между грушевидными нейронами 160-200 мкм, высота грушевидных нейронов 40 мкм и более, количество иммунопозитивных грушевидных нейронов к белку S100 - 15% и менее).

Пример 2.

Согласно акту судебно-медицинского исследования в лесу был обнаружен труп мужчины с сочетанными повреждениями мягких тканей лица, костей лицевого отдела черепа и множественными открытыми ранами стенки грудной клетки. Травматическое повреждение мягких тканей лица и костей лицевого отдела черепа затрудняло определение возраста пострадавшего.

Следственные органы интересовали следующие вопросы: 1. Могли ли травма лица и ранения грудной клетки привести к смерти? 2. Биологический возраст трупа.

При микроскопическом исследовании коры мозжечка выявили, что расстояние между грушевидными нейронами варьирует от 201 до 227 мкм, высота грушевидных нейронов при расположении ганглионарного слоя по диаметру объектива составляет от 29 до 37 мкм, а количество иммунопозитивных грушевидных нейронов к белку S100 составляет 34%.

На основании указанных признаков был сделан вывод, что труп принадлежит лицу, биологический возраст которого составляет 60-70 лет (нормативные данные для этой возрастной группы включают: расстояние между грушевидными нейронами 201-230 мкм, высота грушевидных нейронов 38 мкм и менее, количество иммунопозитивных грушевидных нейронов к белку S100 - более 15%).

Способ по изобретению позволяет определять биологический возраст человека и более объективно решать задачи, поставленные перед судебно-медицинским экспертом следственными органами.