Набор праймеров для идентификации РНК штаммов Puumala orthohantavirus, распространённых в Республике Татарстан

Заявленное техническое решение относится к биотехнологии в целом, в т. ч. к генетической инженерии и может быть использовано в вирусологии, эпидемиологии и медицине для обнаружения генетического материала ортохантавируса Puumala - основного возбудителя геморрагической лихорадки с почечным синдромом (ГЛПС) в Приволжском федеральном округе (ПФО) РФ - в образцах ткани мелких мышевидных грызунов и в клинических образцах больных ГЛПС. Заявляемое техническое решение позволяет надежно идентифицировать штаммы Puumala, принадлежащие к русской (RUS) генетической линии вируса и распространенные в Республике Татарстан и на прилегающих территориях ПФО. Идентификация штаммов Puumala необходима для проведения картирования районов их распространения и определения наиболее опасных природных очагов инфекции, что может быть использовано для разработки мероприятий по профилактике и снижению уровня заболеваемости ГЛПС в ПФО.

Одним из наиболее часто применяемых на практике высокочувствительных и видоспецифичных методов выявления геномной РНК вирусов является метод обратной транскрипции с последующей полимеразной цепной реакцией (ОТ-ПЦР).

Далее заявителем представлена идентификация терминов для исключения неоднозначного понимания текста заявленных материалов.

Puumala orthohantavirus (PUUV) - вирус, представитель семейства хантавирусов, геном которого состоит из трех молекул РНК, обозначаемых как S (малый), M (средний) и L (большой) сегменты.

S-сегмент - молекула РНК генома PUUV, содержащая ген, кодирующий нуклеокапсидный белок вируса.

Комплементарность - соответствие нуклеотидов в последовательностях двух цепей нуклеиновых кислот, приводящее к способности образования двухцепочечных комплексов (структур) благодаря формированию пар аденин-тимин и гуанин-цитозин.

кДНК - одноцепочечная молекула ДНК, последовательность которой комплементарна последовательности молекулы РНК.

Амплификация - многократное увеличение числа копий участка ДНК.

ПЦР-амплификация - многократное увеличение числа копий участка ДНК в ходе полимеразной цепной реакции (ПЦР). Матрицей для ПЦР служит кДНК или геномная ДНК.

ПЦР-продукт - фрагмент ДНК, образовавшийся в результате ПЦР-амплификации.

Nested-ПЦР («гнездовая» ПЦР) - ПЦР-амплификация, для которой в качестве матрицы используется ПЦР-продукт. Позволяет повысить чувствительность ПЦР в 10000 раз.

Олигонуклеотид (олигодезоксирибонуклеотид) - короткая одноцепочечная молекула ДНК, длина которой может составлять от нескольких единиц до нескольких десятков нуклеотидов.

Праймер - используемый для проведения ПЦР олигонуклеотид, последовательность которого комплементарна нуклеотидной последовательности участка ДНК, граничащего с целевым участком амплификации.

Прямой праймер - праймер, последовательность которого комплементарна нуклеотидной последовательности участка первой цепи двухцепочечной молекулы ДНК, граничащего с началом целевого участка амплификации.

Обратный праймер - праймер, последовательность которого комплементарна нуклеотидной последовательности участка второй цепи двухцепочечной молекулы ДНК, граничащего с концом целевого участка амплификации.

Отжиг праймера - формирование двухцепочечной структуры вследствие связывания праймера с комплементарным участком одноцепочечной молекулы ДНК.

Маркер: здесь - участок генома, позволяющий однозначно идентифицировать вирус.

Фланкирующий участок (фланкирующая последовательность) - участок (последовательность) молекулы ДНК, граничащий(ая) с целевым участком, подвергающимся ПЦР-амплификации.

Идентичность нуклеотидных (аминокислотных) последовательностей - совпадение нуклеотидов (аминокислотных остатков) в двух последовательностях, выраженное в процентах.

Специфичность праймера - способность праймера образовывать двухцепочечную структуру только с комплементарным участком одноцепочечной молекулы ДНК. Чем больше нуклеотидов в последовательности праймера комплементарны нуклеотидам в последовательности ДНК, тем выше специфичность праймера. Значение идентичности нуклеотидной последовательности специфичного праймера и участка его отжига равна 100%. Чем ниже специфичность праймера, тем выше вероятность несвязывания праймера с нужным участком отжига.

Генетическая дистанция - несоответствие между двумя нуклеотидными (аминокислотными) последовательностями, выраженное в процентах.

Ниже приведено описание существующих методов идентификации генетического материала РНК-содержащих вирусов, выявленных заявителем из уровня техники.

Общую РНК выделяют из образцов биологического материала, содержащего возбудитель вирусного заболевания, по одной из стандартных методик и используют на первом этапе как матрицу для проведения синтеза кДНК с помощью фермента обратной транскриптазы, или ревертазы (РНК-зависимой ДНК-полимеразы). Далее полученную кДНК используют в качестве матрицы для проведения ПЦР-амплификации фрагмента кДНК, выбранного в качестве маркера возбудителя вирусного заболевания (Razzauti M., Plyusnina A., Henttonen H., Plyusnin A. Accumulation of point mutations and reassortment of genomic RNA segments are involved in the microevolution of Puumala hantavirus in a bank vole (Myodes glareolus) population. J. Gen. Virol., 2008, 89, P. 1649-1660.).

Для проведения ПЦР используются специфичные праймеры, комплементарные последовательностям, фланкирующим с двух сторон целевой участок матрицы. Специфичность праймера является одним из ключевых факторов амплификации целевого участка ДНК. Наличие в последовательности праймера нуклеотидов, некомплементарных соответствующим нуклеотидам на целевом участке отжига, может приводить к нарушениям отжига и получению ложноотрицательного результата, а также к ошибочному отжигу на нежелательных участках ДНК и образованию побочных (нецелевых) ПЦР-продуктов (Jaton K., Ninet B., Bille J., Greub G. False-Negative PCR Result Due to Gene Polymorphism: the Example of Neisseria meningitidis. J. Clin. Microbiol., 2010, 48(12), P. 4590-4591; Bacich D. J., Sobek K. M., Cummings J. L., Atwood A. A., O'Keefe D. S. False negative results from using common PCR reagents. BMC Res. Note, 2011, 4:457; Чемерис А.В., Магданов Э.Г., Гарафутдинов Р.Р., Вахитов В.А. Как исключить появление ложно-позитивных результатов при проведении полимеразной цепной реакции? Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю.А.Овчинникова, 2012, 8(3), С. 34-45).

В случаях малого содержания вирусной РНК в биологическом объекте для ее выявления проводят nested-ПЦР, матрицей для которой служит ПЦР-продукт, полученный в первой реакции, а последовательности прямого и обратного праймеров подбираются так, чтобы участки отжига находились в границах этого продукта (см. Фиг 1).

На Фиг. 1 представлена схема амплификации участка генома методом nested-ПЦР.

Ортохантавирус Puumala является возбудителем геморрагической лихорадки с почечным синдромом (ГЛПС) и характеризуется высокой генетической изменчивостью, проявляющейся в накоплении точечных замен нуклеотидов в геноме.

На дату предоставления заявочных материалов различают 8 генетических линий PUUV, распространенных в странах Евразии, генетическая дистанция между нуклеотидными последовательностями S-сегмента генома которых превышает 15% (Castel G., Chevenet F., Razzauti M., Murri S., Marianneau P., Cosson J.-F., Tordo N., Plyusnin A. Phylogeography of Puumala orthohantavirus in Europe. Viruses, 2019, 11, 679).

Выявленные заявителем на дату предоставления заявочных материалов зарубежные аналоги набора праймеров, обеспечивающие ПЦР-амплификацию участков S-сегмента PUUV, разработаны для штаммов вирусных линий, выявленных в странах западной, центральной и северной Европы ( J., Lundkvist ., Persson K. et al. Detection and subsequent sequencing of Puumala virus from human specimens by PCR. J. Clin. Microbiol., 1995, 33(2), P.277-282). Идентичность последовательностей этих праймеров и соответствующих участков отжига в геноме штаммов PUUV, циркулирующих в России, как правило, не превышает 90%, т.е. специфичность праймеров может быть недостаточной для выявления штаммов PUUV в Республике Татарстан (РТ), поэтому существует высокая вероятность получения ложноотрицательного результата. Данное обстоятельство становится особенно важным при проведении выявления РНК PUUV в крови или сыворотке больных ГЛПС, поскольку такое определение проводится методом nested-ПЦР, который требует использования двух пар высокоспецифичных праймеров.

Наиболее близким отечественным аналогом заявленного набора праймеров являются праймеры, использованные для идентификации штаммов PUUV, принадлежащих к русской генетической линии (RUS), в Самарской области, Башкирии, Удмуртии (Kariwa H., Tkachenko E. A., Morozov V. G. et al. Epidemiological study of hantavirus infection in the Samara Region of European Russia. J. Vet. Med. Sci., 2009, 71(12), P.1569-1578).

Недостатком известного технического решения является то, что значения идентичности последовательностей приведенных в публикации праймеров и последовательностей соответствующих участков отжига в S-сегменте большинства штаммов PUUV, выявленных в РТ, не превышают 91,0-95,2%, вследствие чего существует высокая вероятность получения ложноотрицательных результатов ПЦР-амплификации. Кроме того, указанные праймеры использовались для определения РНК PUUV в легочной ткани рыжей полевки и не были предназначены для выявления РНК PUUV в крови больных ГЛПС с применением метода nested-ПЦР.

На дату предоставления заявочных материалов выявлен ряд зарубежных аналогов.

Так, известно изобретение по патенту CN 101294226 (A) - 2008-10-29 «RT-PCR method for testing hantavirus genome» («Метод ОТ-ПЦР для определения хантавирусного генома»). Сущностью известного технического решения является способ обнаружения хантавирусного генома, включающий следующие этапы:

А. Разработаны две пары праймеров, применимых для всех хантавирусов:

а. Последовательность прямого праймера HV P1: GATTGAAGATATTGAGTCACC;

Последовательность обратного праймера HV P2: GTTGTATCCCCATTGATTGTG;

b. Последовательность прямого праймера HV P3: TGAGAAATGTGTATGACATGA;,

Последовательность обратного праймера HV P4: ACTACACACTGTTTCAAATGA;

B. Метод обнаружения вируса Хантаан:

а) выделение общей РНК из сыворотки с использованием набора реагентов для выделения вирус-специфической РНК;

б) с помощью анализатора нуклеиновых кислот определяют концентрацию РНК, для всех образцов РНК должно выполняться отношение OD260 / 280 ≥ 1,9, после чего берут 50 нг РНК для реакции ОТ-ПЦР;

c) ОТ-ПЦР: для проведения обратной транскрипции используют ген-специфический праймер HV P0 5'-ATGCAATATGATGAAAAG-3', условия реакции: реакция в течение 60 минут при 37°C, 5 минут при 93°C, остановка реакции путем охлаждения на льду в течение 3 минут;

ПЦР с использованием универсальных праймеров HV P1/P2 или HV P3/P4, условия реакции: предварительная денатурация в течение 3 минут при 94°C, денатурация при 94°C в течение 1 минуты, отжиг в течение 1 минуты при 50°C, элонгация в течение 1 минуты. при 72°С; 35 циклов; и, завершающая элонгация при 72°С в течение 5 мин;

d) результаты амплификации вирусной нуклеиновой кислоты определяют с помощью электрофореза в 1,5% агарозном геле; специфическая полоса соответствует фрагменту нуклеиновой кислоты длиной 250 п.н.

Недостатком известного технического решения является несоответствие нуклеотидных последовательностей заявленных праймеров последовательностям S-сегмента PUUV и, следовательно, неприменимость заявленных праймеров для ПЦР-амплификации участков генома PUUV.

Известно изобретение по патенту CN102382906 (A) - 2012-03-21 «Degenerate RT-PCR detection method of Hantavirus group» («Метод вырожденной ОТ-ПЦР для определения группы хантавирусов»). Сущностью известного технического решения является метод вырожденной ОТ-ПЦР для группы хантавирусов, включающий следующие этапы:

a. Выделение РНК: РНК выделяют с помощью набора реагентов для экстракции РНК согласно инструкции;

б. Обратная транскрипция: для получения матрицы для ПЦР с помощью набора реагентов для обратной транскрипции РНК проводят обратную транскрипцию РНК в соответствии с инструкцией;

c. ПЦР: готовят реакционную смесь для ПЦР такого состава: 10 × ПЦР-буфер 2,5 мкл; 1,5 мкл раствора MgCl₂ с концентрацией 25 мМ; 0,5 мкл раствора dNTP с концентрацией 10 мМ; 0,5 мкл раствора Taq-полимеразы с концентрацией 5U/мкл; 1 мкл раствора прямого праймера; 1 мкл раствора обратного праймера; 2 мкл вышеуказанной матрицы для ПЦР; 16 мкл стерильной деионизированной воды;

условия реакции: предварительная денатурация при 94°С в течение 5 минут, денатурация при 94°С в течение 30 с, отжиг при 52°С в течение 30 с, элонгация при 72°С в течение 1 мин, 35 циклов, элонгация при 72°С в течение 7 минут. Полученный ПЦР-продукт сохраняют при 4°С. Концентрация раствора прямого праймера G1 равна 25 мМ, нуклеотидная последовательность прямого праймера GCAACACCAACATGGTTTcartaytayac; концентрация раствора обратного праймера G2 равна 25 мМ;. Нуклеотидная последовательность обратного праймера CTTCTTCATTCATATTTCCATGCarnccyttytc;

d. электрофорез в агарозном геле: целевой продукт выявляют с помощью электрофореза в агарозном геле с концентрацией 1-1,5% , условия электрофореза: 100 В, 30 мин, результаты электрофореза анализировали с помощью системы для визуализации. В результате была обнаружена полоса, соответствующая продукту ПЦР-амплификации участка генома группы хантавирусов длиной 478 п.н.

Основным недостатком известного технического решения является то, что последовательности предложенных праймеров рассчитаны для участка генома группы хантавирусов и не учитывают различий в последовательностях данного участка отдельных видов, в частности PUUV. Таким образом, применение данных праймеров может привести к получению ложноотрицательных результатов. Кроме того, наличие только одной пары праймеров не позволяет применить метод nested-ПЦР и таким образом не дает возможности определять РНК вируса PUUV у больных ГЛПС.

Известно изобретение по патенту CN103484566 (A) - 2014-01-01 «Primer, kit and method for conducting genetic typing on hantavirus by means of PCR direct sequencing method» («Праймеры, набор реагентов и способ проведения генетического типирования хантавирусов с помощью метода прямого секвенирования продуктов ПЦР»). Сущностью известного технического решения является пара праймеров, состоящая из прямого праймера: ATTAGCCCWGTCATGAGTGT; и обратного праймера: CTTTGACTCYTTTGKYTCCA; где Y обозначает C или T, W обозначает A или T, K обозначает G или T.

2. Способ генотипирования хантавируса с использованием праймера по п. 1, включающий: (1) выделение общей РНК образца вируса, подлежащего тестированию, и получение кДНК путем обратной транскрипции; (2) использование кДНК в качестве матрицы и праймеров, указанных в п. 1. Праймеры используют для ПЦР-амплификации и целевой продукт амплификации секвенируют; (3) Филогенетическое дерево строится на основе информации о последовательности целевого продукта и соответствующего фрагмента генома штамма с известным генотипом; (4) Генотипирование тестируемых образцов вируса на основе филогенетических деревьев.

3. Метод, используемый в п. 2, при котором на этапе (2) амплифицированный целевой фрагмент секвенируют путем двухстороннего секвенирования, и объединение последовательностей выполняют после завершения секвенирования.

4. Метод, используемый в п. 2, в котором на этапе (3) филогенетическое древо строят методом neighbor joining.

5. Для метода, указанного в п. 2, используют штаммы с известным генотипом: 76-118, A16, C1-2, NC167, Z10, Gou3, K24-V2, L99, R22, Hantaviruses SR11, 160V, Dobrava, Cg-13891, Cg-Erft, K27, Vranica, AH1, C9717869, Of22819, Bayou, NMH10, NMR11, CC74 и CC107.

6. Набор реагентов для генотипирования хантавирусов, включающий ПЦР-буфер, раствор dNTP, раствор MgCl₂, Taq-полимеразу, праймеры, отрицательный контроль, положительный контроль и деионизированную воду, в котором используются праймеры являющиеся формулой изобретения и описанные в п. 1.

7. Набор реагентов, указанный в п. 6, содержащий раствор MgCl₂ с концентрацией составляет 25 мМ, и раствор dNTP с концентрацией 10 мМ.

8. Набор реагентов, указанный в п. 6, дополнительно содержащий препарат нуклеиновой кислоты и реагент для извлечения ПЦР-продукта из геля.

Недостатком известного технического решения является несоответствие нуклеотидных последовательностей заявленных праймеров последовательностям S-сегмента PUUV и, следовательно, неприменимость заявленных праймеров для ПЦР-амплификации участков генома PUUV.

На дату предоставления заявочных материалов выявлен ряд отечественных аналогов.

Так, известно изобретение по патенту RU 2199589 «Способ обнаружения вируса лихорадки Западного Нила». Сущностью известного технического решения является способ обнаружения вируса лихорадки Западного Нила, предусматривающий проведение реакции обратной транскрипции с РНК вируса с использованием праймера и последующей двойной амплификацией с помощью праймеров, анализ реакционной смеси с помощью электрофореза в агарозном геле и выявление РНК вируса по результатам анализа, отличающийся тем, что в качестве праймера для проведения реакции обратной транскрипции с РНК вируса используется олигонуклеотид из 23 звеньев со следующей последовательностью нуклеотидов: GGGCATTCATAAGTGATAGTATC, комплементарной области pre-М генома вируса, в качестве праймеров для первой амплификации используются олигонуклеотиды из 22 и 23 звеньев, имеющих следующие последовательности: GTAGTTCGCCTGTGTGAGCTGA и TCGGTAGCATTTACCGTCATCAT, в качестве праймеров для второй амплификации используют олигонуклеотиды из 22 и 23 звеньев, имеющих следующие последовательности: AACTTAGTAGTGTTTGTGAGGA и TCGGTAGCATTTACCGTCATCAT, при этом РНК вируса выявляют при наличии в анализируемых образцах полосы размером 495 нуклеотидных пар.

Недостатком известного технического решения является то, что заявленные пары праймеров предназначены для определения участка M-сегмента генома вируса лихорадки Западного Нила, то есть они не могут быть применены для определения участков S-сегмента хантавируса Puumala.

Известно изобретение по патенту RU 2294963 «Набор олигонуклеотидных праймеров для идентификации РНК вируса Крымской-Конго геморрагической лихорадки в полевых и клинических образцах». Сущностью известного технического решения является набор олигонуклеотидных праймеров для идентификации РНК вируса Крымской-Конго геморрагической лихорадки в полевых и клинических образцах, содержащий 2 пары олигонуклеотидов, обладающих активностью прямого и обратного праймеров в реакции обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции со следующей структурой:

5' gaagccaa(a,g)aagac(t,c)gt(a,g)gaggctc 3' - SP1;

5' caattgtcttggc(a,g)ca(t,c)ggatt 3' - SP2;

5' gcacagattgacac(t,c)(g,c)ctttcagc 3' - SP3;

5' gtccg(t,a)aggtt(a,g)agaatggacttggt 3' - SP4.

Недостатком известного технического решения является его назначение для определение участка генома вируса Крымской-Конго геморрагической лихорадки, то есть он не может быть применен для определения участков генома хантавируса Puumala.

Известно изобретение по патенту RU 2487167 «Набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченых зондов для видоспецифичной экспресс-идентификации вируса Эбола-Судан методом полимеразной цепной реакции». Сущностью известного технического решения является набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченых зондов для видоспецифичной экспресс-идентификации вируса Эбола-Судан методом полимеразной цепной реакции в реальном времени, включающий последовательности, видоспецифичные для вируса Эбола-Судан:

внешние:

5'→3'5'CCGTTATTCTCYACRAAGRTSATTAGTGA3'

3'←5'5'TTCTCTAGGTCTGTGACAAAACTACTCCC3'

внутренние:

5'→3'5'TGGGATGCAGTHTTYGARCC3'

3'←5'5'ACAACCATCATRTTGCTTGGAAAGGCTT3'

зонд:

FAM - TATTGCCCCAGAATCGAAATTTTTCTTTTTCATTGAA-BHQ1.

Недостатком известного технического решения является то, что известные праймеры предназначены для идентификации вируса Эбола-Судан методом ПЦР в реальном времени с использованием флюоресцентного метода детекции продуктов ПЦР-амплификации. Кроме того, известные праймеры рассчитаны для участка генома вируса Эбола-Судан и не могут быть применены для определения участков генома хантавируса Puumala.

Задачей заявленного технического решения является разработка и создание специфичного набора праймеров, дающих возможность получения продукта ПЦР-амплификации участка S-сегмента PUUV для проведения дальнейшего генетического анализа с обеспечением исключения ложноотрицательных результатов, а также высокой достоверности и воспроизводимости положительных результатов ПЦР-амплификации. Кроме того, заявленное техническое решение позволяет проводить определение РНК PUUV как в легочной ткани рыжей полевки, так и в крови больных ГЛПС. Таким образом, заявленное техническое решение превосходит известные из уровня техники аналоги, разработанные для генетических линий, распространенных в странах Европы, и не предназначенные для выявления РНК штаммов PUUV русской генетической линии, распространенных в РТ. Также заявленное техническое решение превосходит известные из уровня техники аналоги, разработанные для штаммов PUUV русской генетической линии, распространенных в других регионах России, и не исключающих получение ложноотрицательного результата при определении РНК штаммов PUUV, выявленных в РТ, а также не применимых для выявления РНК штаммов PUUV у больных ГЛПС методом nested-ПЦР. Таким образом, заявленное техническое решение обеспечивает достоверную идентификацию штаммов PUUV, распространенных в популяциях рыжей полевки и выявленных у больных ГЛПС в РТ, что дает возможность проведения последующего картирования районов распространения штаммов PUUV на территории республики, определения районов инфицирования больных ГЛПС, разработки методов дератизации этих территорий, а также выбора метода лечения ГЛПС с учетом особенностей генома выявленного инфицирующего штамма вируса.

Техническим результатом заявленного технического решения является разработка набора праймеров для выявления и идентификации генетического материала штаммов PUUV, распространенных в РТ, что обеспечивает достоверность и воспроизводимость результатов ПЦР-амплификации.

Сущностью заявленного технического решения является набор из 2-х пар праймеров для идентификации РНК штаммов Puumala orthohantavirus, обладающих активностью прямого и обратного праймеров в полимеразной цепной реакции и имеющих следующую структуру

39S-F3: 5'-GGCCAAAACATCTATATGTATCC-3' (23 н.)

69S-B3: 5'-GATATCTCTTTTACCTTCTGGTC-3' (23 н.)

PUUV-S-F704: 5'-AACATCATGAGTCCAGTAATGGG-3' (23 н.)

PUUV-S-R1183: 5'-GTACAGTAGGATTATCCTCTGATC-3' (24 н.)

Заявленное техническое решение иллюстрируется Фиг. 1 - Фиг. 4.

На Фиг. 1 представлена схема амплификации участка генома методом nested-ПЦР.

На Фиг. 2 представлен участок нуклеотидной последовательности кДНК S-сегмента штамма Puu/Kazan, содержащий фрагменты, амплифицируемые в 1-м и 2-м раундах nested-ПЦР. Цифры слева и справа обозначают позиции в последовательности. Жирным шрифтом выделены участки отжига заявляемых праймеров, сверху приведено их обозначение.

На Фиг. 3 приведены результаты электрофоретического разделения продуктов 1-го раунда ПЦР, проведенного с помощью праймеров 39S-F3 и 69S-B3 (1,0% агарозный гель). В качестве матрицы использованы кДНК, синтезированные на РНК, выделенной из легочной ткани рыжих полевок.

Позиции на Фиг. 3 обозначают:

1 - Маркер длин фрагментов.

2 - Отрицательный контроль.

3 - Отрицательный контроль - ПЦР-продукт, полученный в результате ПЦР-амплификации участка невирусной кДНК.

4 - Положительный контроль - ПЦР-продукт, полученный в результате ПЦР-амплификации участка кДНК ранее идентифицированного штамма PUUV.

5-9 - ПЦР-продукт, полученный в результате ПЦР-амплификации участка кДНК,, синтезированной на РНК, выделенной из легочной ткани рыжих полевок.

На Фиг. 4 приведены результаты электрофоретического разделения продуктов 2-го раунда nested-ПЦР, проведенного с помощью праймеров PUUV-S-F704 и PUUV-S-R1183 (1,0% агарозный гель). В качестве матрицы использованы продукты амплификации первого раунда. Праймеры для 1-го раунда nested-ПЦР: 39S-F3 и 69S-B3; матрица - кДНК, синтезированные на РНК, выделенной из крови больных ГЛПС.

Позиции на Фиг. 4 обозначают:

1 - Маркер длин фрагментов.

2 - Отрицательный контроль.

3 - Отрицательный контроль - ПЦР-продукт, полученный в результате ПЦР-амплификации участка невирусной кДНК.

4 - Положительный контроль - ПЦР-продукт, полученный в результате ПЦР-амплификации участка кДНК ранее идентифицированного штамма PUUV.

10-20 - ПЦР-продукт, полученный в результате второго раунда nested-ПЦР-амплификации участка кДНК, синтезированной на РНК, выделенной из крови больных ГЛПС.

Далее заявителем приведен пример конкретного выполнения заявленного технического решения.

В рамках заявленного технического решения заявителями разработана схема подбора праймеров, специфичных к участкам генома штаммов PUUV, выявленных в популяциях рыжей полевки и у больных ГЛПС в Республике Татарстан, с учетом последовательностей аналогичных участков генома штаммов PUUV, циркулирующих в странах западной, центральной и северной Европы, размещенных в базе данных GenBank. Апробация праймеров была проведена с использованием биологического материала из рыжих полевок ряда популяций в РТ, а также клинического материала (цельная кровь, сыворотка крови) больных ГЛПС.

Методика конструирования заявляемых олигонуклеотидных праймеров.

Расчет последовательностей праймеров производился на основе результатов сравнительного анализа размещенных в базе данных GenBank нуклеотидных последовательностей S-сегмента штаммов PUUV, распространенных в ряде европейских стран, а также штаммов, выявленных заявителями ранее в популяциях рыжей полевки в Республике Татарстан.

На Фиг. 2 представлен участок нуклеотидной последовательности кДНК S-сегмента штамма Puu/Kazan, содержащий фрагменты, амплифицируемые в 1-м и 2-м раундах nested-ПЦР. Цифры слева и справа обозначают позиции в последовательности. Жирным шрифтом выделены участки отжига заявляемых праймеров, сверху приведено их обозначение.

Апробация разработанных праймеров была проведена с использованием большого количества образцов, содержащих вирусную РНК и выделенных из легочной ткани рыжей полевки и крови больных ГЛПС, идентификация и секвенирование участков S-сегмента PUUV в которых была осуществлена заявителями ранее.

Характеристика набора праймеров и участка амплифицируемой геномной РНК PUUV.

Участки гибридизации праймеров фланкируют фрагмент S сегмента PUUV. В первом раунде nested-ПЦР амплифицируется фрагмент длиной 760 п.н., соответствующий поз. 560-1319 в последовательности S-сегмента. Во втором раунде амплифицируют фрагмент длиной 525 п.н., соответствующий поз. 682-1206 (Таблица 1).

Таблица 1

Структура набора заявленных праймеров для выявления S-сегмента генома Puumala orthohanatavirus

Из данных, приведенных в Таблице 1, можно сделать вывод, что заявителями разработан набор праймеров, позволяющий достоверно идентифицировать различные генетические варианты Puumala orthohantavirus в биологическом материале и в клинических образцах.

Ниже заявителями приведены примеры 1-5, в которых представлен алгоритм идентификации PUUV в биологическом материале.

Пример 1. Выделение общей РНК из биологического материала.

Выделение общей РНК из легочной ткани рыжей полевки и цельной крови/сыворотки больных ГЛПС проводят, например, с использованием реагента TRIzol (Life Technologies, США) согласно рекомендациям производителя (https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15596026#/15596026).

Пример 2. Синтез кДНК.

Синтез кДНК осуществляют, например, с помощью обратной транскриптазы RevertAid Reverse Transcriptase (Thermo Fisher Scientific, США) согласно протоколу производителя (https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/EP0441#/EP0441).

Пример 3. Проведение 1-го раунда ОТ-nested-ПЦР.

Для проведения 1-го раунда ОТ-nested-ПЦР готовят реакционную смесь:

ПЦР проводят, например, в термоциклере С1000 ThermalCycler (Bio-Rad, США) по следующей программе:

94°С - 3 мин

35 циклов: 94°С - 30 сек

52°С - 30 сек

72°С - 50 сек

72°С - 5 мин

4°С - ∞

Пример 4. Проведение 2-го раунда ОТ-nested-ПЦР.

Для проведения 2-го раунда ОТ-nested-ПЦР готовят реакционную смесь:

ПЦР проводят, например, в термоциклере С1000 ThermalCycler по следующей программе:

94°С - 3 мин

35 циклов: 94°С - 30 сек

53°С - 30 сек

72°С - 35 сек

72°С - 5 мин

4°С - ∞

Пример 5. Детекция продуктов амплификации.

Разделение продуктов амплификации проводят методом электрофореза в 1,0% агарозном геле. Визуализацию ДНК проводят с помощью окрашивания бромистым этидием и последующего УФ-облучения с использованием, например, системы гель-документации GelDoc XR+ (Bio-Rad).

Результаты приведены на Фиг. 3 и 4.

На Фиг. 3 приведены результаты электрофоретического разделения продуктов 1-го раунда ПЦР, проведенного с помощью праймеров 39S-F3 и 69S-B3 (1,0% агарозный гель). В качестве матрицы использованы кДНК, синтезированные на РНК, выделенной из легочной ткани рыжих полевок.

Показано, что для всех исследуемых образцов получено только по одному ПЦР-продукту, длина которого соответствует ожидаемой (см. 5-9). Неспецифические продукты реакции отсутствуют.

На Фиг. 4 приведены результаты электрофоретического разделения продуктов 2-го раунда nested-ПЦР, проведенного с помощью праймеров PUUV-S-F704 и PUUV-S-R1183 (1,0% агарозный гель). В качестве матрицы использованы продукты амплификации первого раунда. Праймеры для 1-го раунда nested-ПЦР: 39S-F3 и 69S-B3; матрица - кДНК, синтезированные на РНК, выделенной из крови больных ГЛПС.

Показано, что для всех исследуемых образцов получено только по одному ПЦР-продукту, длина которого соответствует ожидаемой (см. 10-22). Неспецифические продукты реакции отсутствуют.

Таким образом, заявителем показано, что разработанные праймеры могут быть использованы как для проведения рутинной ПЦР, так и для проведения nested-ПЦР. Благодаря близким температурам плавления каждый из двух прямых праймеров может быть использован для проведения ПЦР в паре с каждым из двух обратных праймеров. Показано, что применение данного набора праймеров в ОТ-ПЦР и ОТ-nested-ПЦР для выявления ортохантавируса Puumala обеспечивает воспроизводимый синтез фрагментов ДНК ожидаемой длины, соответствующих целевому участку генома. Специфичность полученных ПЦР-продуктов во всех случаях была подтверждена с помощью метода прямого секвенирования по Сэнгеру.

Из описанного выше можно сделать общий вывод, что заявителями достигнуты поставленные задачи и заявленные технический результаты, создан специфичный набор олигонуклеотидов, обладающих активностью прямого (F) и обратного (R) праймеров, дающих возможность получения нуклеотидной последовательности фрагмента S-сегмента PUUV для проведения дальнейшего генетического анализа. Разработан набор праймеров для выявления и идентификации генетического материала PUUV.

Заявленное техническое решение соответствует критерию «новизна», предъявляемому к изобретениям, так как из исследованного уровня техники не выявлены технические решения, обладающие заявленной совокупностью отличительных признаков, обеспечивающих достижение заявленных результатов.

Заявленное техническое решение удовлетворяет критерию «изобретательский уровень», предъявляемому к изобретениям, поскольку из исследованного уровня техники заявителем не выявлены технические решения, характеризующиеся разработанным заявителями специфичным набором олигонуклеотидов, обладающих активностью прямого (F) и обратного (R) праймеров, дающих возможность получения нуклеотидной последовательности фрагмента S-сегмента PUUV для проведения дальнейшего генетического анализа и набором праймеров для выявления и идентификации генетического материала PUUV.

Заявленное техническое решение соответствует критерию «промышленная применимость», предъявляемому к изобретениям, так как может быть осуществлено посредством применения стандартного оборудования и известных приемов.

Перечень последовательностей - Правило 13ter

SEQ ID NO: 1 gg cca aaa cat cta tat gta tcc 23

SEQ ID NO: 2 ga tat ctc ttt tac ctt ctg gtc 23

SEQ ID NO: 3 aac atc atg agt cca gta atg gg 23

SEQ ID NO: 4 gta cag tag gat tat cct ctg atc 24